新亞群發(fā)高分——CD36+ CAFs的免疫功能

實(shí)驗(yàn)方法：CRISPR-Cas9敲低小鼠和模型構(gòu)建，單細(xì)胞RNA測(cè)序和生物信息學(xué)分析，慢病毒包裝，ELISA，ChIP，RT-qPCR，多重免疫熒光（mIF）染色，IHC實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞共培養(yǎng)，脂肪酸或脂蛋白的攝取、脂質(zhì)過(guò)氧化實(shí)驗(yàn)，核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)，流式細(xì)胞術(shù)，遷移抑制因子（MIF）染色實(shí)驗(yàn)

肝細(xì)胞癌（HCC）是一種具有高度細(xì)胞異質(zhì)性的免疫治療耐藥惡性腫瘤。細(xì)胞類(lèi)型的多樣性以及腫瘤細(xì)胞與非腫瘤細(xì)胞之間的相互作用仍有待闡明。人類(lèi)和小鼠HCC腫瘤的單細(xì)胞RNA測(cè)序顯示癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAF）的異質(zhì)性。本研究進(jìn)一步分析證實(shí)CD36⁺ CAFs通過(guò)分泌巨噬細(xì)胞遷移抑制因子為HCC提供免疫抑制微環(huán)境。

技術(shù)路線：

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1、單細(xì)胞分析揭示人HCC腫瘤的復(fù)雜性

對(duì)7例原代HCC腫瘤組織和癌旁組織進(jìn)行單細(xì)胞RNA測(cè)序（圖1a）。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行過(guò)濾和歸一化后進(jìn)行主成分分析，使用已知的細(xì)胞markers細(xì)胞共分為9種類(lèi)型，包括上皮和腫瘤細(xì)胞，B細(xì)胞，T細(xì)胞，NK細(xì)胞，髓源性抑制細(xì)胞（MDSCs），單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞，樹(shù)突狀細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞（圖1b和1c）。

2、人HCC中5種CAFs亞型的鑒定和分子特征

α-SMA的IHC染色顯示，80%以上的HCC病例以成纖維細(xì)胞激活和積累引起的廣泛肝纖維化為特征（圖1d）。對(duì)本研究單細(xì)胞RNA測(cè)序中的CAFs進(jìn)行進(jìn)一步聚類(lèi)，發(fā)現(xiàn)其分為5種亞型（圖1e），它們都高表達(dá)經(jīng)典成纖維細(xì)胞markers，然而，不同亞群表型出截然不同的轉(zhuǎn)錄組特征（圖1f-g）。其中Subcluster 0 CAFs占CAF群體的約40%，并以MYH11、MUSTN1和MCAM等標(biāo)志性微血管基因?yàn)樘卣鳎▓D1f-g）。因此，將其命名為血管CAFs（vCAFs，vCAFs-c0-MYH11）。GO和KEGG分析顯示vCAFs顯著富集至血管平滑肌收縮和對(duì)鈣離子的反應(yīng)，與它們的微血管特征一致（圖1h-i）。Subcluster 2 CAFs表達(dá)低水平α-SMA和高水平ECM特征（圖1f-g）。GO顯示這個(gè)亞群與ECM和膠原纖維組織有關(guān)（圖1h-i），因此，將其命名為matrix CAFs（mCAFs，mCAFs-c2-LUM）。此外，Subcluster 1 CAFs高表達(dá)脂質(zhì)相關(guān)基因（圖1f-g），且富集至ECM，膽固醇代謝，脂肪酸代謝等，提示其可能參與ECM和膽固醇代謝（圖1h-i），因而命名為脂質(zhì)處理mCAFs（lpmCAFs，lpmCAFs-c1-CD36）。類(lèi)似的，根據(jù)其高表達(dá)基因特性和KEGG富集特征，將Subcluster 3 CAFs命名為脂質(zhì)處理CAFs（lpCAFs，lpCAFs-c1-APOA1）；Subcluster 4 CAFs命名為抗原呈遞CAFs（apCAFs，apCAFs-c4-HLA-DRA）。為探索不同病因引起的CAF亞型的異質(zhì)性，對(duì)7個(gè)非HBV相關(guān)的HCC腫瘤進(jìn)行了scRNA-seq，發(fā)現(xiàn)與HBV-HCC相比，非HBV HCC中CD36⁺ CAFs和lpCAFs的比例顯著降低（圖1j-l）。最后，使用多重免疫熒光染色證實(shí)了人HCC樣本中存在主要CAFs亞群（圖1m）。

