間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞相關(guān)遷移體：造血來源細(xì)胞化學(xué)引誘劑的新來源

間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞（Mesenchymal stromal cells, MSCs）是一種特殊的多能細(xì)胞，通過各種途徑調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫反應(yīng)和促進(jìn)造血。分離后，根據(jù)其在塑料培養(yǎng)皿上的黏附和增殖，呈現(xiàn)為具有分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞能力的異種群體。因此在再生醫(yī)學(xué)中具有巨大的治療應(yīng)用潛力。近年來一種新的細(xì)胞間通訊機(jī)制被描述，這種機(jī)制是基于大的石榴形結(jié)構(gòu)，包裹著許多小泡，稱為遷移體。這些獨(dú)特的結(jié)構(gòu)發(fā)育在遷移細(xì)胞后方的回縮纖維上，形成了遷移體網(wǎng)絡(luò)。間充質(zhì)干細(xì)胞是否利用這些特殊的細(xì)胞器在骨髓微環(huán)境的細(xì)胞組分之間交換信息尚未可知。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. 間充質(zhì)干細(xì)胞通過兩種不同的細(xì)胞機(jī)制產(chǎn)生遷移體網(wǎng)絡(luò)

作者研究了癌細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)黏附在塑料上的原代人MSCs在纖維連接蛋白（5μg/cm2）包被的玻璃玻片上生長24小時后，會沿收縮纖維網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)生一種新型的細(xì)胞突起，稱為遷移體（圖1A）。通過熒光素標(biāo)記的WGA染色觀察到的這些結(jié)構(gòu)出現(xiàn)在分支點(diǎn)或沿著收縮纖維，以及在末端（圖1A、B）。從結(jié)構(gòu)上看，它們的外觀大小不一（圖1A，黑色箭頭和白色箭頭）。隨著時間的推移，當(dāng)回縮纖維被降解時，作者還觀察到明顯的無細(xì)胞和脫落的遷移體（圖1C）。定量分析顯示，無論培養(yǎng)時間是24到72小時，大約25-40%的MSCs都有遷移體（圖1D）。然而，在此期間，每個細(xì)胞的遷移體數(shù)量減少，而游離的、脫離的遷移體數(shù)量增加（圖1D、E）。掃描電子顯微鏡可以在高分辨率下觀察到或小或大的與收縮纖維相關(guān)的和游離的遷移體（圖1F-H）。延時視頻顯微鏡顯示了遷移體的動態(tài)成熟，即沿著收縮纖維從早期（小的三角形）到完全形成（大的圓形）遷移體（圖1I、J）。這些活細(xì)胞圖像強(qiáng)調(diào)了遷移體形成的兩種主要機(jī)制。它們在非遷移細(xì)胞（圖1I）或遷移后的MSC（圖1J）的膜回縮形成的回縮纖維上發(fā)育。在這兩種情況下，沿回縮纖維的遷移體可以形成一個“遷移體網(wǎng)絡(luò)”，作為遷移細(xì)胞背后或圍繞非遷移細(xì)胞的軌跡（圖1K）。

圖1 原代人間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生遷移體網(wǎng)絡(luò)

然后，作者評估了不同基質(zhì)對MSCs產(chǎn)生遷移體的潛力。為此，在固定和標(biāo)記前，作者將MSCs在涂有纖連蛋白（1或5μg/cm2）、IV型膠原（10μg/cm2）、層粘連蛋白（5μg/cm2）或PLL（5μg/cm2）的玻璃玻片上培養(yǎng)24小時（圖2）。當(dāng)在纖維連接蛋白和層粘連蛋白-411和-511上培養(yǎng)時，約50%的MSCs攜帶有或沒有遷移體的回縮纖維（圖2A）。當(dāng)使用玻璃等未涂覆表面時，這一數(shù)字顯著下降至30%。在ⅳ型膠原、laminin-111/EHS和-521上，含有或不含有遷移體的回縮纖維的MSCs數(shù)量減少。對于ⅳ型膠原，以及層粘連蛋白-411/-511，作者觀察到含有遷移體的回縮纖維多于不含遷移體的回縮纖維，這與其他襯底或未涂層表面形成對比，后者約50%的回縮纖維帶有遷移體。有趣的是，當(dāng)使用PLL時，沿回縮纖維的遷移體的存在大大增加（圖2A）。此外，對每個細(xì)胞的遷移體數(shù)量進(jìn)行的定量分析表明，與所有其他底物相比，它們在PLL上的存在顯著增加（圖2B），這表明強(qiáng)烈的附著是它們形成的先決條件。

