N7-甲基鳥苷tRNA修飾通過RPTOR/ULK1/自噬軸促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌腫瘤發(fā)生

       N7 -甲基鳥苷(m7G)是一種最常見的RNA表觀修飾，常位于真核生物mRNA的5’帽和內(nèi)部位置，或所有物種的rRNA和tRNA內(nèi)部。m7G修飾通過影響各種RNA分子的代謝，包括mRNA、tRNA、microRNA和核糖體RNA。越來越多的證據(jù)表明，m7G在人類疾病的發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。目前m7G中標(biāo)的項(xiàng)目越來越多，但又不會像其他熱點(diǎn)一樣被研究的很泛濫，因此不失為基金申請的好方向。下圖為22年部分m7G中標(biāo)項(xiàng)目的題目： 

       METTL1介導(dǎo)的N7-甲基鳥苷tRNA修飾的失調(diào)可以促進(jìn)腫瘤發(fā)生。在這里，作者報(bào)告說，這種修飾調(diào)節(jié)了自噬途徑的mTOR和負(fù)調(diào)節(jié)因子中蛋白質(zhì)的翻譯，導(dǎo)致食管鱗狀細(xì)胞癌的進(jìn)展。

       在這項(xiàng)研究中作者證明METTL1和WDR4表達(dá)水平在ESCC中顯著上調(diào)，并與ESCC不良預(yù)后相關(guān)。此外，METTL1和WDR4在體外和體內(nèi)通過tRNA m7G甲基轉(zhuǎn)移酶活性促進(jìn)ESCC進(jìn)展。從機(jī)制上來講，從機(jī)制上講，METTL1或WDR4敲低可導(dǎo)致m7G修飾的tRNA表達(dá)減少，并減少在RPTOR/ULK1/自噬途徑中富集的致癌轉(zhuǎn)錄物的翻譯。我們的研究證明提供了tRNA的m7G修飾失調(diào)在ESCC中的致癌功能，并且提示靶向METTL1以及其下游信號軸可能是ESCC治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。該研究于22年5月發(fā)表于《Nature Communication》 IF：16.6

技術(shù)路線

1.METTL1/WDR4 在 ESCC 中上調(diào)，并與 ESCC 預(yù)后不良相關(guān)

       在ESCC病人樣本中檢查了METTL1 / WDR4的表達(dá)，數(shù)據(jù)顯示與鄰近正常組織相比，食管鱗狀細(xì)胞癌腫瘤組織的METTL1/WDR4 和 m7G修飾顯著升高（圖1A和B）。此外，免疫組化（IHC）染色顯示，食管腫瘤組織中METTL1的表達(dá)高于鄰近正常組織（圖1C和D）。此外，METTL1的表達(dá)與高腫瘤分級和分期顯著相關(guān) （1F-H）。接著研究了METTL1表達(dá)與ESCC患者預(yù)后的關(guān)系,生存分析表明，METTL1高表達(dá)與較差的總生存期和無病生存狀態(tài)相關(guān)（圖1I和J）。同樣，WDR4在ESCC中也上調(diào)，并與ESCC患者的不良預(yù)后相關(guān)（圖1K和L）?？偟膩碚f，數(shù)據(jù)顯示，METTL1和WDR4在ESCC中顯著上調(diào)，并與ESCC進(jìn)展和預(yù)后不良相關(guān)。

2.敲低METTL1 在異種移植模型中抑制ESCC進(jìn)展

       ESCC中METTL1表達(dá)的升高，因此作者認(rèn)為METTL1在ESCC進(jìn)展中起著促進(jìn)的功能。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，首先在 KYSE150和KYSE30著兩種ESCC 細(xì)胞中使用敲低METTL30， 發(fā)現(xiàn)敲低METTL1后能夠抑制K150和K30細(xì)胞增殖（圖2B）和集落形成能力（圖2C和D）的。此外，流式分析顯示，敲低METTL1能夠?qū)е?ESCC 細(xì)胞凋亡水平增加（圖2E和F）。接著利用異種移植小鼠模型探討了METTL1在體內(nèi)ESCC進(jìn)展中的作用，與對照組相比，敲低METTL1組小鼠腫瘤生長明顯減緩并且腫瘤大小和重量減?。▓D2G-I）。免疫組化結(jié)果顯示，敲低METTL1組的腫瘤中，Ki67水平下降，證明METTL1敲低后降低了ESCC在體內(nèi)的增殖活性（圖2J和K）。綜上所述，研究揭示了METTL1在體外和體內(nèi)ESCC進(jìn)展中的基本功能，即METTL1與ESCC發(fā)展呈現(xiàn)正相關(guān)。

