N7-甲基鳥(niǎo)苷tRNA修飾通過(guò)RPTOR/ULK1/自噬軸促進(jìn)食管鱗狀細胞癌腫瘤發(fā)生

欄目:最新研究動(dòng)態(tài) 發(fā)布時(shí)間:2024-06-06
研究報告說(shuō),METTL1介導的N7-甲基鳥(niǎo)苷tRNA修飾調節了自噬途徑的mTOR和負調節因子中蛋白質(zhì)的翻譯,導致食管鱗狀細胞癌的進(jìn)展......

 

       N7 -甲基鳥(niǎo)苷(m7G)是一種最常見(jiàn)的RNA表觀(guān)修飾,常位于真核生物mRNA的5’帽和內部位置,或所有物種的rRNA和tRNA內部。m7G修飾通過(guò)影響各種RNA分子的代謝,包括mRNA、tRNA、microRNA和核糖體RNA。越來(lái)越多的證據表明,m7G在人類(lèi)疾病的發(fā)展中發(fā)揮著(zhù)關(guān)鍵作用。目前m7G中標的項目越來(lái)越多,但又不會(huì )像其他熱點(diǎn)一樣被研究的很泛濫,因此不失為基金申請的好方向。下圖為22年部分m7G中標項目的題目: 

 

 

 

       METTL1介導的N7-甲基鳥(niǎo)苷tRNA修飾的失調可以促進(jìn)腫瘤發(fā)生。在這里,作者報告說(shuō),這種修飾調節了自噬途徑的mTOR和負調節因子中蛋白質(zhì)的翻譯,導致食管鱗狀細胞癌的進(jìn)展。

       在這項研究中作者證明METTL1和WDR4表達水平在ESCC中顯著(zhù)上調,并與ESCC不良預后相關(guān)。此外,METTL1和WDR4在體外和體內通過(guò)tRNA m7G甲基轉移酶活性促進(jìn)ESCC進(jìn)展。從機制上來(lái)講,從機制上講,METTL1或WDR4敲低可導致m7G修飾的tRNA表達減少,并減少在RPTOR/ULK1/自噬途徑中富集的致癌轉錄物的翻譯。我們的研究證明提供了tRNA的m7G修飾失調在ESCC中的致癌功能,并且提示靶向METTL1以及其下游信號軸可能是ESCC治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。該研究于22年5月發(fā)表于《Nature Communication》 IF:16.6

技術(shù)路線(xiàn)

 

 

 

1.METTL1/WDR4 在 ESCC 中上調,并與 ESCC 預后不良相關(guān)

       在ESCC病人樣本中檢查了METTL1 / WDR4的表達,數據顯示與鄰近正常組織相比,食管鱗狀細胞癌腫瘤組織的METTL1/WDR4 和 m7G修飾顯著(zhù)升高(圖1A和B)。此外,免疫組化(IHC)染色顯示,食管腫瘤組織中METTL1的表達高于鄰近正常組織(圖1C和D)。此外,METTL1的表達與高腫瘤分級和分期顯著(zhù)相關(guān) (1F-H)。接著(zhù)研究了METTL1表達與ESCC患者預后的關(guān)系,生存分析表明,METTL1高表達與較差的總生存期和無(wú)病生存狀態(tài)相關(guān)(圖1I和J)。同樣,WDR4在ESCC中也上調,并與ESCC患者的不良預后相關(guān)(圖1K和L)??偟膩?lái)說(shuō),數據顯示,METTL1和WDR4在ESCC中顯著(zhù)上調,并與ESCC進(jìn)展和預后不良相關(guān)。

 

 

 

