外泌體是如何作為納米治療劑的?

    該研究是2019年8月發(fā)表于Theranostics的文章‘Mesenchymal stem cell-derived exosomes as a nanotherapeutic agent for amelioration of inflammation-induced astrocyte alterations in mice’(IF=8.063)。間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體在治療癲癇、中風(fēng)或創(chuàng)傷性腦損傷等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中具有強大的抗炎作用。雖然星形膠質(zhì)細(xì)胞被認(rèn)為是這些效應(yīng)的介質(zhì)，但對它們的作用仍知之甚少。為了解決這個問題，該實驗研究了骨髓MSC-Exo對炎癥誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞改變的治療作用和機制。
文章縮寫:
       間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體(MSC-Exo)
       脂多糖(LPS)
       細(xì)胞增殖標(biāo)記(ki67)
       一種反應(yīng)性星形膠質(zhì)增生標(biāo)記(GFAP)
       假手術(shù)(Sham)
       硒(SE)

一 、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)和外泌體(Exo)的特征

    根據(jù)流式細(xì)胞儀分析，Wharton’s Jelly組織的酶消化獲得的MSC的CD73，CD90和CD105呈陽性，而造血譜系標(biāo)記(如CD34和CD45)呈陰性，且顯示出分化為脂肪細(xì)胞，骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞譜系的潛力。通過一系列超速離心產(chǎn)生的MSC-Exo，對經(jīng)典的外泌體標(biāo)記物呈陽性(圖1A)。當(dāng)通過TEM和納米粒子跟蹤分析檢查MSC-Exo的形態(tài)和粒徑時，結(jié)果顯示出MSC外泌體的經(jīng)典“杯狀邊緣”形態(tài)(圖1B)，并且絕大多數(shù)源自MSC的外泌體具有預(yù)期直徑為30至150 nm(圖1C)。結(jié)果表明，實驗中MSC-Exo的特征符合外泌體的典型標(biāo)準(zhǔn)。

二、星形膠質(zhì)細(xì)胞的特征及骨髓MSC-Exo摻入

    GFAP/Iba1雙重免疫染色檢查培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的組成(圖1D)。 92.16％的細(xì)胞表達(dá)了GFAP，只有2.99％的細(xì)胞顯示了Iba1+免疫染色(圖1E)。為了在體外和體內(nèi)追蹤MSC-Exo，星形膠質(zhì)細(xì)胞和SE模型的原代培養(yǎng)接受了CM-A594標(biāo)記的外泌體，并通過GFAP(圖1F)或s100-β(圖1G)檢查了細(xì)胞或組織樣品染色。紅色的MSC-Exo納米顆粒似乎呈較小的簇狀，在星形膠質(zhì)細(xì)胞的整個原代培養(yǎng)物中(圖1F1)以及在小鼠的海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞中觀察到(圖1G1)。在細(xì)胞樣本和海馬中，外泌體攝取的熒光強度分別為0.9885±0.1844和0.2812±0.03721。結(jié)果表明，MSC-Exo可以在體外和體內(nèi)摻入海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞。

圖1.MSC-Exo和星形膠質(zhì)細(xì)胞表征，納米粒子追蹤。

三、骨髓MSC-Exo治療可減輕脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性、反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生和炎癥反應(yīng)在體內(nèi)

    免疫熒光實驗(圖2A-L)表明，與LPS組相比，MSC-Exo處理極顯著降低了GFAP(一種反應(yīng)性星形膠質(zhì)增生標(biāo)記)的相對表達(dá)(圖2M)，C3(A1星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記，圖2N)，CD81(星形細(xì)胞活化的基本調(diào)節(jié)劑，圖2O)和ki67(細(xì)胞增殖標(biāo)記，圖2P)。 WB(圖2Q)顯示LPS+GFAP(圖2R)，C3(圖2S)和CD81(圖2T)的蛋白表達(dá)顯著降低MSC-Exo組與LPS組相比。使用ELISA來檢查MSC-Exo對LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的抗炎反應(yīng)。與LPS組相比，MSC-Exo處理顯著減弱了培養(yǎng)基中TNFα(圖2U)和IL-1β(圖2V)的分泌，但并未減弱IL-6(圖2W)。這些結(jié)果表明，MSC-Exo可以顯著降低LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性，反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生和炎癥反應(yīng)。