圖2 基質(zhì)底物對遷移體形成的影響

2. 間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)遷移體含有F-肌動蛋白和微管蛋白

為了獲得遷移體組成的信息，包括細(xì)胞骨架的組織和動力學(xué)，作者使用SiR-Actin（一種細(xì)胞通透性熒光劑，可特異性標(biāo)記F-actin）對MSCs進(jìn)行染色，并對α-微管蛋白進(jìn)行免疫染色。用WGA對細(xì)胞進(jìn)行復(fù)染，以突出細(xì)胞的整體結(jié)構(gòu)。CLSM分析顯示，肌動蛋白存在于收縮纖維和與其相關(guān)的遷移體中，而α-微管蛋白僅限于遷移體（圖3A）。注意F-actin在回縮纖維中的分布并不均勻，提示它是動態(tài)定位的。遷移體的3D渲染顯示了f -肌動蛋白和α-微管蛋白（圖3B）。對未成熟和成熟的遷移體的分析表明，α-微管蛋白出現(xiàn)在遷移體形成的后期階段（圖3C）。熒光素標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽也可以檢測到收縮纖維和PFA固定的MSCs的遷移體中的F-actin，而不是SiR-Actin（圖3D）。由于f -肌動蛋白沿回縮纖維的異質(zhì)性分布，作者通過TIRF顯微鏡觀察到活細(xì)胞中f -肌動蛋白的動態(tài)變化，突出了肌動蛋白沿回縮纖維和遷移體的運(yùn)輸（圖3E）。

圖3 F-肌動蛋白與回縮纖維和遷移體有關(guān)，微管蛋白僅限于遷移體

3. 間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)遷移體含有晚期內(nèi)體/多泡體，但沒有線粒體

由于遷移體和回縮纖維在遷移細(xì)胞背后或非遷移細(xì)胞周圍形成了一個廣泛的網(wǎng)絡(luò)，確定某些間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物是否在這個細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)中表達(dá)是很有意義的。作者通過免疫標(biāo)記檢測了CD44、CD73、CD90、CD105和CD166的存在。在纖維連接蛋白包被的玻璃玻片上培養(yǎng)的MSCs中檢測到上述5種標(biāo)志物。除CD166外，所有這些分子均在回縮纖維和遷移體中被發(fā)現(xiàn)（圖4A）。CD44沿回縮纖維均勻出現(xiàn)，而CD90和CD105呈點(diǎn)狀染色（圖4A）。CD73被認(rèn)為是分離MSCs的一個有前景的標(biāo)志物，它沿回縮纖維呈稀疏的點(diǎn)狀存在（圖4A）。CD166是一種跨膜黏附蛋白，參與同源性和異型性相互作用，調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞龕和血管生成。這種蛋白選擇性地集中在遷移體中，而在回縮纖維中幾乎檢測不到（圖4A）。它出現(xiàn)在遷移體形成的早期階段，即在其中的微管蛋白出現(xiàn)之前（圖4B）。有趣的是，對成熟遷移體表面的CD166免疫標(biāo)記進(jìn)行的定量分析顯示，相對于細(xì)胞表面，CD166在該位置選擇性富集（圖4C、D）。除了回縮纖維外，在遷移體中也檢測到四跨膜蛋白CD9（CD166的相互作用伙伴，調(diào)節(jié)其黏附特性）（圖4E）。在這些網(wǎng)絡(luò)中檢測到其他四種四跨膜蛋白（CD63、CD81、TSPAN2和TSPAN4）（圖4E、F）。TSPAN4與CD166一樣，對遷移體具有特異性（圖4F）。CD63存在于遷移體的表面和內(nèi)部（圖4G）。CD63是LE/MVB中發(fā)現(xiàn)的腔內(nèi)小泡的標(biāo)志物，LE/MVB與質(zhì)膜融合后以外泌體的形式釋放。遷移體的3D渲染突出了內(nèi)囊泡中CD63的存在（圖4H）。為了證實(shí)LE/MVB在遷移體中的存在，作者使用針對小GTP酶Rab7的抗體標(biāo)記間充質(zhì)干細(xì)胞，或者使用編碼Rab7-GFP融合蛋白的質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染它們。兩種方法都顯示了Rab7在遷移體中的存在（圖4I、J）。CD63與Rab7-GFP的共標(biāo)記顯示了它們在遷移體中的存在（圖4J、K），3D渲染顯示了它們的亞遷移體定位（圖4L）。有趣的是，當(dāng)后者的結(jié)構(gòu)在收縮纖維降解后與細(xì)胞分離時，它們?nèi)匀淮嬖谟谶w移體中（圖4K），這表明MSCs的一些細(xì)胞成分可能在它們不與細(xì)胞本身直接接觸時發(fā)揮作用。

