CD73抑制cGAS-STING并與CD39協(xié)同促進(jìn)胰腺癌
實(shí)驗(yàn)方法：MetaGx胰腺基因表達(dá)數(shù)據(jù)集采集，基因簽名，定量免疫熒光分析，ELISAs，Western blots，CD39 IHC分析，TILs的FACS分析，實(shí)時(shí)定量PCR，球體形成和OT-I活化試驗(yàn)，體外增殖試驗(yàn)，g-H2AX免疫熒光
外核苷酶CD39和CD73催化細(xì)胞外ATP產(chǎn)生免疫抑制腺苷，代表了潛在的癌癥靶點(diǎn)。我們通過臨床樣本和實(shí)驗(yàn)小鼠腫瘤研究CD39和CD73在胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)中的生物學(xué)影響。在人類PDAC樣本中，基質(zhì)CD39和腫瘤CD73的表達(dá)與較差的生存率顯著相關(guān)，并消除了與腫瘤浸潤C(jī)D8+ T細(xì)胞存在相關(guān)的有利預(yù)后影響。在小鼠移植的KPC腫瘤中，骨髓細(xì)胞上的CD39和CD73以及腫瘤細(xì)胞上的CD73均可促進(jìn)浸潤性骨髓細(xì)胞向M2樣表型極化，從而促進(jìn)腫瘤生長。腫瘤特異性CD8+ T細(xì)胞和胰腺星狀細(xì)胞上的CD39也抑制T細(xì)胞產(chǎn)生IFNg。雖然治療性抑制CD39或CD73在體內(nèi)顯著延緩腫瘤生長，但靶向這兩種外核苷酶顯示出明顯更好的抗腫瘤活性。CD73在人和小鼠PDAC腫瘤細(xì)胞上的表達(dá)也對吉西他濱和輻照誘導(dǎo)的DNA損傷具有保護(hù)作用。人類PDAC細(xì)胞系的大規(guī)模藥物基因組學(xué)分析揭示了CD73表達(dá)與吉西他濱化療耐藥之間的顯著關(guān)聯(lián)。CD73缺陷腫瘤細(xì)胞中DNA損傷的增加與cGAS-STING通路的激活有關(guān)。CD73抑制劑AB680的體內(nèi)抗腫瘤活性需要cGAS在小鼠KPC腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)。我們的研究闡明了CD73和CD39似乎合作促進(jìn)PDAC進(jìn)展的分子機(jī)制。
技術(shù)路線：
結(jié)果：
(1) 腫瘤CD73和間質(zhì)CD39都與PDAC的低生存率相關(guān)
為研究PDAC中腺苷通路對預(yù)后的影響，我們在12項(xiàng)獨(dú)立研究中對1200多名PDAC患者進(jìn)行了CD73和CD39的基因表達(dá)薈萃分析。CD73與較差的OS顯著相關(guān)(圖1A)。CD39總體上與較好的OS相關(guān)，盡管這在單個(gè)隊(duì)列中沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(補(bǔ)充圖未展示)。我們在兩個(gè)最大的隊(duì)列中探討了CD73和CD39之間的預(yù)后關(guān)聯(lián)。只有當(dāng)PDAC腫瘤同時(shí)具有高CD39表達(dá)時(shí)，才觀察到CD73與較差預(yù)后的關(guān)聯(lián)(圖1B)。兩個(gè)最大隊(duì)列的相關(guān)分析進(jìn)一步揭示了CD39基因表達(dá)與細(xì)胞毒性T細(xì)胞、Tregs和T細(xì)胞衰竭標(biāo)志物(即PDCD1、CTLA4、TIGIT、LAG3)之間的顯著正相關(guān)，而CD73則沒有顯著相關(guān)性(圖1C)。
我們研究了來自獨(dú)立隊(duì)列的PDAC手術(shù)樣本的上皮和間質(zhì)中CD73(圖2A)和CD39(圖2B)蛋白表達(dá)的組織學(xué)分布。與匹配的正常鄰近胰腺組織相比，CD73在PDAC腫瘤上皮中顯著上調(diào)，而在腫瘤間質(zhì)中表達(dá)微弱但顯著下調(diào)(圖2C)。CD39在PDAC腫瘤間質(zhì)中顯著上調(diào)(圖2D)。腫瘤上皮CD73與高分期和低分化PDAC腫瘤之間存在顯著關(guān)聯(lián)。而CD39與臨床病理特征之間無相關(guān)性。
