AC092894.1下調(diào)促進(jìn)結(jié)直腸癌奧沙利鉑耐藥

實(shí)驗(yàn)方法：RT?qPCR，Western blotting，CCK?8，克隆形成實(shí)驗(yàn)，流式，裸鼠異種移植模型，免疫組化，RNA pull?down，RIP?qPCR。

  奧沙利鉑耐藥是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，是結(jié)直腸癌治療過(guò)程中最不利的因素之一。lncRNAs是近年來(lái)出現(xiàn)的治療耐藥的新型分子，但其介導(dǎo)的具體分子機(jī)制尚不清楚。AC092894.1表達(dá)在奧沙利鉑誘導(dǎo)的耐藥CRC細(xì)胞中顯著下調(diào)。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，AC092894.1具有逆轉(zhuǎn)藥物耐藥的作用。機(jī)制研究表明AC092894.1作為支架分子，通過(guò)USP3介導(dǎo)AR的去泛素化，從而增加RASGRP3的轉(zhuǎn)錄。最后，持續(xù)激活MAPK信號(hào)通路可誘導(dǎo)CRC細(xì)胞凋亡。總之，本研究確定AC092894.1是CRC化療耐藥的抑制因子，并揭示了靶向AC092894.1/USP3/AR/RASGRP3信號(hào)軸是治療奧沙利鉑耐藥的一種新選擇。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）AC092894.1在CRC細(xì)胞和對(duì)奧沙利鉑耐藥的患者組織中的表達(dá)降低

  為了研究lncRNAs在結(jié)直腸癌奧沙利鉑耐藥中的作用，我們首先通過(guò)連續(xù)給藥長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月的方法構(gòu)建了奧沙利鉑耐藥CRC細(xì)胞LoVo (LoVo- OxR)。通過(guò)細(xì)胞活力測(cè)定比較LoVo-OxR及其親本細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的敏感性，并計(jì)算半最大抑制濃度(IC50)(圖1A)。我們對(duì)LoVo和LoVo-OxR的lncRNA進(jìn)行全基因組測(cè)序分析，火山圖顯示差異基因分布(圖1B)，并在測(cè)序結(jié)果中篩選出兩個(gè)下調(diào)最顯著的lncRNA。通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)，AC092894.1基因下調(diào)最為顯著(圖1C)。AC092894.1在奧沙利鉑耐藥CRC臨床樣本中顯著下調(diào)，提示AC092894.1基因可能與患者奧沙利鉑耐藥有關(guān)(圖1D)。在40例CRC患者中，AC092894.1高表達(dá)的患者被觀察到預(yù)后良好(圖1E)。使用我們團(tuán)隊(duì)構(gòu)建的CRC類器官，AC092894.1的表達(dá)被奧沙利鉑顯著下調(diào)(圖1F, G)。我們使用6個(gè)暴露于不斷增加濃度的奧沙利鉑的CRC細(xì)胞系，并注意到HT-29和RKO與其他CRC細(xì)胞系相比具有天然抗性，而LoVo表現(xiàn)出最高程度的敏感性(圖1H)。此外，我們采用RT-qPCR檢測(cè)AC092894.1的表達(dá)隨著耐藥的增加而降低(圖1I)。

圖1

2）CRC細(xì)胞中奧沙利鉑敏感性的增加與AC092894.1的異位過(guò)表達(dá)有關(guān)

  構(gòu)建AC092894.1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)染LoVo-OxR和HCT116-OxR細(xì)胞。對(duì)其過(guò)表達(dá)效率的檢測(cè)顯示其可穩(wěn)定表達(dá)(圖2A)。細(xì)胞活力測(cè)定顯示，過(guò)表達(dá)AC092894.1后，奧沙利鉑對(duì)耐藥CRC細(xì)胞的作用隨著奧沙利鉑濃度的增加而增強(qiáng)(圖2B, C)。我們?cè)诘蛲鰧?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)有趣的現(xiàn)象，AC092894.1過(guò)表達(dá)僅在奧沙利鉑暴露后才促進(jìn)耐藥CRC細(xì)胞的化學(xué)敏感性。相反，在暴露于對(duì)照溶劑的耐藥CRC細(xì)胞中過(guò)表達(dá)AC092894.1不會(huì)促進(jìn)耐藥CRC細(xì)胞的化學(xué)敏感性(圖2D, E)。然后，我們?cè)诰湫纬蓪?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了相同的模式，其中AC092894.1的過(guò)表達(dá)僅在暴露于奧沙利鉑的耐奧沙利鉑CRC細(xì)胞中顯著促進(jìn)了化學(xué)敏感性(圖2F, G)。Western blotting分析顯示，過(guò)表達(dá)AC092894.1可顯著促進(jìn)奧沙利鉑治療后凋亡標(biāo)志物C-PARP的高表達(dá)(圖2H)。