圖1人類(lèi)HBV相關(guān)HCC中不同的成纖維細(xì)胞亞群

3、小鼠HCC腫瘤中CAF亞型的單細(xì)胞分析概括了人類(lèi)HCC中發(fā)現(xiàn)的亞型

在上述人的HCC樣本證實(shí)存在5種CAFs，為進(jìn)行更深入的CAF表征，將研究擴(kuò)展到小鼠HCC模型。將px330-sg-p53和CMV-SB13聯(lián)合CTNNB1-N90尾靜脈注入6周齡C57BL/6J小鼠，建立CTNNB1N90;Trp53KO肝癌小鼠模型，以模擬肝癌遺傳背景（圖2a）?；谠撃Ｐ?，將7個(gè)肝癌小鼠腫瘤分離成單細(xì)胞，嚴(yán)格過(guò)濾后共獲得63977個(gè)活細(xì)胞，分為10個(gè)簇（圖2b）。隨后，其中1746個(gè)CAFs聚為7個(gè)亞群（圖2c），它們都高表達(dá)經(jīng)典成纖維細(xì)胞markers，然而，不同亞群表型出截然不同的轉(zhuǎn)錄組特征（圖2d-e）。有趣的是，在人樣本鑒定到的5個(gè)CAFs亞群也都存在于這小鼠樣本中（圖2c）。CD36⁺ CAFs和lpCAFs富集了包括ROS和代謝在內(nèi)的上調(diào)通路（圖2f）。最后，使用Myh11、Lum、Acta2、Cd36和H2-Aa等特異性標(biāo)記物進(jìn)行mIF染色，以確認(rèn)主要CAF簇也存在于小鼠HCC組織中（圖2g）。

圖2小鼠HCC組織中不同的成纖維細(xì)胞亞群

4、CAFs亞型特異性轉(zhuǎn)錄因子（TFs）和基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

接下來(lái)，確定TFs及其靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以更好地理解CAF亞型如何在遺傳上建立和維持。為此，應(yīng)用SCENIC21軟件確定了在一種CAF亞型中相對(duì)于其他亞型具有高度活性的TFs及其靶點(diǎn)。觀察到vCAFs富集于MEF2C和FOS（圖3a, b），而MEF2C和FOS先前被認(rèn)為調(diào)節(jié)新生血管生成。此外，MEF2C的靶基因MYLK、ACTA2和MYH11在vCAFs中表達(dá)上調(diào)（圖3d）。TWIST1和CREB3L1是mCAFs中最高表達(dá)TFs（圖3a, c）。TWIST1是CAF轉(zhuǎn)分化的關(guān)鍵因子。TWIST1靶基因大部分在mCAFs中上調(diào)（圖3d）。lpmCAFs (CD36⁺ CAFs)顯示CEBPD的高表達(dá)（圖3a, c）。脂蛋白脂肪酶LPL靶基因在lpmCAFs中上調(diào)表達(dá)（圖3d）。除了CEBPD，lpCAFs還高表達(dá)CEBPA和MAFB（圖3a, c），它們是已知TF參與促進(jìn)LDL代謝轉(zhuǎn)錄程序。apCAFs高表達(dá)IKZF1和RUNX3（圖3a, c），它們與巨噬細(xì)胞極化和T細(xì)胞招募有關(guān)。為檢測(cè)在這些小鼠CAF亞群中活躍的主調(diào)控因子，進(jìn)行SCENIC分析，結(jié)果顯示Mef2c和Foxf1是小鼠vCAFs中活躍的TF基因，與人類(lèi)vCAFs相似（圖3e,f）。