3.METTL1在ESCC中調(diào)控m7G tRNA修飾、tRNA表達(dá)和mRNA翻譯

       為了研究METTL1在ESCC進(jìn)展中功能的分子機(jī)制，作者使用之前TRAC-seq 方法(tRNA還原和切割測序)，利用METTL1缺失和對照ESCC細(xì)胞分析了總的tRNA m7G修飾水平。在TRACseq數(shù)據(jù)庫中鑒定了19個(gè)m7G修飾的tRNA，這些tRNA在可變環(huán)中具有“ABGWY”序列(圖3A)。METTL1缺失顯著降低了tRNA的m7G修飾水平(圖3B和C)。RNA質(zhì)譜分析同樣也證實(shí)了METTL1敲除的細(xì)胞中tRNA m7G修飾水平的降低(圖3d)。此外，METTL1的缺失降低了大多數(shù)m7g修飾的trna的表達(dá)水平，而非m7g修飾的trna的表達(dá)幾乎沒有受到影響此外(圖3E和F)。與tracseq數(shù)據(jù)一致，m7G northwestern和northern實(shí)驗(yàn)證實(shí)，METTL1敲除細(xì)胞中m7G修飾水平降低，m7G修飾trna表達(dá)減少（圖3G）。此外，野生型METTL1而非其無催化活性的突變體的過表達(dá)增加了總m7G tRNA修飾水平和m7G修飾tRNA的表達(dá)，證明了METTL1通過其tRNA m7G甲基轉(zhuǎn)移酶活性調(diào)控tRNA修飾和表達(dá)（圖3H）。同樣，抑制WDR4導(dǎo)致m7G修飾水平降低，在K150和K30 ESCC細(xì)胞中，過表達(dá)WDR4增加了m7G tRNA修飾和m7G修飾的tRNA表達(dá)(圖3I和J)。這些數(shù)據(jù)均表明了METTL1/WDR4在調(diào)節(jié)tRNA m7G修飾和表達(dá)中的重要功能。

       tRNA在mRNA翻譯中起作用，我們接下來確定了METTL1對ESCC細(xì)胞mRNA翻譯的影響。多聚體分析顯示，METTL1敲低細(xì)胞的mRNA翻譯活性降低，多核糖體峰值降低(圖3K)。此外，嘌呤霉素?cái)z入測定也證實(shí)，METTL1敲低會降低ESCC細(xì)胞的mRNA翻譯活性(圖3L)。在METTL1缺失的細(xì)胞中，重新表達(dá)野生型METTL1而不是其突變體恢復(fù)了mRNA的翻譯效率，證明m7G的催化功能對METTL1促進(jìn)mRNA翻譯至關(guān)重要?？偟膩碚f，我們的數(shù)據(jù)表明，mettl1介導(dǎo)的m7G tRNA修飾對ESCC中tRNA的表達(dá)和mRNA翻譯至關(guān)重要。