圖2

3）CRC細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的敏感性通過(guò)AC092894.1的下游效應(yīng)分子RASGRP3增加

  為了進(jìn)一步探索AC092894.1促進(jìn)CRC細(xì)胞耐藥的分子機(jī)制，我們用RNA-seq分析了穩(wěn)定表達(dá)的AC092894.1細(xì)胞及其對(duì)照載體細(xì)胞?；鹕綀D顯示了差異表達(dá)的基因(圖3A)。KEGG富集分析顯示，AC092894.1過(guò)表達(dá)后的大部分差異表達(dá)基因參與TNF信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路(圖3B)。我們的結(jié)果還顯示，過(guò)表達(dá)AC092894.1激活了CRC耐藥細(xì)胞中的MAPK信號(hào)通路(圖3C)?；谶@些結(jié)果，AC092894.1可能作為MAPK信號(hào)通路的一部分參與了奧沙利鉑耐藥的發(fā)生。為了研究AC092894.1是如何參與調(diào)控MAPK信號(hào)通路的，我們?cè)赗NA-seq數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選了AC092894.1過(guò)表達(dá)與對(duì)照之間MAPK信號(hào)通路中差異表達(dá)的關(guān)鍵基因。此外，這些基因被實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證。結(jié)果顯示，AC092894.1過(guò)表達(dá)后，RASGRP3在mRNA水平上顯著上調(diào)。LoVo-OxR和HCT116-OxR的驗(yàn)證也顯示了RASGRP3蛋白水平的顯著上調(diào)(圖3D, E)。推測(cè)RASGRP3可能是AC092894.1的下游效應(yīng)分子。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR，我們發(fā)現(xiàn)RASGRP3在奧沙利鉑耐藥CRC患者中顯著下調(diào)(圖3F)。

圖3

4）AC092894.1通過(guò)在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控RASGRP3的表達(dá)，介導(dǎo)CRC細(xì)胞的化療耐藥

  為了確定RASGRP3對(duì)于AC092894.1在CRC細(xì)胞中介導(dǎo)奧沙利鉑耐藥是否至關(guān)重要，我們分別在LoVo-OxR (AC092894.1)和HCT116-OxR (AC092894.1)細(xì)胞中敲除RASGRP3(圖4A)。細(xì)胞活力、凋亡和菌落形成的結(jié)果表明，敲除RASGRP3可恢復(fù)耐藥CRC細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的耐藥(圖4B-F)。此外，我們發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)AC092894.1通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因促進(jìn)了RASGRP3的啟動(dòng)子活性(圖4G)。這一結(jié)果表明，RASGRP3表達(dá)的改變是由轉(zhuǎn)錄水平的改變引起的。

圖4

5）AR作為轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)RASGRP3的轉(zhuǎn)錄并介導(dǎo)化療耐藥

  我們一直在應(yīng)用PROMO數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)預(yù)測(cè)RASGRP3，因?yàn)槲覀兛梢匝芯恳呀?jīng)發(fā)生的轉(zhuǎn)錄變化。我們發(fā)現(xiàn)GATA-2、RXRα、FOXP3和AR可能是它們潛在的轉(zhuǎn)錄因子(圖5A)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)AC092894.1過(guò)表達(dá)后，LoVo-OxR和HCT116-OxR細(xì)胞中只有AR上調(diào)(圖5B)，提示AR可能是影響RASGRP3轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵因素。為了探索AR是否也介導(dǎo)耐藥，我們分別在LoVo-OxR (AC092894.1)和HCT116-OxR (AC092894.1)細(xì)胞中敲除AR(圖5C)。如圖5D-G所示，敲除AR可增強(qiáng)耐藥CRC細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的耐藥。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，AR的下調(diào)可恢復(fù)RASGRP3 mRNA水平和啟動(dòng)子活性(圖5H, I)。實(shí)時(shí)定量PCR顯示，在奧沙利鉑耐藥CRC患者中，AR表達(dá)顯著降低(圖5J)。

