糖尿病性的視網(wǎng)膜病，了解一下？不急，circRNA在捉妖！
糖尿病性視網(wǎng)膜病（DR）是工齡較長者失明的主要原因，血管周細(xì)胞變性是DR的主要臨床表現(xiàn)，但對(duì)周細(xì)胞變性的機(jī)制了解甚少。circRNA在多種生物學(xué)過程和疾病進(jìn)展中起重要作用，本文研究了circRNA在周細(xì)胞生物學(xué)和糖尿病引起的視網(wǎng)膜血管功能障礙中的作用。
主要結(jié)果如下：
1、在周細(xì)胞中鑒定發(fā)現(xiàn)cZNF532是一種高糖調(diào)節(jié)的circRNA
以正常血糖（NG）濃度，NG加滲流控制對(duì)照（OS），和高血糖（HG）濃度的三個(gè)血糖水平的人類視網(wǎng)膜周細(xì)胞為材料進(jìn)行測(cè)序。在HG和NG組間共鑒定到1523個(gè)差異表達(dá)circRNAs（625個(gè)上調(diào)，898個(gè)下調(diào)），在HG和OS組間共鑒定到792個(gè)差異表達(dá)circRNAs（386個(gè)上調(diào)，406個(gè)下調(diào)）。任意挑選出5個(gè)上調(diào)和5個(gè)下調(diào)的差異表達(dá)circRNAs進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，circ_0047814是最顯著上調(diào)的circRNA，其宿主基因?yàn)閆NF532，因而將其命名為cZNF532。Sanger測(cè)序證實(shí)，cZNF532在視網(wǎng)膜周細(xì)胞中構(gòu)成性表達(dá)，不可被RNase R 消化，且主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)（圖1A-C）。
進(jìn)一步研究，體內(nèi)體外糖尿病應(yīng)激是否影響cZNF532在周細(xì)胞中的表達(dá)。如圖1D所示，在小鼠體內(nèi)，與非糖尿病對(duì)照組相比，cZNF532在糖尿病血管中的表達(dá)明顯上調(diào)，且隨著糖尿病病程時(shí)間延長差距逐漸增大。與正常血糖組相比，cZNF532在HG組的人視網(wǎng)膜周細(xì)胞中高表達(dá)，類似的，在H2O2或炎癥刺激下，cZNF532在人視網(wǎng)膜周細(xì)胞中高表達(dá)；與此相反，cZNF532在人視網(wǎng)膜血管上皮細(xì)胞（HRVECs）中的表達(dá)則不受高血糖、H2O2或炎癥刺激的影響（圖1E-H）。總之，cZNF532表達(dá)響應(yīng)周細(xì)胞中血糖含量的變化。
圖1 在周細(xì)胞中鑒定發(fā)現(xiàn)cZNF532是一種高糖調(diào)節(jié)的circRNA
2、在體外cZNF532調(diào)節(jié)周細(xì)胞功能
鑒定cZNF532是否在體內(nèi)調(diào)控周細(xì)胞的功能，使用cZNF532 siRNA1干擾cZNF532的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，周細(xì)胞外膜細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)也隨之降低，包括血小板衍生生長因子受體(PDGFR) –β，α-SMA，肌腱線蛋白和NG2（圖2A）；并且周細(xì)胞向HRVECs的補(bǔ)充也下降了（圖2B）；但增加了周細(xì)胞中大分子的通透性（圖2C）。然后進(jìn)一步確定異常的周細(xì)胞分化和補(bǔ)充是否與細(xì)胞活力或增殖的改變有關(guān)。結(jié)果顯示，沉默cZNF532后，周細(xì)胞活力和增殖均下降；而S期細(xì)胞的數(shù)量下降了3倍，G1期的細(xì)胞數(shù)量則增加了約30%；此外，還導(dǎo)致高血糖或氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡水平加劇（圖2D-H）?？傊?，實(shí)驗(yàn)證實(shí)， cZNF532可在體外調(diào)節(jié)周細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，細(xì)胞活力和增殖。
圖2 cZNF532在體外調(diào)節(jié)周細(xì)胞功能
3、cZNF532在體內(nèi)調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜周細(xì)胞功能和血管完整性
