線粒體代謝酶輸入缺陷引起異位代謝應(yīng)激
實(shí)驗(yàn)方法：蛋白表達(dá)與純化，質(zhì)粒構(gòu)建，免疫印跡，熒光顯微法，亞細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)，體內(nèi)泛素化實(shí)驗(yàn)，Pull-down分析，斑點(diǎn)試驗(yàn)，RNA sequencing，嘌呤霉素?fù)饺朐囼?yàn)，陽(yáng)離子代謝產(chǎn)物的LC-MS/MS分析，多核糖體分析
線粒體蛋白輸入缺陷與多種疾病相關(guān)。盡管非輸入的線粒體蛋白具有很大的聚集風(fēng)險(xiǎn)，但它們的積聚如何導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙仍不清楚。在這里，作者證明了非進(jìn)口的檸檬酸合成酶被泛素連接酶SCFUcc1靶向蛋白酶體降解。出乎意料的是，作者的結(jié)構(gòu)和遺傳分析表明，非輸入的檸檬酸合酶似乎在細(xì)胞質(zhì)中形成了酶活性構(gòu)象。它的過(guò)量積累引起檸檬酸鹽的異位合成，進(jìn)而導(dǎo)致糖的碳通量失衡，氨基酸和核苷酸庫(kù)減少，以及生長(zhǎng)缺陷。在這些條件下，翻譯抑制被誘導(dǎo)，并作為一種保護(hù)機(jī)制緩解了生長(zhǎng)缺陷。作者認(rèn)為，線粒體輸入失敗的后果并不局限于蛋白毒性損傷，而是非輸入性代謝酶的積累引發(fā)了異位代謝應(yīng)激。本研究于2023年4月發(fā)表在期刊《Science Advances》（IF：14.957）上。
技術(shù)路線：
主要研究結(jié)果：
1、F-box蛋白Ucc1識(shí)別檸檬酸合成酶相對(duì)微量但精細(xì)的結(jié)構(gòu)變化
為研究底物識(shí)別亞基Ucc1識(shí)別檸檬酸合成酶的機(jī)制，作者進(jìn)行了X射線晶體結(jié)構(gòu)分析。與常用的模擬底物蛋白的肽段不同，作者在2.30-?分辨率下成功確定了Ucc1-Skp1與全長(zhǎng)Cit2復(fù)合物的結(jié)構(gòu)（圖1A）。Skp1（殘基1 ~ 84和97 ~ 112）的N端區(qū)域的電子密度在該復(fù)合物中不可見(jiàn)（圖1A）。Cit2-Ucc1-Skp1復(fù)合物結(jié)構(gòu)包含1個(gè)Ucc1-Skp1復(fù)合物和1個(gè)Cit2二聚體（圖1A）。該四元復(fù)合物具有彎曲的結(jié)構(gòu)，其中Skp1和Cit2位于Ucc1的兩端。此外，Ucc1持有兩個(gè)Cit2分子中的一個(gè)（圖1A）。
在相互作用面上，Cit2中的H14和H20螺旋分別與Ucc1中的H9和H10螺旋相關(guān)聯(lián)，Cit2中的H6-H7 loop與Ucc1中的S10鏈相關(guān)聯(lián)（圖1B）。位于這些表面的殘基中，Cit2中的D154和E309分別與Ucc1中的K345和R184形成鹽橋，而Cit2中的E309和S409/S410分別與Ucc1中的Y185和E212形成氫鍵（圖1B）。含有D154A、E309A或S409A/S410A突變的Cit2突變體與Ucc1的結(jié)合減少（圖1C）。類似地，含有R184A/Y185A、E212A或K345A突變的Ucc1突變體與Cit2的結(jié)合減少（圖1D）。
Ucc1-Skp1-Cit2四元復(fù)合物中Cit2的結(jié)構(gòu)與圖1E中Cit2的開(kāi)放形式[Apo-Cit2（A）]幾乎完全一致。該形式不含其底物草酰乙酸（OAA）和乙酰輔酶A。作者還測(cè)定了Cit2與OAA和CoA形成復(fù)合物的閉合形式的晶體結(jié)構(gòu)。這里用CoA代替乙酰CoA，以防止結(jié)晶過(guò)程中的反應(yīng)。作者發(fā)現(xiàn)，在OAA和CoA存在下，Cit2發(fā)生了配體誘導(dǎo)的構(gòu)象變化，包括E309的移動(dòng)，導(dǎo)致Cit2中的E309與Ucc1中的Y185之間的氫鍵以及Cit2中的E309與Ucc1中的R184之間的鹽橋被破壞（圖S2A）。也許更關(guān)鍵的是，這種構(gòu)象變化還涉及Cit2中螺旋14的大量移動(dòng)，導(dǎo)致空間位阻，很可能阻止了Ucc1（圖S2 , A ~ C）的識(shí)別。Ucc1優(yōu)先識(shí)別開(kāi)放（無(wú)配體）形式的酶，而不識(shí)別閉合（有配體結(jié)合）形式的酶（圖S2D）。這些結(jié)果表明，與其他研究較多的F-box蛋白，如Fbw7、Cdc4、β-TrCP1和Skp2，發(fā)生的典型的degron介導(dǎo)的底物識(shí)別不同，Ucc1識(shí)別催化過(guò)程中底物結(jié)合引起的相對(duì)細(xì)微但精細(xì)的結(jié)構(gòu)變化。這是由于極性界面通過(guò)氫鍵和鹽橋相互補(bǔ)充的結(jié)果。此外，這些結(jié)果為之前提出的較高量的糖異生代謝物（如乙酰輔酶A和齊墩果酸）穩(wěn)定Cit2進(jìn)一步激活乙醛酸循環(huán)的正反饋環(huán)路提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