5、CD36⁺ CAFs與MDSCs呈正相關(guān)，在HCC腫瘤中與MDSCs接近

接下來(lái)探索異質(zhì)性CAF與TME中其他細(xì)胞之間的特異性串?dāng)_機(jī)制。在所有已知的配體-受體對(duì)中，MIF信號(hào)通路以MIF配體及其CD74/CXCR4受體為主。有趣的是，lpmCAFs和lpCAFs高表達(dá)CD36（圖1g），CD36是作用于MDSCs的MIF配體的最主要來(lái)源。因此，作者使用特定的表面標(biāo)記在lpmCAFs (c1-mCAF-CD36)和lpCAFs中鑒定CD36，并發(fā)現(xiàn)它們都在脂肪生成通路中富集（圖3g）。mIF實(shí)驗(yàn)表明，與癌旁組織相比，CD36⁺ CAFs在小鼠和人的腫瘤組織中特異性浸潤(rùn)（圖3h, i）。隨后研究了CD36+ CAFs與TME內(nèi)效應(yīng)T細(xì)胞MDSCs之間是否存在相關(guān)性。scRNA-seq數(shù)據(jù)顯示CD36⁺ CAFs與MDSCs呈正相關(guān)，但和效應(yīng)T細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)（圖3j），該結(jié)果被臨床切片組織染色證實(shí)（圖3k-l）。此外，對(duì)12例HCC腫瘤進(jìn)行單細(xì)胞核測(cè)序，發(fā)現(xiàn)CD36⁺ CAFs的數(shù)量與MDSCs的數(shù)量呈正相關(guān)（圖3m）。mIF染色顯示CD36⁺ CAFs比CD36^- CAFs更接近MDSCs（圖3n）。總之，這些結(jié)果表明CD36⁺ CAFs可能賦予HCC有效的免疫抑制作用。

圖3 CAFs的特異性TF以及CAFs和MDSCs之間的相互作用

6、CD36在CD36⁺ CAFs中通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化/p38/CEBPs軸介導(dǎo)OxLDL攝取促進(jìn)MIF表達(dá)

利用圖4a中的流式細(xì)胞術(shù)策略分離CD36⁺ CAFs，此外，其分離的CAFs細(xì)胞類(lèi)型比例和小鼠即人樣本中的分布類(lèi)似（圖4b-c）。隨后測(cè)試不同類(lèi)型CAFs產(chǎn)生MIF的水平。結(jié)果顯示CD36⁺ CAFs產(chǎn)生的MIF水平顯著高于其它類(lèi)型（圖4d,e）?；谶@些結(jié)果，作者將重點(diǎn)放在CD36⁺ CAFs的這個(gè)亞簇上進(jìn)行進(jìn)一步研究。WB和ELISA證實(shí)當(dāng)在CD36⁺ CAFs細(xì)胞中沉默CD36（CD36^kd CAFs）后MIF的表達(dá)和分泌顯著減少（圖4f）。此外，與前文單細(xì)胞測(cè)序結(jié)果的信號(hào)通路分析類(lèi)似，作者發(fā)現(xiàn)CD36⁺ CAFs中脂質(zhì)過(guò)氧化相關(guān)基因的表達(dá)顯著高于CD36^kd CAFs（圖4h）。使用熒光偶聯(lián)OxLDL和流式細(xì)胞術(shù)，發(fā)現(xiàn)CD36⁺ CAFs比CD36^kd CAFs有更高的OxLDL攝取率（圖4i, j）。CD36⁺ CAFs的脂質(zhì)過(guò)氧化也顯著高于CD36^kd CAFs（圖4k）。接下來(lái)確定OxLDL是否會(huì)增加CD36⁺ CAFs中的脂質(zhì)過(guò)氧化，結(jié)果顯示OxLDL以劑量依賴(lài)的方式增強(qiáng)CD36⁺ CAFs的脂質(zhì)過(guò)氧化作用，而LDL則沒(méi)有（圖4l）。此外，通過(guò)檢測(cè)CD36⁺ CAFs中p38的磷酸化來(lái)檢測(cè)OxLDL是否可以激活p38，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OxLDL誘導(dǎo)CD36⁺ CAFs的p38磷酸化，但在CD36^kd CAFs中程度較低，并且添加Toco或SSO降低了OxLDL誘導(dǎo)的p38磷酸化（圖4m），并且p38磷酸化在CD36⁺ CAFs中的富集顯著高于CD36敲除或陰性CAFs細(xì)胞（圖4n）。這些表明OxLDL通過(guò)CD36和脂質(zhì)過(guò)氧化促進(jìn)p38激活。在OxLDL存在時(shí)，p38抑制部分挽救了MIF的分泌（圖4o），表明OxLDL部分通過(guò)p38激活促進(jìn)MIF的分泌。