采用IB4和NG2免疫熒光染色法檢測(cè)視網(wǎng)膜血管中周細(xì)胞覆蓋率。如圖3所示，糖尿病模型構(gòu)建1個(gè)月時(shí)，沉默cZNF532或糖尿病本身均對(duì)周細(xì)胞覆蓋率沒有影響，而糖尿病和cZNF532沉默結(jié)合作用時(shí)或下調(diào)周細(xì)胞覆蓋率；在2/4/6月時(shí)，沉默cZNF532或糖尿病本身均會(huì)導(dǎo)致周細(xì)胞覆蓋率下降，兩者結(jié)合作用時(shí)下調(diào)比率更大(圖3A-B)。此外，還發(fā)現(xiàn)，cZNF532沉默和糖尿病兩個(gè)實(shí)驗(yàn)因素協(xié)同作用會(huì)加重糖尿病誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜血管滲漏，這與cZNF532改變周細(xì)胞覆蓋率的結(jié)果相似(圖3C-D)。
圖3 cZNF532在體內(nèi)調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜周細(xì)胞功能和血管完整性
4、在活體條件下，細(xì)胞內(nèi)cZNF532基因的下調(diào)會(huì)誘發(fā)視網(wǎng)膜血管功能障礙
IB4和NG2染色顯示，與非糖尿病Cre組(Cre)或糖尿病Cre組(DR)相比，1/2/4/6個(gè)月時(shí)，周細(xì)胞特異性敲低cZNF532 (DR+cZNF532 shRNA)降低了視網(wǎng)膜血管周細(xì)胞覆蓋率(圖4A-B)。此外，Evans blue檢測(cè)顯示，與Cre組或DR組相比，周細(xì)胞特異性敲低cZNF532 (DR+cZNF532 shRNA)進(jìn)一步加重了視網(wǎng)膜血管滲漏(圖4C-D)。上述結(jié)果表明，特異性下調(diào)cZNF532的表達(dá)可誘導(dǎo)視網(wǎng)膜血管功能障礙。
圖4 在活體條件下，細(xì)胞內(nèi)cZNF532基因的下調(diào)會(huì)誘發(fā)視網(wǎng)膜血管功能障礙
5、在體外cZNF532作為miRNA海綿調(diào)控周細(xì)胞功能
由于cZNF532主要在周細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，因而推測(cè)cZNF532通過作為miRNA海綿在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控周細(xì)胞的功能。使用熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)cZNF532與預(yù)測(cè)的有結(jié)合位點(diǎn)的miRNA之間的關(guān)系，結(jié)果顯示miR-29a-3p、miR-498和miR-758轉(zhuǎn)染降低了LUC-cZNF532細(xì)胞的熒光素酶活性，而對(duì)LUC-cZNF532突變的熒光素酶活性沒有影響（圖5A-B）。隨后檢測(cè)cZNF532、miR-29a-3p、miR-498和miR-758在周細(xì)胞和小鼠視網(wǎng)膜中的相對(duì)表達(dá)豐度，與miR-498和miR-758相比，cZNF532和miR-29a-3p的表達(dá)豐度較高（圖5C-D）。因此，后續(xù)主要研究miR-29a-3p在周細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果顯示，在周細(xì)胞胞質(zhì)中，cZNF532和miR-29a-3p的存在共表達(dá) ，且cZNF532與miR-29a-3p有三個(gè)潛在結(jié)合位點(diǎn)；熒光素酶等實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)cZNF532充當(dāng)了miR-29a-3p的海綿，并通過將miR-29a-3p從它的目標(biāo)基因隔離而削弱了miR-29a-3p活性（圖5E-I）。不僅如此，作者通過實(shí)驗(yàn)證明，過表達(dá)cZNF532不僅可以顛倒miR-29a-3p對(duì)周細(xì)胞活力和增殖的影響，還可以緩解周細(xì)胞因miR-29a-3p介導(dǎo)的促凋亡作用。
圖5 在體外cZNF532作為miRNA海綿調(diào)控周細(xì)胞功能
6、cZNF532-miR-29a-3p-NG2/LOXL2/CDK2網(wǎng)絡(luò)在體內(nèi)調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜周細(xì)胞功能和血管完整性
然后在體內(nèi)研究了miR-29a-3p在視網(wǎng)膜血管功能障礙中的作用。miR-29a-3p agomir或cZNF532沉默導(dǎo)致NG2，LOXL2和CDK2表達(dá)增加。miR-29a-3p agomir可以模擬cZNF532沉默對(duì)視網(wǎng)膜血管功能障礙的影響，如圖6所示，在糖尿病性視網(wǎng)膜中，注射miR-29a-3p agomir會(huì)降低周細(xì)胞覆蓋率，加劇血管滲漏，并增加微動(dòng)脈瘤，無細(xì)胞毛細(xì)血管和周細(xì)胞重影。