2.敲低METTL1 在異種移植模型中抑制ESCC進(jìn)展

       ESCC中METTL1表達的升高,因此作者認為METTL1在ESCC進(jìn)展中起著(zhù)促進(jìn)的功能。為了驗證這一假設,首先在 KYSE150和KYSE30著(zhù)兩種ESCC 細胞中使用敲低METTL30, 發(fā)現敲低METTL1后能夠抑制K150和K30細胞增殖(圖2B)和集落形成能力(圖2C和D)的。此外,流式分析顯示,敲低METTL1能夠導致 ESCC 細胞凋亡水平增加(圖2E和F)。接著(zhù)利用異種移植小鼠模型探討了METTL1在體內ESCC進(jìn)展中的作用,與對照組相比,敲低METTL1組小鼠腫瘤生長(cháng)明顯減緩并且腫瘤大小和重量減?。▓D2G-I)。免疫組化結果顯示,敲低METTL1組的腫瘤中,Ki67水平下降,證明METTL1敲低后降低了ESCC在體內的增殖活性(圖2J和K)。綜上所述,研究揭示了METTL1在體外和體內ESCC進(jìn)展中的基本功能,即METTL1與ESCC發(fā)展呈現正相關(guān)。

 

 

 

3.METTL1在ESCC中調控m7G tRNA修飾、tRNA表達和mRNA翻譯

       為了研究METTL1在ESCC進(jìn)展中功能的分子機制,作者使用之前TRAC-seq 方法(tRNA還原和切割測序),利用METTL1缺失和對照ESCC細胞分析了總的tRNA m7G修飾水平。在TRACseq數據庫中鑒定了19個(gè)m7G修飾的tRNA,這些tRNA在可變環(huán)中具有“ABGWY”序列(圖3A)。METTL1缺失顯著(zhù)降低了tRNA的m7G修飾水平(圖3B和C)。RNA質(zhì)譜分析同樣也證實(shí)了METTL1敲除的細胞中tRNA m7G修飾水平的降低(圖3d)。此外,METTL1的缺失降低了大多數m7g修飾的trna的表達水平,而非m7g修飾的trna的表達幾乎沒(méi)有受到影響此外(圖3E和F)。與tracseq數據一致,m7G northwestern和northern實(shí)驗證實(shí),METTL1敲除細胞中m7G修飾水平降低,m7G修飾trna表達減少(圖3G)。此外,野生型METTL1而非其無(wú)催化活性的突變體的過(guò)表達增加了總m7G tRNA修飾水平和m7G修飾tRNA的表達,證明了METTL1通過(guò)其tRNA m7G甲基轉移酶活性調控tRNA修飾和表達(圖3H)。同樣,抑制WDR4導致m7G修飾水平降低,在K150和K30 ESCC細胞中,過(guò)表達WDR4增加了m7G tRNA修飾和m7G修飾的tRNA表達(圖3I和J)。這些數據均表明了METTL1/WDR4在調節tRNA m7G修飾和表達中的重要功能。

       tRNA在mRNA翻譯中起作用,我們接下來(lái)確定了METTL1對ESCC細胞mRNA翻譯的影響。多聚體分析顯示,METTL1敲低細胞的mRNA翻譯活性降低,多核糖體峰值降低(圖3K)。此外,嘌呤霉素攝入測定也證實(shí),METTL1敲低會(huì )降低ESCC細胞的mRNA翻譯活性(圖3L)。在METTL1缺失的細胞中,重新表達野生型METTL1而不是其突變體恢復了mRNA的翻譯效率,證明m7G的催化功能對METTL1促進(jìn)mRNA翻譯至關(guān)重要??偟膩?lái)說(shuō),我們的數據表明,mettl1介導的m7G tRNA修飾對ESCC中tRNA的表達和mRNA翻譯至關(guān)重要。