生存分析顯示，更高的腫瘤上皮CD73表達(dá)(圖2E)和更高的腫瘤間質(zhì)CD39表達(dá)(圖2F)與PDAC患者更差的OS相關(guān)。在多變量分析中，當(dāng)調(diào)整術(shù)前CA 19-9、淋巴結(jié)狀態(tài)、分化和切除邊緣時(shí)，腫瘤上皮CD73表達(dá)與較差的OS相關(guān)。結(jié)合上皮CD73和間質(zhì)CD39表達(dá)的生存分析提供了進(jìn)一步的預(yù)后(補(bǔ)充圖未展示)。
圖1：CD73基因表達(dá)與PDAC預(yù)后不良相關(guān)
(2) CD73和CD39消除了腫瘤浸潤性CD8+ T細(xì)胞的良好預(yù)后影響
正如在其他PDAC隊(duì)列中所顯示的那樣，腫瘤浸潤性CD8+ T細(xì)胞的存在與OS改善相關(guān)(補(bǔ)充圖未展示)。支持我們的基因表達(dá)數(shù)據(jù)(圖1C)，CD39蛋白表達(dá)與CD8+ T細(xì)胞浸潤呈正相關(guān)，而CD73蛋白表達(dá)與腫瘤浸潤的CD8+ T細(xì)胞不相關(guān)(補(bǔ)充圖未展示)。我們研究了CD73或CD39表達(dá)是否影響PDAC免疫監(jiān)測。腫瘤上皮CD73(圖2G)或腫瘤間質(zhì)CD39(圖2H)的高表達(dá)完全取消了腫瘤浸潤性CD8+ T細(xì)胞在PDAC患者中的良好預(yù)后價(jià)值。
圖2：腫瘤CD73和間質(zhì)CD39蛋白表達(dá)與PDAC預(yù)后不良和免疫監(jiān)視抑制相關(guān)
(3) 可溶性CD73與更差的PDAC生存相關(guān)
由于CD73可以從細(xì)胞表面切割并以可溶性形式存在，我們評估了可溶性CD73 (sCD73)是否可以作為PDAC的無創(chuàng)預(yù)后生物標(biāo)志物。在一項(xiàng)獨(dú)立隊(duì)列研究中，良性或惡性胰腺腫瘤患者的sCD73水平明顯高于健康供體(圖2I)。PDAC患者較高的sCD73與較高的CA 19-9水平、位于胰腺頭部的腫瘤、較高的分期和淋巴血管侵犯相關(guān)(補(bǔ)充表未展示)。較高的sCD73也與較差的OS顯著相關(guān)(圖2J)。然而，在多變量分析中，sCD73沒有達(dá)到顯著性。我們評估了血清中sCD73是否可以作為PDAC腫瘤中CD73表達(dá)的替代指標(biāo)。在亞隊(duì)列中，未觀察到可溶性和腫瘤CD73水平之間的相關(guān)性。
(4) 腫瘤細(xì)胞和髓樣細(xì)胞上的CD73有利于小鼠PDAC中M2樣髓樣細(xì)胞的浸潤
我們利用Crispr/Cas9介導(dǎo)的基因缺失研究了腫瘤來源的CD73在小鼠KPC或人PANC1腫瘤細(xì)胞系中的作用。KPC和PANC1表達(dá)CD39為陰性(補(bǔ)充圖未展示)。在體外，腫瘤來源的CD73對腫瘤細(xì)胞增殖無影響(補(bǔ)充圖未展示)。腫瘤源性CD73的缺失顯著降低了KPC腫瘤在體內(nèi)的生長，并改善了吉西他濱活性(圖3A)。這與腫瘤IFNg水平的顯著增加以及IL10和精氨酸酶-1的微弱但顯著的增加相關(guān)(圖3B)。腫瘤源性CD73的缺失還顯著降低了KPC腫瘤中M2樣腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)和單核髓源性抑制細(xì)胞(M-MDSC)的浸潤和極化(圖3C)。靶向腫瘤來源的CD73對CD8、CD4或粒細(xì)胞(G)-MDSC浸潤沒有影響。由于CD73在KPC浸潤的髓細(xì)胞上表達(dá)，我們評估了髓源性CD73的作用。條件CD73fl/fl小鼠與LysMCre+/?小鼠(骨髓特異性CD73缺失)，并用CD73陰性的KPC腫瘤細(xì)胞攻擊。髓源性CD73顯著促進(jìn)KPC腫瘤生長(圖3D)，促進(jìn)M2樣TAMs的浸潤(圖3E)和M2極化。骨髓來源的CD73對腫瘤浸潤性CD8、CD4、M-MDSCs或G-MDSCs沒有影響(補(bǔ)充圖未展示)。