圖6 在體內(nèi)cZNF532-miR-29a-3p-NG2/LOXL2/CDK2信號(hào)通路調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜周細(xì)胞功能和血管完整性
7、cZNF532/miR-29a-3p/NG2、LOXL2和CDK2信號(hào)通路在視網(wǎng)膜血管功能障礙中的臨床意義
收集36例眼部玻璃體樣本，分成4類，非糖尿病對(duì)照樣本(Ctrl，n=8)，無增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變(PDR)的糖尿病黃斑水腫(DME) (n=12)，有PDR的DME (n=12)，虹膜新生血管(NVI)，代表DR最嚴(yán)重(n=4)。qRT-PCR顯示，在患有DME，PDR或NVI的患者玻璃體中，cZNF532的表達(dá)上調(diào)，并且其表達(dá)與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)（圖7A）。相比之下，在四類患者中，玻璃體患者的miR-29a-3p表達(dá)沒有改變（圖7B）。 此外，與非糖尿病對(duì)照相比，DME，PDR或NVI患者玻璃體中NG2，LOXL2或CDK2的濃度上調(diào)。將周細(xì)胞與來自PDR患者的玻璃體一起溫育，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過cZNF532過表達(dá)或miR-29a-3p抑制誘導(dǎo)cZNF532介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，可以保護(hù)周細(xì)胞免受糖尿病性玻璃體誘導(dǎo)的周細(xì)胞凋亡的影響（圖7C-D）。此外，共注射cZNF532過表達(dá)載體或miR-29a-3p antagomir可降低糖尿病玻璃體對(duì)視網(wǎng)膜血管通透性的影響，這類似于抗VEGF對(duì)視網(wǎng)膜血管通透性的影響（圖7E）。cZNF532過表達(dá)或miR-29a-3p抑制作用可降低糖尿病性玻璃體誘導(dǎo)的周細(xì)胞變性（圖7F）。
圖7 cZNF532/miR-29a-3p/NG2、LOXL2和CDK2信號(hào)通路在視網(wǎng)膜血管功能障礙中的臨床意義
總之，如圖8所示，這項(xiàng)研究中表明在糖尿病應(yīng)激下的周細(xì)胞中，糖尿病鼠模型的視網(wǎng)膜血管中以及糖尿病患者的玻璃體液中，cZNF532的表達(dá)上調(diào)。 cZNF532通過充當(dāng)miR-29a-3p海綿并誘導(dǎo)NG2，LOXL2和CDK2的表達(dá)增加來調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜周細(xì)胞變性和血管功能障礙。cZNF532過表達(dá)或miR-29a-3p抑制可防止糖尿病引起的視網(wǎng)膜周細(xì)胞變性和血管功能障礙。
圖8 cZNF532在視網(wǎng)膜血管功能障礙中的作用及機(jī)制
此外，作者表明不能排除cZNF532在體內(nèi)通過靶向內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜血管功能的可能性。雖然cZNF532調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜周細(xì)胞變性和血管功能障礙的結(jié)果令人鼓舞，但需承認(rèn)，仍需要通過改進(jìn)條件circRNA敲除技術(shù)，進(jìn)一步的來明確cZNF532在DR中的確切作用。
參考文獻(xiàn)：
Jiang Qin., Liu Chang., Li Chaopeng., Xu Shanshan., Yao Mudi., Ge Huimin., Sun Yanan., Li Xiumiao., Zhang Shujie., Shan Kun., Liu Baihui., Yao Jin., Zhao Chen., Yan Biao.(2020). Circular RNA-ZNF532 regulates diabetes-induced retinal pericyte degeneration and vascular dysfunction. J. Clin. Invest., undefined(undefined), undefined. doi:10.1172/JCI123353