       為了研究m7G修飾異常而導致的翻譯異常所產(chǎn)生的影響,使用METTL1敲除和對照ESCC細胞進(jìn)行了多聚核糖體測序(圖3M)。為了研究mRNA翻譯與tRNA m7G修飾之間的聯(lián)系,計算了測序結果當中mRNA上的 m7G 修飾的 tRNA 所對應的密碼子的數量。結果顯示,mRNA上m7G修飾的 tRNA 所對應的密碼子越多,翻譯效率(Translation efficiencies, TE)也就越低。(圖3N)。Go分析和KEGG信號通路分析顯示TE-down mRNA在自噬生物學(xué)過(guò)程和mTOR信號通路中顯著(zhù)富集(圖3O和P)。值得注意的是,與其他檢測到的mrna相比,那些te降低、參與自噬生物學(xué)過(guò)程或mTOR信號通路的mRNA被m7G修飾的tRNA解碼的密碼子數量更多(圖3Q)。接下來(lái),我們確定了METTL1在調節自噬負調控基因和mTOR信號通路基因表達中的功能。我們的數據顯示,METTL1缺失降低了它們的蛋白質(zhì)表達,但對它們的mRNA影響很小(圖3R和S)。此外qPCR實(shí)驗進(jìn)一步證實(shí),在METTL1缺失的細胞中,編碼mTOR關(guān)鍵成分的RPTOR (mTOR復合物1的調控相關(guān)蛋白)的翻譯效率顯著(zhù)降低(圖3T)。因此,我們隨后測定了METTL1敲除細胞中pULK1和自噬標志物微管相關(guān)蛋白輕鏈3 LC3-II和LC3-I的水平。在氯喹(CQ)處理和未處理的K150和K30細胞中,METTL1缺失降低了pULK1水平,增加了LC3-II/LC3-I的比率(圖3U和V),表明METTL1敲除的ESCC細胞中自噬水平增加。這些數據表明,翻譯損傷發(fā)生在細胞死亡和自噬之前,表明METTL1敲低降低mRNA翻譯,從而導致ESCC細胞死亡和自噬。綜上所述,我們的數據表明,METTL1以m7G相關(guān)密碼子依賴(lài)的方式促進(jìn)mTOR信號相關(guān)基因的翻譯和自噬途徑的負調控。

 

 

4.在ESCC中,RPTOR是METTL1的重要下游靶點(diǎn)

       我們進(jìn)一步發(fā)現,在METTL1缺失的ESCC細胞中,重新表達RPTOR恢復了增殖和集落形成能力(圖4 A- D),此外,RPTOR過(guò)表達增加了ULK1磷酸化水平,降低了METTL1缺失細胞中LC3-II/LC3-I的比例,消除了ESCC細胞的自噬通量(圖4E-H)??偟膩?lái)說(shuō),這些數據揭示了RPTOR是METTL1的重要下游靶點(diǎn),并進(jìn)一步支持了METTL1介導的tRNA m7G修飾通過(guò)調控RPTOR促進(jìn)ESCC進(jìn)展。因為RPTOR可以在METTL1敲低的ESCC細胞中挽救ULK1的磷酸化水平并減少自噬,接下來(lái)在METTL1缺失的ESCC細胞中敲低ULK1,以確定METTL1和RPTOR是否通過(guò)調節ULK1介導的自噬來(lái)促進(jìn)ESCC的進(jìn)展(圖4I)。結果表明,抑制ULK1可以挽救METTL1缺失的ESCC細胞的生長(cháng)(圖4J),進(jìn)一步證明METTL1和RPTOR通過(guò)ULK1調節ESCC的進(jìn)展。此外,自噬通量檢測顯示,敲低ULK1可以消除METTL1缺失的ESCC細胞中增加的自噬通量(圖4K-M)??偟膩?lái)說(shuō),我們的數據揭示了RPTOR/自噬軸在介導METTL1在ESCC進(jìn)展中的功能中的重要作用。

 

 

 

5.敲除 METTL1抑制ESCC腫瘤發(fā)生

       為了在體內直接探索m7G tRNA修飾在ESCC腫瘤發(fā)生中的作用,構建組織特異性Mettl1敲除小鼠模型。在使用他莫昔芬誘導Mettl1敲除后,Mettl1敲除和對照小鼠分別使用DNA烷基化劑二乙基亞硝胺(DEN)和多激酶抑制劑索拉非尼(sorafenib)誘導ESCC發(fā)生腫瘤32(圖5A)。經(jīng)DEN處理8周,索拉非尼處理12周后,發(fā)現對照組小鼠食管發(fā)生了明顯的病理變化,而Mettl1敲除小鼠的病變面積和ESCC數量明顯減少(圖5A-E)。組織學(xué)分析顯示,Mettl1敲除小鼠腫瘤中METTL1和Ki67染色水平降低(圖5F和G)。我們還發(fā)現,Mettl1敲除降低了小鼠腫瘤中m7G tRNA修飾,降低了RPTOR蛋白水平(圖5H-J),這些數據支持METTL1和m7G tRNA修飾在體內調節RPTOR mRNA的翻譯和RPTOR下游靶點(diǎn)的活性。值得注意的是,敲除組腫瘤中LC3蛋白水平明顯高于對照組(圖5L和M),表明Mettl1敲除導致體內自噬增加??傊?,這些結果支持METTL1介導的m7G tRNA修飾在促進(jìn)ESCC體內腫瘤發(fā)生中的關(guān)鍵功能。

