CircTLK1，腎細(xì)胞癌新的預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)？

    circRNA主要存在于細(xì)胞質(zhì)或外泌體中，具有組織特異性、疾病特異性、時(shí)序特異性及高穩(wěn)定性等特征。大量研究表明circRNA通過調(diào)控細(xì)胞生長、分化、遷移、侵襲以及調(diào)亡等多種生物學(xué)過程參與了癌癥的發(fā)展，并預(yù)測了其在疾病診斷和治療標(biāo)志物等方面的應(yīng)用前景。目前對circRNA的生物學(xué)功能和調(diào)控機(jī)制還知之甚少。近期北京大學(xué)深圳醫(yī)院泌尿研究所的桂耀庭團(tuán)隊(duì)描述circTLK1在腎癌細(xì)胞（RCC）中的表達(dá)特征，并分析和闡述了其與miR-136-5p/CBX4的ceRNA調(diào)控機(jī)制如何影響RCC細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲以及轉(zhuǎn)移的。該研究表明circTLK1可能成為RCC的預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。相關(guān)研究結(jié)果以“CircTLK1 promotes the proliferation and metastasis of renal cell carcinoma by sponging miR-136-5p”為題發(fā)表在Molecular Cancer雜志上，雜志影響因子15.302。
背 景：
    大量研究證明circRNA是腫瘤發(fā)生和進(jìn)展的可能生物標(biāo)記物和重要的調(diào)控因子。然而circRNA在RCC中的作用很大程度上仍然是未知的。
材 料：
    RCC組織和正常腎組織，人RCC細(xì)胞系，人腎上皮細(xì)胞細(xì)胞系，小鼠動物模型。
方 法：
    circRNA-seq，shRNA，RNase R實(shí)驗(yàn)，CCK-8 assay，colony-formation assay，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)， transwell，F(xiàn)ISH，RNA pull-down，熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，WB，免疫熒光，免疫組化。
結(jié) 果：
    發(fā)現(xiàn)circTLK1在RCC中表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后呈正相關(guān)。circTLK1沉默可顯著抑制RCC在體內(nèi)外的增殖、遷移和侵襲。circTLK1主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，作為miR-136-5p的海綿正向調(diào)控CBX4表達(dá)。CBX4過表達(dá)能逆轉(zhuǎn)circTLK1沉默誘導(dǎo)的RCC細(xì)胞表型抑制。因此，circTLK1通過作為miR-136-5p的海綿調(diào)控CBX4表達(dá)的方式在RCC發(fā)展中起重要作用。
研究思路：

1.篩選和鑒定RCC中高表達(dá)的circRNA
    circRNA已被證明在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中有重要作用。作者通過RNA-seq篩選了在RCC細(xì)胞中與正常腎上皮組織細(xì)胞高度差異表達(dá)的circRNA（a）。通過生信分析和qPCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)circTLK1在RCC細(xì)胞中上調(diào)最明顯，在RCC組織和術(shù)后轉(zhuǎn)移的RCC病人中高表達(dá)，并與RCC患者總生存率和無進(jìn)展生存率呈負(fù)相關(guān)（b-e）。Sanger鑒定和RNase R實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了circTLK1的環(huán)狀結(jié)構(gòu)（g,i）。

2.circTLK1敲除抑制RCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲
    確定circTLK1的表達(dá)特征和結(jié)構(gòu)后，接下來探究circTLK1在RCC細(xì)胞中的具體作用。利用ShRNA抑制circTLK1在RCC細(xì)胞系中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)并不改變TLK1的表達(dá)（a-c）；CCK8和克隆形成實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證RCC細(xì)胞的增殖受到抑制（d-f）。

    利用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell發(fā)現(xiàn)在circTLK1敲除后，RCC細(xì)胞的遷移和侵襲受到抑制（a-d）。說明circTLK1參與RCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲過程。

3.circTLK1的海綿基因鑒定
    細(xì)胞定位決定基因的功能方向，利用FISH和核質(zhì)分離PCR確定circTLK1定位于細(xì)胞質(zhì)（a-b），推測它可能是作為miRNA的海綿發(fā)揮功能。通過生物信息學(xué)分析篩選5個(gè)可能結(jié)合的miRNA，利用RNA pull-down和熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)確定與circTLK1結(jié)合的miRNA是miR-136-5p（c-f），且敲除和過表達(dá)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證circTLK1和miR-136-5p互不改變彼此的表達(dá)（f-j），說明circTLK1對miR-136-5p具有海綿的作用。

4.miR-136-5p的下游靶基因CBX4的鑒定以及CBX4對RCC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響
    通過生物信息學(xué)篩選了miR-136-5p可能的靶基因（a），其中CBX4的表達(dá)與miR-136-5p呈負(fù)相關(guān)（b）。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證與miR-136-5p結(jié)合的是CBX4 （c-d），且miR-136-5p過表達(dá)抑制CBX4的表達(dá)（e-g）。此外，CBX4在RCC組織中表達(dá)是上調(diào)的，并與腫瘤大小、術(shù)后轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，與RCC患者總生存率呈負(fù)相關(guān)（h-k）。

    敲除CBX4（a），通過CCK-8、克隆形成、細(xì)胞劃痕、transwell等實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了CBX4沉默抑制了RCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲（b-i），同時(shí)發(fā)現(xiàn)CBX4的敲除抑制VEGFA的表達(dá)（j-K）。說明CBX4是miR-136-5p的靶基因，并參與調(diào)控RCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲過程。

5.過表達(dá)CBX4可逆轉(zhuǎn)circTLK1沉默導(dǎo)致的細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移抑制的影響
    為了研究CBX4與circTLK1的相互作用，作者敲除circTLK1，WB檢測發(fā)現(xiàn)CBX4的表達(dá)顯著性被抑制（a,b），過表達(dá)CBX4，發(fā)現(xiàn)其可以逆轉(zhuǎn)circTLK1沉默誘導(dǎo)的RCC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲抑制作用（c-K）。證明circTLK1/miR-136-5p/CBX4之間存在ceRNA調(diào)控機(jī)制，該機(jī)制參與調(diào)控RCC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲過程。

6.circTLK1敲除抑制小鼠模型中RCC細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移
    為了探究circTLK1在體內(nèi)對RCC細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的作用，構(gòu)建了shcircTLK1和shNC異種移植腫瘤和肺轉(zhuǎn)移小鼠模型。研究發(fā)現(xiàn)，circTLK1敲除顯著性減少腫瘤的體積和重量（a-c），同時(shí)抑制了CBX4和VEGFA的表達(dá)（d-e）。肺轉(zhuǎn)移模型中，circTLK1沉默顯著減弱了肺部腫瘤轉(zhuǎn)移（f-h）。同時(shí)，在腫瘤模型中過表達(dá)CBX4可以逆轉(zhuǎn)circTLK1沉默誘導(dǎo)的RCC細(xì)胞生長抑制（i）。證明circTLK1/miR-136-5p/CBX4/VEGFA調(diào)控機(jī)制可能在促進(jìn)體內(nèi)RCC細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移過程中有重要的作用。

7. circTLK1/miR-136-5p/CBX4/VEGFA調(diào)控機(jī)制圖

參考文獻(xiàn)：
    Jianfa Li, Chenchen Huang, Yifan Zou et al. CircTLK1 promotes the proliferation and metastasis of renal cell carcinoma by sponging miR-136-5p. Mol Cancer. 2020; 19(103).