圖4CD36在CD36⁺ CAF中通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化/p38/CEBPs軸介導(dǎo)OxLDL攝取促進(jìn)MIF表達(dá)

7、CD36⁺ CAF來(lái)源的MIF通過(guò)激活I(lǐng)L-6/ STAT3增強(qiáng)MDSCs促進(jìn)免疫抑制性TME和腫瘤干性的能力

為確定來(lái)自腫瘤細(xì)胞或CD36⁺ CAFs的MIF是否介導(dǎo)CD33⁺ MDSC擴(kuò)增的調(diào)節(jié)，從人HBV相關(guān)或小鼠HCC腫瘤中分離出人或鼠CD36⁺ CAFs。采用CD36⁺ CAFs條件培養(yǎng)基（CD36⁺ CAFs-CM）、CD36 - CAFs、CD36^kd CAFs-CM、CD36⁺ CAFs +MIF抑制(ISO-1)或CD74阻斷處理MDSC前體細(xì)胞，檢測(cè)CD33⁺ MDSC比例（圖5a, b）。CD36⁺ CAFs-CM，MIF可增加CD33⁺ MDSCs的數(shù)量；與CD36^kd CAFs-CM類(lèi)似，CD36⁺ CAFs +ISO-1和CD36⁺ CAFs +CD74阻斷表現(xiàn)出良好的抑制效應(yīng)在CD33⁺ MDSC擴(kuò)增時(shí)（圖5c）。表明MIF分泌是CD36⁺ CAFs調(diào)節(jié)MDSC擴(kuò)張的關(guān)鍵中介。

在免疫正常小鼠的原位肝癌模型中，發(fā)現(xiàn)注射從小鼠肝癌腫瘤中分離的CD36+ CAFs顯著促進(jìn)肝癌腫瘤細(xì)胞在小鼠肝臟中的生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移，而這種促進(jìn)作用被特異性敲低CD36，抑制MIF或去除Gr-1+ MDSCs所抑制（圖5d, e）。此外，注射CD36⁺ CAFs顯著增加Treg的浸潤(rùn)，但減少腫瘤中效應(yīng)CD8+ T細(xì)胞，這種作用同樣被特異性敲低CD36，抑制MIF或去除Gr-1+ MDSCs所抑制（圖5f, g）。

為研究CD36⁺CAFs是否能通過(guò)iNOS信號(hào)調(diào)節(jié)MDSCs以增強(qiáng)其免疫抑制能力，從原代CD36⁺CAFs、CD33⁺MDSCs中收集CM，或分別從CD36⁺CAFs、CD36^kd CAFs、CD36⁺ CAFs +CD74的CM預(yù)處理的CD33⁺MDSCs的培養(yǎng)物中收集CM，評(píng)估iNOS的水平。結(jié)果顯示CD36⁺CAFs-MDSC-CM，而不是CD36^kd CAF-MDSC-CM或來(lái)自CD74或MDSC阻斷的細(xì)胞的CM，極大地促進(jìn)了MDSCs的iNOS的分泌（圖5h）。此外，共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)顯示，與MDSC-WT組相比，CD36⁺ CAFs+MDSC組的CD69⁺、IFNG⁺CD8⁺T細(xì)胞的比例明顯下調(diào)，但Tregs和PD1⁺CD8⁺T細(xì)胞的比例上調(diào)，而CD36⁺ CAFs+MDSC+ISO-1或CD74阻斷引起的影響輕微（圖5i, j）。表明CD36⁺ CAFs發(fā)揮免疫抑制作用是以CD36依賴(lài)的方式通過(guò)MIF/CD74/iNOS軸。