 

 

6.METTL1/WDR4介導的m7G tRNA修飾促進(jìn)ESCC進(jìn)展

       為了進(jìn)一步加強m7G tRNA修飾與ESCC進(jìn)展之間的功能聯(lián)系,我們進(jìn)行了功能獲得研究(圖6A)。我們的數據顯示,強制表達野生型METTL1而非其催化死突變體可以促進(jìn)ESCC細胞的生長(cháng)和集落形成(圖6B-E)。此外,過(guò)表達METTL1而非其突變體上調RPTOR蛋白表達,減少細胞凋亡和自噬(圖6F-I)??偟膩?lái)說(shuō),我們的數據顯示tRNA m7G的催化功能對于METTL1調節靶表達和ESCC進(jìn)展至關(guān)重要。然后,我們在ESCC細胞中過(guò)表達WDR4,以進(jìn)一步證實(shí)m7G tRNA修飾促進(jìn)ESCC進(jìn)展的結論。我們的數據顯示,過(guò)表達WDR4可以穩定METTL1蛋白的表達,并增加下游靶點(diǎn)RPTOR的表達(圖6J)。METTL1調節tRNA m7G修飾、tRNA表達和致癌mRNA翻譯。ESCC細胞生長(cháng)和集落形成(圖6K-M)。這些數據支持WDR4是促進(jìn)ESCC進(jìn)展的重要癌基因??傊?,我們的研究結果有力地支持了METTL1/WDR4介導的m7G tRNA修飾在ESCC進(jìn)展調控中的重要致癌功能。

 

 

 

7.METTL1促進(jìn)體內ESCC原位瘤的發(fā)生

       我們進(jìn)一步建立了METTL1條件敲除蛋白小鼠模型,并誘導ESCC腫瘤發(fā)生,探討METTL1在ESCC腫瘤發(fā)生中的作用。DEN/sorafenib治療18周后(圖7A), METTL1敲除小鼠的食道出現了大量的腫瘤,而對照組小鼠的食道只發(fā)生了少量和較小的病變(圖7B和C)。此外,敲除小鼠的異常增生和鱗狀細胞癌的數量明顯高于對照組(圖7D和F)。組織學(xué)分析顯示cKI小鼠腫瘤中METTL1表達水平較高增殖活性高于對照小鼠(圖7G和H)。我們進(jìn)一步發(fā)現,與對照小鼠相比,敲除小鼠腫瘤中m7G tRNA修飾和m7G修飾tRNA的表達升高(圖7I)。此外,在METTL1 cKI小鼠腫瘤中,RPTOR蛋白水平升高,而mRNA水平未見(jiàn)升高(圖7J-M)。綜上所述,這些結果揭示了METTL1m7G tRNA修飾促進(jìn)了ESCC在體內的腫瘤發(fā)生和發(fā)展。

 

 

 

結論

       總的來(lái)說(shuō)作者認為tRNA m7G修飾可以通過(guò)調控細胞自噬最終促進(jìn)ESCC的發(fā)生。METTL1可能是ESCC患者的一個(gè)有希望的治療靶點(diǎn)

 

實(shí)驗方法

免疫組化,免疫熒光染色,qRT-PCR ,Western blot,Northwestern blot,Northern blot,多核糖體分析,TRAC-seq,多核糖體測序,ribo-seq,自噬通量檢測,流式檢測凋亡細胞,克隆形成,細胞增殖,小鼠皮下成瘤,小鼠基因敲除

參考文獻

Han H, Yang C, Ma J, et al. N7-methylguanosine tRNA modification promotes esophageal squamous cell carcinoma tumorigenesis via the RPTOR/ULK1/autophagy axis. Nat Commun. 2022;13(1):1478. Published 2022 Mar 18.