圖2.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞-Exo對LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞活化和炎癥反應(yīng)的保護作用在體內(nèi)。

四 、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體(MSC-Exo)處理改善脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)中異常鈣信號和線粒體功能障礙

    使用鈣成像研究星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)中鈣信號的改變。星形膠質(zhì)細(xì)胞在各個組中具有不同的熒光特性(圖3A-D)。在ATP刺激后，第一階段Ca2+響應(yīng)，一個尖峰代表一個瞬時的大幅度增加的細(xì)胞內(nèi)Ca2+組成，第二階段的響應(yīng)，即對照組中的細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度緩慢下降(圖3E)，Control+MSC-Exo(圖3F)，LPS(圖3G)和LPS+ MSC-Exo(圖3H)組。統(tǒng)計分析表明，與對照組相比LPS組在添加ATP后具有更高的細(xì)胞內(nèi)Ca2+振蕩幅度(ΔF/ F)，而在Control+MSC-Exo組中未檢測到這種變化(圖3I)。 MSC-Exo與LPS組相比，治療(LPS+MSC-Exo)極顯著減少了Ca2+內(nèi)流(圖3I)。與對照組相比，LPS刺激導(dǎo)致響應(yīng)時間極顯著上升(圖3J)和衰減時間的變化顯著更快(圖3K)。在Control+MSC-Exo組中無變化(圖3J，圖3K)。MSC-Exo逆轉(zhuǎn)了LPS組中觀察到的Ca2+振蕩速率(圖3J和K)。由于線粒體通透性對于炎癥誘導(dǎo)的星形細(xì)胞活化至關(guān)重要，因此使用線粒體特異性親脂性陽離子熒光染料JC-1進一步檢查了原代培養(yǎng)中星形膠質(zhì)細(xì)胞的MMP(圖3L-O)。統(tǒng)計分析表明，LPS組的JC-1比率顯著降低(圖3P)，而通過MSC-Exo給藥可以逆轉(zhuǎn)(圖3P)。在Control組和Control+ MSC-Exo組之間無顯著差異(圖3P)?？傊琈SC-Exo可改善海馬星狀細(xì)胞原代培養(yǎng)物中LPS誘導(dǎo)的異常鈣信號傳導(dǎo)和線粒體功能障礙。

圖3.骨髓MSC-Exo治療改善LPS誘導(dǎo)的海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)中異常鈣信號和線粒體功能障礙。

五、sgRNA敲除Nrf2降低骨髓MSC-Exo對星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的抑制作用在體內(nèi)

    免疫印跡和免疫熒光用于探討Nrf2-NF-κB信號通路是否參與了星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的抑制。Western印跡法顯示LPS極顯著增加了抗氧化劑(Nrf2，Keap1，HO-1)和炎癥性蛋白(p-P65/P-65，NF-κB激活和炎癥標(biāo)記)的表達(dá)(圖4A)，而MSC-Exo治療逆轉(zhuǎn)了這些變化(圖4D-G)。此外，control+ MSC-Exo組的NF-κB活化極顯著降低(圖4E)。免疫熒光進一步檢查抗氧化劑和炎性因子的核易位，對培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中的LPS刺激，MSC-Exo處理抑制Nrf2和P-65的核易位(圖4B，C)。
    為了確定通過MSC-Exo抑制LPS誘導(dǎo)的星形細(xì)胞活化的機制，用sgRNA敲除原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中的Nrf2基因。 Western印跡法(圖4H)顯示敲低Nrf2(圖4J)顯著降低NF-κB(圖4K)，Keap1(圖4L)和HO-1(圖4M)。與sgRNA組相比，LPS刺激極顯著上調(diào)了Nrf2，NF-κB和HO-1的表達(dá)(圖4J，K)，但與sgRNA組相比，并沒有改變Keap1的表達(dá)(圖4L)。在LPS誘導(dǎo)的Nrf2敲低星形膠質(zhì)細(xì)胞中，與sgRNA + LPS組相比，MSC-Exo的給藥未影響氧化(Nrf2，Keap1和HO-1)和炎癥(p-P65/P-65和GFAP)的標(biāo)志物(圖4I-M)。這些數(shù)據(jù)表明，通過MSC-Exo處理可預(yù)防LPS誘導(dǎo)的星形細(xì)胞活化，NF-κB-Nrf2信號通路起著決定性作用。