圖3：腫瘤細(xì)胞和骨髓細(xì)胞上的CD73促進(jìn)小鼠PDAC
(5) 骨髓細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和T細(xì)胞上的CD39抑制抗PDAC免疫反應(yīng)
我們研究了CD39的作用。由于髓系細(xì)胞是KPC腫瘤中CD39的主要來源，我們評估了在條狀CD39fl/fl LysMCre+/?用KPC腫瘤細(xì)胞攻擊小鼠。髓系細(xì)胞CD39缺失顯著降低KPC腫瘤生長(圖4A)和顯著減少M(fèi)2樣TAM浸潤(圖4B)。與我們在CD73中觀察到的情況相反，骨髓特異性缺失CD39還與腫瘤浸潤性CD8+ T細(xì)胞和CD4+Foxp3? T細(xì)胞(圖4C)。
我們評估了CD39在腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞和效應(yīng)CD8+ T細(xì)胞中的作用。我們使用體外球體培養(yǎng)物來測量T細(xì)胞的功能，球體培養(yǎng)物由表達(dá)OVA的KPC腫瘤細(xì)胞、原代胰腺星狀細(xì)胞(WT或CD39?/?)和OVA特異性CD8+ OT-I細(xì)胞(WT或CD39?/?；圖4D)。CD39?/? OT-I CD8+ T細(xì)胞，以及CD39?/?胰腺星狀成纖維細(xì)胞，每一種都顯著增加了OT-I效應(yīng)T細(xì)胞產(chǎn)生的IFNγ (圖4D)。
圖4：CD39與CD73協(xié)同促進(jìn)小鼠PDAC
(6) 靶向CD39和CD73增強(qiáng)吉西他濱抗小鼠PDAC的活性
我們評估了CD39是否代表針對PDAC的治療靶點(diǎn)。從第7天開始，用阻斷性單克隆抗小鼠CD39治療已建立的KPC腫瘤(>25 mm2)，每周3次，單獨(dú)或聯(lián)合吉西他濱(100 mg/kg，第7天和第10天)?？笴D39單藥治療顯著延緩了KPC腫瘤的生長，并顯著增強(qiáng)了吉西他濱對已建立腫瘤的活性(圖4E)。同樣，使用選擇性CD73抑制劑(即AB680)治療也顯著抑制了KPC腫瘤的生長，增強(qiáng)了吉西他濱的活性(圖4F)。
我們評估CD39和CD73是否具有冗余的致瘤作用。將KPC腫瘤注射到WT和CD39?/?用CD73抑制劑AB680聯(lián)合吉西他濱治療。與吉西他濱聯(lián)合靶向宿主來源的CD39進(jìn)一步增強(qiáng)了CD73抑制的治療活性(圖4G)。使用不同的KPC模型(即KPC 1199細(xì)胞)。用AB680、單克隆抗CD39或兩者同時(shí)治療的KPC-OVA腫瘤的免疫分析顯示，只有聯(lián)合抑制CD73和CD39才能顯著增加腫瘤特異性T細(xì)胞浸潤，并阻止PD-1衰竭標(biāo)志物的獲得(圖4H)。我們的結(jié)果揭示了CD73和CD39在促進(jìn)PDAC中的非冗余作用。
(7) 腫瘤來源的CD73保護(hù)DNA損傷并抑制cGAS-STING
由于PDAC細(xì)胞表達(dá)高CD73，但不表達(dá)CD39，我們研究了CD73是否以細(xì)胞自主的方式賦予PDAC腫瘤細(xì)胞增殖優(yōu)勢。CD73基因沉默在正常培養(yǎng)條件下對小鼠或人PDAC細(xì)胞的存活和增殖沒有影響。然而，在KPC或PANC1細(xì)胞中，CD73缺失顯著增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞對吉西他濱的體外敏感性(圖5A, B)。為了進(jìn)一步評估CD73在PDAC化療耐藥中的作用，我們在三個(gè)最大的藥物基因組學(xué)藥物篩選研究中確定CD73基因表達(dá)是否與吉西他濱敏感性相關(guān)。