最后，為探索CD36⁺CAF衍生的MIF影響MDSCs的分子機(jī)制，對(duì)MDSC-MIF組和MDSC組進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。結(jié)果顯示，NF-κB信號(hào)通路被排在首位，其被報(bào)道可調(diào)節(jié)MDSCs的細(xì)胞因子分泌，在用CD36⁺CAF衍生的MIF預(yù)處理的MDSCs中被激活（圖5k, l）。此外，CD36⁺CAF處理的MDSCs中p65磷酸化顯著增加（圖5m），iNOS和IL-6的分泌也顯著增加（圖5n）。這些表明CD36⁺CAF促進(jìn)MDSCs是通過(guò)IL-6介導(dǎo)的。

圖5 CD36⁺CAF來(lái)源的MIF通過(guò)激活I(lǐng)L-6/ STAT3增強(qiáng)MDSCs促進(jìn)免疫抑制性TME和腫瘤干性的能力

8、在小鼠模型中靶向CD36協(xié)同免疫治療

為進(jìn)一步研究CD36⁺和MIF⁺CAFs是否在HCC啟動(dòng)中發(fā)揮作用，建立Cd36（Acta2^Cre;Cd36^fl/fl）和MIF（Acta2^Cre;Mif^fl/fl）條件性敲除的6周齡小鼠，確定Cd36或MIF在體內(nèi)被敲除時(shí)，HCC腫瘤負(fù)擔(dān)和MDSCs的比例明顯減少（圖6a-d），這表明CD36⁺CAFs參與HCC的啟動(dòng)。所以作者猜想CD36⁺CAFs可能與HCC患者的免疫治療有關(guān)。因此，首先調(diào)查了離體的HCC組織中的CD36⁺CAFs，這些患者接受了新輔助抗PD-1治療。結(jié)果顯示，抗PD-1反應(yīng)組的CD36和α-SMA共表達(dá)低于無(wú)反應(yīng)組，表明低數(shù)量的CD36⁺CAFs可以預(yù)測(cè)更好的HCC免疫治療反應(yīng)（圖6e，f）。然后，我們?cè)贑57/BJ6 CTNNB1^N90;Trp53^KO HCC模型和作者建立的抗PD1耐藥HCC中探索了單藥（CD36抑制劑或抗PD-1療法）和聯(lián)合治療策略（CD36抑制和抗PD-1療法）的療效。發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合治療在這些HCC小鼠模型中表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤療效（圖6g-k），并改變了抗腫瘤免疫的免疫格局，Tregs和MDSCs的比例下降，IFN-γ+和顆粒酶B⁺CD8⁺T細(xì)胞的比例增加（圖6l-m）。因此，腫瘤中低數(shù)量的CD36⁺CAFs可能預(yù)示著HCC有更好的免疫治療反應(yīng)，用SSO靶向CD36可以用來(lái)協(xié)同提高免疫治療的效果。

圖6CD36⁺ CAFs預(yù)測(cè)肝癌免疫治療的療效和靶向MIF與肝癌小鼠免疫治療的協(xié)同作用

參考文獻(xiàn)：

Zhu, GQ., Tang, Z., Huang, R. et al. CD36+ cancer-associated fibroblasts provide immunosuppressive microenvironment for hepatocellular carcinoma via secretion of macrophage migration inhibitory factor. Cell Discov 9, 25 (2023). https://doi.org/10.1038/s41421-023-00529-z