圖4.Nfr2的sgRNA敲除降低了骨髓MSC-Exo對星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的抑制作用在體內(nèi)。

六、側(cè)腦室注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體（MSC-Exo）可減輕小鼠海馬反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生

    蛋白質(zhì)印跡法使用毛果蕓香堿誘導(dǎo)的SE模型檢查MSC-Exo的抗反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，這是海馬中強烈的反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生的特征。從假手術(shù)(Sham)，Sham + Exo，SE + PBS和SE + Exo實驗組中收集海馬組織(圖5Q)。注射PBS的小鼠在術(shù)后24、4 d和8 w時C3(圖5R)，CD81(圖5S)和GFAP(圖5T)的表達(dá)極顯著增加。MSC-Exo處理在SE后4 d和8 w顯著降低了標(biāo)志物的表達(dá)(圖5R-T)，但在SE后24 h卻沒有降低(圖5R-T)。SE后4天，使用免疫組織化學(xué)進一步檢查了MSC-Exo對反應(yīng)性星形膠質(zhì)增生的假定治療作用(圖5A-L)。熒光強度分析顯示，SE + Exo組中GFAP，CD81，C3和ki67的相對表達(dá)顯著降低(圖5M-P)與SE + PBS組相比(P <0.01)，沒有觀察到MSC-Exo對假手術(shù)組動物的不利影響(圖5M-P和R-T)。數(shù)據(jù)顯示，在SE小鼠模型腦室內(nèi)注射MSC-Exo可以減少海馬反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生。

圖5.側(cè)腦室注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可減輕硒誘導(dǎo)的小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞活化。

七、骨髓MSC-Exo減輕硒(SE)誘導(dǎo)的小鼠海馬炎癥反應(yīng)

    為明確MSC-Exo在SE模型中的抗炎作用，SE后4天收集了雙側(cè)海馬組織，并進行了免疫組化、ELISA和qPCR檢測。結(jié)果顯示，除了星形膠質(zhì)細(xì)胞外，小膠質(zhì)細(xì)胞還可以分泌炎性細(xì)胞因子如TNFα，IL-1β和IL-6（圖6A-L）。雙重免疫染色結(jié)果顯示，GFAP與TNFα和IL-1β共表達(dá)(圖6A-D)，毛果蕓香堿注射后TNFα和IL-1β的熒光強度顯著增加(圖6E-F )，而MSC-Exo處理與SE + PBS組相比降低了它們的表達(dá)水平(圖6E-F)。在海馬促炎細(xì)胞因子TNFα(圖6G)和IL-1β(圖6H)的濃度下顯著增加，但IL-6顯示增加相比于假手術(shù)組(圖5I)。與SE+PBS組相比，MSC-Exo處理顯著降低了促炎細(xì)胞因子TNFα(圖6G)和IL-1β(圖6H)的產(chǎn)生。qPCR檢測在海馬中的TNFα，IL-1β和IL-6(圖6J-L)基因表達(dá)，結(jié)果與假手術(shù)組比，毛果蕓香堿治療可極顯著提高海馬TNFα和IL-1β基因的表達(dá)(圖6J，K)，而MSC-Exo給藥與假手術(shù)組相比顯著降低TNFα和IL-1βRNA的水平。 SE +PBS組(圖6J，K)。在qPCR測定的IL-6表達(dá)中，假手術(shù)和Sham + Exo組之間無差異，這與ELISA結(jié)果一致(圖6I，L)。這些數(shù)據(jù)表明，MSC-Exo可以減輕SE誘導(dǎo)的小鼠海馬炎癥反應(yīng)。