圖5

6）AC092894.1作為支架分子招募USP3促進(jìn)AR去泛素化

  為了探究AC092894.1與AR的關(guān)系，我們假設(shè)AC092894.1通過(guò)與AR直接結(jié)合來(lái)調(diào)控AR。我們使用生物素化AC092894.1探針及其反義探針進(jìn)行RNA敲除，然后進(jìn)行Western blotting分析。原理圖見(jiàn)圖6A。結(jié)果顯示AC092894.1可以捕獲AR的特征，但反義探針并沒(méi)有富集AR(圖6B)。隨后，我們通過(guò)RIP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與IgG相比，AR抗體可以特異性捕獲AC092894.1(圖6C)。這些結(jié)果證明AC092894.1可以與AR相互作用。為了探索AC092894.1是否可以在mRNA水平上影響AR的表達(dá)，我們通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)了LoVo-OxR和HCT116-OxR細(xì)胞中AR的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)AC092894.1不能在mRNA水平上調(diào)控AR(圖6D)，因此AC092894.1可能通過(guò)蛋白水平或其他方式影響AR的表達(dá)。LncRNAs常被報(bào)道作為引導(dǎo)物、誘餌或支架參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此，我們大膽推測(cè)AC092894.1是否具有支架分子的功能。接下來(lái)，我們對(duì)RNA下拉蛋白進(jìn)行了質(zhì)譜分析。質(zhì)譜與去泛素酶預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)Ubibrowser的交叉分析表明，USP3可能是一個(gè)潛在的關(guān)鍵分子(圖6E)。通過(guò)RNA下拉實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)AC092894.1可以捕獲USP3，但其反義探針不能捕獲USP3 (圖6F)。接下來(lái)，我們通過(guò)RIP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AC092894.1在USP3抗體上的富集程度明顯高于IgG抗體。這進(jìn)一步證明了AC092894.1與USP3的結(jié)合(圖6G)。此外，我們發(fā)現(xiàn)AC092894.1過(guò)表達(dá)后，USP3在LoVo-OxR和HCT116-OxR細(xì)胞中的表達(dá)沒(méi)有明顯變化(圖6H)。我們發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)AC092894.1促進(jìn)了USP3與AR的共免疫沉淀相互作用(圖6I)。敲低USP3促進(jìn)了AR的蛋白降解(圖6J)。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)AC092894.1促進(jìn)了AR的去泛素化(圖6K)。這些結(jié)果表明，AC09894.1可以作為將USP3募集到AR的支架分子，促進(jìn)其去泛素化，從而增加AR的蛋白質(zhì)水平。

圖6

7）AC092894.1異位過(guò)表達(dá)增加體內(nèi)奧沙利鉑敏感性

  為了研究AC092894.1在體內(nèi)對(duì)CRC耐藥的調(diào)節(jié)作用，我們將HCT116-OxR細(xì)胞皮下注射到裸鼠體內(nèi)。小鼠皮下腫瘤形成后，腹腔注射奧沙利鉑(ip, 5mg /kg / d)。腫瘤大小每5天測(cè)量一次，而受試者每3天接受DMSO (0.1 mL/kg)或乙醇(0.1 mL/kg)(圖7A)。過(guò)表達(dá)AC092894.1增加了CRC細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的敏感性，導(dǎo)致腫瘤密度降低，體積變小(圖7B-D)。對(duì)于小鼠腫瘤，采用RT-qPCR進(jìn)行驗(yàn)證(圖7E)。免疫組化實(shí)驗(yàn)顯示AC092894.1過(guò)表達(dá)后p-p38和RASGRP3的表達(dá)增加(圖7F)?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)表明AC092894.1可能是克服CRC患者奧沙利鉑耐藥的有效治療靶點(diǎn)。

圖7

結(jié)論：我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的lncRNA AC092894.1，它在奧沙利鉑耐藥CRC中顯著下調(diào)。機(jī)制研究表明AC092894.1可通過(guò)招募USP3促進(jìn)AR的去泛素化。增強(qiáng)AR的穩(wěn)定性可以進(jìn)一步促進(jìn)RASGRP3的轉(zhuǎn)錄，從而激活MAPK信號(hào)通路，最終導(dǎo)致CRC細(xì)胞的化療敏感性。我們的研究結(jié)果表明AC092894.1對(duì)奧沙利鉑的拮抗至關(guān)重要，并認(rèn)識(shí)到AC092894.1在CRC中的潛在治療用途及其下游影響。

參考文獻(xiàn)：Zheng Z, Wu M, Li H, Xu W, Yang M, Pan K, Ni Y, Jiang T, Zheng H, Jin X, Zhang Y, Ding L, Fu J. Downregulation of AC092894.1 promotes oxaliplatin resistance in colorectal cancer via the USP3/AR/RASGRP3 axis. BMC Med. 2023 Apr 3;21(1):132. doi: 10.1186/s12916-023-02826-6.