圖4 MSC來源的遷移體表現(xiàn)出獨(dú)特的細(xì)胞表面CD標(biāo)志物譜并攜帶細(xì)胞內(nèi)囊泡

4. MSC相關(guān)的遷移體含有信號分子

為了更好地理解間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)的遷移體的作用，特別是在細(xì)胞間信號傳導(dǎo)的背景下，作者研究了是否存在趨化因子SDF-1。作者根據(jù)免疫染色和融合蛋白的表達(dá)再次使用了兩種不同的方法（圖5A、B）。SDF-1的免疫反應(yīng)在遷移體中被檢測到，并在沿回縮纖維的點(diǎn)狀模式中被檢測到（圖5A），這表明SDF-1被主動轉(zhuǎn)運(yùn)到回縮纖維相關(guān)的遷移體中。類似地，SDF-1-GFP的異位表達(dá)顯示其并入附著于回縮纖維的遷移體（圖5B）。值得注意的是，只有一小部分遷移體含有SDF-1（即約占所有遷移體的13%；60個遷移體，n = 10個細(xì)胞）的免疫染色或異位表達(dá)結(jié)果表明，其在其中的積累是受調(diào)節(jié)的。SDF-1作為一種趨化因子，由MSCs分泌，在骨髓干細(xì)胞龕環(huán)境下，在HSPC歸巢過程中發(fā)揮作用。通過相位對比顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，遷移體的相移發(fā)生了突然變化（圖5C，插圖c '，黑色→黃色星號），這可以解釋為它們的膜完整性喪失，表明它們的貨物被釋放。后者可能解釋了含有SDF-1的遷移體比例較低。除了釋放它們的內(nèi)容物，遷移體也被釋放到條件培養(yǎng)基中（圖5C，插入c '，紅色星號）。

圖5 MSC來源的遷移體可以作為化學(xué)引誘細(xì)胞器

5. 間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)遷移體吸引白血病 KG-1a 細(xì)胞和原代 CD34HSPC+