圖6.骨髓MSC-Exo注射減輕了硒誘導(dǎo)的海馬炎癥反應(yīng)。

八、MSC-Exo處理可通過Nrf2-NF-κB信號傳導(dǎo)通路恢復(fù)SE誘導(dǎo)的海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞活化

    為了研究Nrf2-NF-κB信號通路是否參與星形膠質(zhì)細(xì)胞激活的抑制，免疫印跡和免疫組化用來檢測硒誘導(dǎo)后4 d的海馬組織。毛果蕓香堿處理可顯著增加海馬中GFAP，Nrf2，p-P65/P-65和HO-1的表達(dá)，但會降低Keap1的表達(dá)(圖7D-E)，促進了SE小鼠中Nrf2(圖7B)和P-65(圖7C)的核易位。MSC-Exo處理(SE + Exo組)與PBS(SE + PBS組)的比較顯示，MSC-Exo可以逆轉(zhuǎn)氧化(圖7B，E和F)和炎癥表型(圖7C，G和H)。無顯著差異Sham+ Exo和假手術(shù)組表明，單獨進行MSC-Exo處理不會改變與這些表型相關(guān)的標(biāo)志物的表達(dá)(圖7D-H)。
    為探索體內(nèi)抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的Nrf2-NF-κB信號通路的機制，使用了Nrf2抑制劑ML385。蛋白質(zhì)測定法顯示，用ML385處理的小鼠的Keap1，HO-1，Nrf2和p-P65/P-65表達(dá)顯著降低(圖7D-H)。盡管這些標(biāo)記在SE誘導(dǎo)后被極顯著上調(diào)(圖7D-F和H)，但ML385 + SE + PBS和ML385 + SE + Exo組之間未觀察到顯著差異(圖7D-F和H)。此外，與Sham或Vehicle組相比，Nrf2抑制導(dǎo)致GFAP表達(dá)增加(圖7G)，而用MSC-Exo處理的ML385 + SE + Exo組則不存在表達(dá)差異(圖7G)。結(jié)果表明，MSC-Exo處理可以通過Nrf2-NF-κB信號通路恢復(fù)LPS和SE誘導(dǎo)的小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞活化。

圖7.ML385 (Nrf2抑制劑)注射逆轉(zhuǎn)骨髓MSC-Exo對海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的抑制作用體內(nèi)。

九、MSC-Exo治療可恢復(fù)SE誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)和記憶障礙

   莫里斯水迷宮實驗進行了SE誘導(dǎo)的行為效應(yīng)分析。重復(fù)測量的方差分析顯示各組之間的第一次學(xué)習(xí)時間無差異。在隱藏平臺任務(wù)中，與假手術(shù)組相比，SE小鼠的逃避潛伏期顯著減少 (圖8A)。給予MSC-Exo可逆轉(zhuǎn)這種趨勢(圖8A)。24h后，通過記錄在目標(biāo)象限中花費的時間并計算平臺穿越次數(shù)來測試每組中的檢索差異。與假手術(shù)組相比，SE小鼠在目標(biāo)象限(PT)和平臺交叉點中的總游泳距離明顯降低(圖8B和C)。 SE+Exo組的學(xué)習(xí)和記憶障礙的顯著減少表現(xiàn)為與目標(biāo)象限(圖8B)和平臺交叉點(圖8C)相比，SE+PBS組花費的時間百分比增加了，兩組之間的游泳速度沒有差異(圖8D)。

                                        圖8.骨髓MSC-Exo治療改善了硒誘導(dǎo)的小鼠學(xué)習(xí)和記憶障礙。
結(jié) 論:
    骨髓MSC-Exo改善炎癥誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞改變，并且Nrf2-NF-κB信號通路參與調(diào)節(jié)小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化。這些數(shù)據(jù)表明，骨髓MSC-Exo作為納米治療劑在治療海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞改變的神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面具有很大的潛力。