PDAC細(xì)胞系中CD73基因表達(dá)與吉西他濱反應(yīng)呈顯著負(fù)相關(guān)(C-index=0.62, P<0.001；圖5C)，由藥物劑量-反應(yīng)曲線上方的面積測量。與之一致的是，gH2AX染色顯示，吉西他濱治療CD73缺陷的KPC腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)了更大的DNA損傷(圖5D, E)。CD73表達(dá)的部分恢復(fù)恢復(fù)了表型并減少了DNA損傷(補(bǔ)充圖未展示)。在輻照反應(yīng)(圖5F)和用CD73抑制劑AB680處理的人PANC1腫瘤細(xì)胞(圖5G)中獲得了類似的結(jié)果。用選擇性激動(dòng)劑(BAY 60-6583)激活A(yù)2B受體恢復(fù)了這種表型，正如吉西他濱處理的PANC1在A2B受體激活(圖5G)和PKC細(xì)胞(圖5H)后DNA損傷顯著減少所揭示的那樣。
DNA傳感器cGAS可以通過產(chǎn)生cGAMP將DNA損傷與炎癥聯(lián)系起來，cGAMP反過來激活STING依賴基因轉(zhuǎn)錄。由于CD73表達(dá)可以保護(hù)PDAC細(xì)胞免受DNA損傷，我們研究了CD73是否可以抑制cGAS-STING的激活。與吉西他濱治療后CD73缺失的腫瘤細(xì)胞相比，CD73缺失的KPC細(xì)胞產(chǎn)生了顯著更高的cGAMP(圖5I)，表達(dá)了顯著更高的STING靶基因(圖5J)。這提示cGAS-STING通路可能在CD73抑制的治療活性中起作用。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，我們通過Crispr/Cas9從親本KPC細(xì)胞中刪除了cGAS，生成了一個(gè)由確認(rèn)cGAS-STING激活缺失的單個(gè)克隆組成的多克隆群體，并評估了AB680對cGAS缺失的KPC腫瘤和控制表達(dá)Cas9的KPC腫瘤的治療活性。腫瘤細(xì)胞中cGAS的缺失消除了AB680的體內(nèi)活性(圖5K)。使用基于shRNA的cGAS敲除也獲得了類似的結(jié)果(補(bǔ)充圖未展示)。我們的數(shù)據(jù)突出了CD73在調(diào)節(jié)cGAS-STING通路中的作用，并強(qiáng)調(diào)了腫瘤cGAS激活對CD73抑制劑治療活性的重要性。
圖5：CD73促進(jìn)DNA損傷修復(fù)并抑制cGAS-STING激活
結(jié)論：我們的研究支持進(jìn)一步評估CD39和CD73在PDAC中的生物學(xué)作用，作為免疫檢查點(diǎn)和對吉西他濱產(chǎn)生化學(xué)耐藥。我們證明CD39和CD73都與不良的臨床結(jié)果顯著相關(guān)，并抑制腫瘤對PDAC的免疫監(jiān)視。我們建議靶向CD39-CD73軸將有利于免疫冷腫瘤，如PDAC。
參考文獻(xiàn)：Jacoberger-Foissac, C., Cousineau, I., Bareche, Y., Allard, D., Chrobak, P., Allard, B., Pommey, S., Messaoudi, N., McNicoll, Y., Soucy, G., Koseoglu, S., Masia, R., Lake, A. C., Seo, H., Eeles, C. B., Rohatgi, N., Robson, S. C., Turcotte, S., Haibe-Kains, B., & Stagg, J. (2023). CD73 Inhibits cGAS-STING and Cooperates with CD39 to Promote Pancreatic Cancer. Cancer immunology research, 11(1), 56–71. https://doi.org/10.1158/2326-6066.CIR-22-0260.