為了評估間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)的遷移體網(wǎng)絡(luò)對造血來源細(xì)胞的影響，作者將生長在纖維連接蛋白包被的玻璃玻片上的間充質(zhì)干細(xì)胞與白血病KG-1a細(xì)胞共培養(yǎng)4和12小時，然后評估與細(xì)胞和/或遷移體網(wǎng)絡(luò)相關(guān)的癌細(xì)胞數(shù)量。首先，對細(xì)胞或遷移體覆蓋的表面積進(jìn)行的量化顯示，它們占總表面積的25%以下，這在觀察的時間點(diǎn)之間是一致的（圖5D、E）。有趣的是，隨著時間的推移，白血病細(xì)胞的分布顯示出對MSCs和遷移體網(wǎng)絡(luò)的強(qiáng)烈偏好（圖5F）。因此，KG-1a細(xì)胞優(yōu)先粘附于定居的間充質(zhì)干細(xì)胞及其遷移體，而不是被纖維連接蛋白作為細(xì)胞外基質(zhì)成分包裹的游離表面，這表明釋放的因子如趨化因子SDF-1吸引了它們和/或粘附蛋白保留了它們。在共培養(yǎng)的細(xì)胞中加入CXCR4特異性抑制劑AMD3100。當(dāng)使用10μM AMD3100時，與MSCs或遷移體網(wǎng)絡(luò)相互作用的白血病細(xì)胞數(shù)量顯著減少（圖5G），表明CXCR4-SDF-1軸參與KG-1a細(xì)胞的選擇性定位。通過在共培養(yǎng)基中添加重組SDF-1（100 ng/mL）進(jìn)一步研究CXCR4-SDF-1軸的意義（圖5G）。加入重組SDF-1顯著減少了與MSCs和遷移體網(wǎng)絡(luò)相關(guān)的白血病細(xì)胞數(shù)量（圖5G），提示MSCs和遷移體產(chǎn)生的SDF-1梯度被減弱。間接地，這些實(shí)驗(yàn)表明癌細(xì)胞在間充質(zhì)干細(xì)胞或遷移體上的積累不是一個隨機(jī)事件。延時視頻顯微鏡顯示了KG-1a細(xì)胞向遷移體的定向遷移以及遷移體在遷移體中的滯留（圖5H）。

接下來，作者研究了細(xì)胞黏附分子CD166在KG-1a細(xì)胞選擇性滯留在間充質(zhì)干細(xì)胞或遷移體網(wǎng)絡(luò)中的作用。為此，作者將MSCs與抗CD166抗體（5μg/mL）或小鼠IgG對照抗體預(yù)孵育2小時，然后去除抗體并引入KG-1a細(xì)胞4小時。有趣的是，作者觀察到與MSCs和遷移體網(wǎng)絡(luò)相關(guān)的KG-1a細(xì)胞顯著減少（圖5I）。值得注意的是，抗CD166抗體對遷移體網(wǎng)絡(luò)的影響似乎比對MSCs的影響更深刻，這表明遷移體上選擇性的CD166濃度在其中的白血病細(xì)胞滯留起作用。

最后，如上所述評估CD166的影響。與白血病細(xì)胞相比，抗CD166抗體的添加并沒有改變CD34 HSPC對MSC本身的偏好，但顯著降低了對遷移體網(wǎng)絡(luò)的偏好（圖5J）。CD166在遷移體上的強(qiáng)表達(dá)和/或CD166相互作用伴侶的存在與否或造血細(xì)胞可能解釋了MSC與其遷移體網(wǎng)絡(luò)之間以及癌細(xì)胞和CD34 HSPC之間的這種差異影響。

6. 間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)的遷移體被遷移的白血病細(xì)胞選擇性吸收，但不被CD34HSPC選擇性吸收

通過研究造血起源的細(xì)胞是否以CXCR4-SDF-1-依賴性方式吸引到MSC相關(guān)的遷移體網(wǎng)絡(luò)中，作者注意到遷移白血病細(xì)胞可以吸收遷移體。延時視頻顯微鏡顯示，遷移的KG-1a細(xì)胞在運(yùn)動過程中可以吸收回縮纖維附著或無細(xì)胞遷移體（圖5K）。在相同條件下，作者沒有觀察到原代CD34 HSPC攝取與MSC相關(guān)的遷移體。相反，被吸引的CD34 HSPC即使在接觸遷移體后仍繼續(xù)運(yùn)動。

結(jié)論：

該研究描述了一種MSCs與造血來源細(xì)胞進(jìn)行通信的新機(jī)制，需要進(jìn)一步的研究來破譯健康和轉(zhuǎn)化骨髓微環(huán)境中遷移體的所有生物學(xué)方面。

參考文獻(xiàn)：

Deniz IA, Karbanová J, Wobus M, et al. Mesenchymal stromal cell-associated migrasomes: a new source of chemoattractant for cells of hematopoietic origin. Cell Commun Signal. 2023 Feb 14;21(1):36.