       為了研究m7G修飾異常而導(dǎo)致的翻譯異常所產(chǎn)生的影響，使用METTL1敲除和對照ESCC細(xì)胞進(jìn)行了多聚核糖體測序(圖3M)。為了研究mRNA翻譯與tRNA m7G修飾之間的聯(lián)系，計(jì)算了測序結(jié)果當(dāng)中mRNA上的 m7G 修飾的 tRNA 所對應(yīng)的密碼子的數(shù)量。結(jié)果顯示，mRNA上m7G修飾的 tRNA 所對應(yīng)的密碼子越多，翻譯效率（Translation efficiencies, TE）也就越低。(圖3N)。Go分析和KEGG信號通路分析顯示TE-down mRNA在自噬生物學(xué)過程和mTOR信號通路中顯著富集（圖3O和P）。值得注意的是，與其他檢測到的mrna相比，那些te降低、參與自噬生物學(xué)過程或mTOR信號通路的mRNA被m7G修飾的tRNA解碼的密碼子數(shù)量更多(圖3Q)。接下來，我們確定了METTL1在調(diào)節(jié)自噬負(fù)調(diào)控基因和mTOR信號通路基因表達(dá)中的功能。我們的數(shù)據(jù)顯示，METTL1缺失降低了它們的蛋白質(zhì)表達(dá)，但對它們的mRNA影響很小(圖3R和S)。此外qPCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，在METTL1缺失的細(xì)胞中，編碼mTOR關(guān)鍵成分的RPTOR (mTOR復(fù)合物1的調(diào)控相關(guān)蛋白)的翻譯效率顯著降低(圖3T)。因此，我們隨后測定了METTL1敲除細(xì)胞中pULK1和自噬標(biāo)志物微管相關(guān)蛋白輕鏈3 LC3-II和LC3-I的水平。在氯喹(CQ)處理和未處理的K150和K30細(xì)胞中，METTL1缺失降低了pULK1水平，增加了LC3-II/LC3-I的比率(圖3U和V)，表明METTL1敲除的ESCC細(xì)胞中自噬水平增加。這些數(shù)據(jù)表明，翻譯損傷發(fā)生在細(xì)胞死亡和自噬之前，表明METTL1敲低降低mRNA翻譯，從而導(dǎo)致ESCC細(xì)胞死亡和自噬。綜上所述，我們的數(shù)據(jù)表明，METTL1以m7G相關(guān)密碼子依賴的方式促進(jìn)mTOR信號相關(guān)基因的翻譯和自噬途徑的負(fù)調(diào)控。

4.在ESCC中，RPTOR是METTL1的重要下游靶點(diǎn)

       我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在METTL1缺失的ESCC細(xì)胞中，重新表達(dá)RPTOR恢復(fù)了增殖和集落形成能力（圖4 A- D），此外，RPTOR過表達(dá)增加了ULK1磷酸化水平，降低了METTL1缺失細(xì)胞中LC3-II/LC3-I的比例，消除了ESCC細(xì)胞的自噬通量(圖4E-H)?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)揭示了RPTOR是METTL1的重要下游靶點(diǎn)，并進(jìn)一步支持了METTL1介導(dǎo)的tRNA m7G修飾通過調(diào)控RPTOR促進(jìn)ESCC進(jìn)展。因?yàn)镽PTOR可以在METTL1敲低的ESCC細(xì)胞中挽救ULK1的磷酸化水平并減少自噬，接下來在METTL1缺失的ESCC細(xì)胞中敲低ULK1，以確定METTL1和RPTOR是否通過調(diào)節(jié)ULK1介導(dǎo)的自噬來促進(jìn)ESCC的進(jìn)展(圖4I)。結(jié)果表明，抑制ULK1可以挽救METTL1缺失的ESCC細(xì)胞的生長(圖4J)，進(jìn)一步證明METTL1和RPTOR通過ULK1調(diào)節(jié)ESCC的進(jìn)展。此外，自噬通量檢測顯示，敲低ULK1可以消除METTL1缺失的ESCC細(xì)胞中增加的自噬通量(圖4K-M)?？偟膩碚f，我們的數(shù)據(jù)揭示了RPTOR/自噬軸在介導(dǎo)METTL1在ESCC進(jìn)展中的功能中的重要作用。

5.敲除 METTL1抑制ESCC腫瘤發(fā)生

       為了在體內(nèi)直接探索m7G tRNA修飾在ESCC腫瘤發(fā)生中的作用，構(gòu)建組織特異性Mettl1敲除小鼠模型。在使用他莫昔芬誘導(dǎo)Mettl1敲除后，Mettl1敲除和對照小鼠分別使用DNA烷基化劑二乙基亞硝胺(DEN)和多激酶抑制劑索拉非尼(sorafenib)誘導(dǎo)ESCC發(fā)生腫瘤32(圖5A)。經(jīng)DEN處理8周，索拉非尼處理12周后，發(fā)現(xiàn)對照組小鼠食管發(fā)生了明顯的病理變化，而Mettl1敲除小鼠的病變面積和ESCC數(shù)量明顯減少(圖5A-E)。組織學(xué)分析顯示，Mettl1敲除小鼠腫瘤中METTL1和Ki67染色水平降低(圖5F和G)。我們還發(fā)現(xiàn)，Mettl1敲除降低了小鼠腫瘤中m7G tRNA修飾，降低了RPTOR蛋白水平(圖5H-J)，這些數(shù)據(jù)支持METTL1和m7G tRNA修飾在體內(nèi)調(diào)節(jié)RPTOR mRNA的翻譯和RPTOR下游靶點(diǎn)的活性。值得注意的是，敲除組腫瘤中LC3蛋白水平明顯高于對照組(圖5L和M)，表明Mettl1敲除導(dǎo)致體內(nèi)自噬增加?？傊?，這些結(jié)果支持METTL1介導(dǎo)的m7G tRNA修飾在促進(jìn)ESCC體內(nèi)腫瘤發(fā)生中的關(guān)鍵功能。

6.METTL1/WDR4介導(dǎo)的m7G tRNA修飾促進(jìn)ESCC進(jìn)展

       為了進(jìn)一步加強(qiáng)m7G tRNA修飾與ESCC進(jìn)展之間的功能聯(lián)系，我們進(jìn)行了功能獲得研究(圖6A)。我們的數(shù)據(jù)顯示，強(qiáng)制表達(dá)野生型METTL1而非其催化死突變體可以促進(jìn)ESCC細(xì)胞的生長和集落形成(圖6B-E)。此外，過表達(dá)METTL1而非其突變體上調(diào)RPTOR蛋白表達(dá)，減少細(xì)胞凋亡和自噬(圖6F-I)?？偟膩碚f，我們的數(shù)據(jù)顯示tRNA m7G的催化功能對于METTL1調(diào)節(jié)靶表達(dá)和ESCC進(jìn)展至關(guān)重要。然后，我們在ESCC細(xì)胞中過表達(dá)WDR4，以進(jìn)一步證實(shí)m7G tRNA修飾促進(jìn)ESCC進(jìn)展的結(jié)論。我們的數(shù)據(jù)顯示，過表達(dá)WDR4可以穩(wěn)定METTL1蛋白的表達(dá)，并增加下游靶點(diǎn)RPTOR的表達(dá)(圖6J)。METTL1調(diào)節(jié)tRNA m7G修飾、tRNA表達(dá)和致癌mRNA翻譯。ESCC細(xì)胞生長和集落形成(圖6K-M)。這些數(shù)據(jù)支持WDR4是促進(jìn)ESCC進(jìn)展的重要癌基因?？傊?，我們的研究結(jié)果有力地支持了METTL1/WDR4介導(dǎo)的m7G tRNA修飾在ESCC進(jìn)展調(diào)控中的重要致癌功能。

7.METTL1促進(jìn)體內(nèi)ESCC原位瘤的發(fā)生

       我們進(jìn)一步建立了METTL1條件敲除蛋白小鼠模型，并誘導(dǎo)ESCC腫瘤發(fā)生，探討METTL1在ESCC腫瘤發(fā)生中的作用。DEN/sorafenib治療18周后(圖7A)， METTL1敲除小鼠的食道出現(xiàn)了大量的腫瘤，而對照組小鼠的食道只發(fā)生了少量和較小的病變(圖7B和C)。此外，敲除小鼠的異常增生和鱗狀細(xì)胞癌的數(shù)量明顯高于對照組(圖7D和F)。組織學(xué)分析顯示cKI小鼠腫瘤中METTL1表達(dá)水平較高增殖活性高于對照小鼠(圖7G和H)。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，與對照小鼠相比，敲除小鼠腫瘤中m7G tRNA修飾和m7G修飾tRNA的表達(dá)升高(圖7I)。此外，在METTL1 cKI小鼠腫瘤中，RPTOR蛋白水平升高，而mRNA水平未見升高(圖7J-M)。綜上所述，這些結(jié)果揭示了METTL1m7G tRNA修飾促進(jìn)了ESCC在體內(nèi)的腫瘤發(fā)生和發(fā)展。

結(jié)論

       總的來說作者認(rèn)為tRNA m7G修飾可以通過調(diào)控細(xì)胞自噬最終促進(jìn)ESCC的發(fā)生。METTL1可能是ESCC患者的一個(gè)有希望的治療靶點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)方法

免疫組化，免疫熒光染色，qRT-PCR ，Western blot，Northwestern blot，Northern blot，多核糖體分析，TRAC-seq，多核糖體測序，ribo-seq，自噬通量檢測，流式檢測凋亡細(xì)胞，克隆形成，細(xì)胞增殖，小鼠皮下成瘤，小鼠基因敲除

參考文獻(xiàn)

Han H, Yang C, Ma J, et al. N7-methylguanosine tRNA modification promotes esophageal squamous cell carcinoma tumorigenesis via the RPTOR/ULK1/autophagy axis. Nat Commun. 2022;13(1):1478. Published 2022 Mar 18.