圖1 Ucc1-Skp1復(fù)合物識(shí)別檸檬酸合酶的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)
圖S2 配體誘導(dǎo)的Cit2構(gòu)象變化阻止了它識(shí)別Ucc1
2、非進(jìn)口線粒體檸檬酸合成酶是被SCFUcc1泛素連接酶復(fù)合物蛋白酶體降解的靶標(biāo)
作者解析Apo-Cit1的晶體結(jié)構(gòu)，與Apo-Cit2的晶體結(jié)構(gòu)基本一致（圖2A）。因此，作者推斷胞質(zhì)中未導(dǎo)入的Cit1也可以通過(guò)SCFUcc1靶向蛋白酶體降解。為驗(yàn)證假設(shè)，作者首先構(gòu)建一個(gè)缺少第2至第42位氨基酸的Cit1突變體，該區(qū)域含有N端線粒體靶向序列（以下作者稱該突變體為NDCit1）（圖2B-C）。綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記的NDCit1定位在細(xì)胞質(zhì)中（圖2D）。亞細(xì)胞定位分析進(jìn)一步證實(shí)了NDCit1的細(xì)胞質(zhì)定位（圖2D）。為評(píng)估NDCit1的穩(wěn)定性，作者進(jìn)行放線菌酮追逐實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)NDCit1被降解，半衰期約為45 min，但加入蛋白酶體抑制劑MG132后，NDCit1被穩(wěn)定（圖2E）。作者還發(fā)現(xiàn)，在溫度敏感的cdc34-2、cdc53-1和skp1-11突變細(xì)胞以及Ucc1缺失的細(xì)胞中，NDCit1降解減弱（圖2F-G）。此外，NDCit1在體內(nèi)以Ucc1依賴的方式被泛素化，而不是線粒體形式的成熟Cit1（mtCit1）（圖2H）。這些結(jié)果表明NDCit1被SCFUcc1泛素化降解。
接下來(lái)，作者利用pull-down實(shí)驗(yàn)分析Ucc1與NDCit1之間的物理相互作用。將裝載有重組3x FLAG-Ucc1-Skp1復(fù)合物的抗FLAG親和凝膠與表達(dá)血凝素（HA）標(biāo)記的Cit1或NDCit1細(xì)胞制備的酵母裂解液中孵育。如圖2I所示，NDCit1與3xFLAG-Ucc1-Skp1復(fù)合物結(jié)合（泳道3）。用純化的重組麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）標(biāo)記的Cit1和Ucc1-Skp1復(fù)合物的pull-down實(shí)驗(yàn)證實(shí)了直接結(jié)合（圖2J ,泳道9）。此外，純化的MBP-Cit2與Ucc1-Skp1復(fù)合物的直接結(jié)合在同一實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)（泳道10）。作者注意到，當(dāng)使用含有Cit1的全細(xì)胞裂解液進(jìn)行基于裂解液的pull-down實(shí)驗(yàn)時(shí)，Cit1的成熟線粒體形式（mtCit1）被3xFLAG-Ucc1-Skp1復(fù)合物拉下（圖2I ,泳道1 ,中間面板較快遷移帶）。這一發(fā)現(xiàn)很可能是由于去垢劑誘導(dǎo)mtCit1從線粒體基質(zhì)中溶解到裂解液中，并隨后與Ucc1結(jié)合。值得注意的是，盡管它在全細(xì)胞裂解液中幾乎檢測(cè)不到，但與含有導(dǎo)肽的Cit1前體形式（preCit1）相對(duì)應(yīng)的較慢遷移帶也被3xFLAGUcc1-Skp1復(fù)合物拉下富集。這一結(jié)果提出preCit1也可以被SCFUcc1復(fù)合體識(shí)別降解的有趣可能性。
盡管Skp1-Ucc1-Cit1復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)目前尚不清楚，但作者發(fā)現(xiàn)Cit2中預(yù)測(cè)對(duì)Ucc1結(jié)合至關(guān)重要的氨基酸殘基在Cit1中是保守的（圖3A）。當(dāng)NDCit1的D173和S429分別與Cit2的D154和S410同時(shí)突變?yōu)楸彼釙r(shí)，突變體（以下簡(jiǎn)稱NDCit1-DS/AA）不再被Ucc1識(shí)別并泛素化。與這些結(jié)果一致，放線菌酮追趕實(shí)驗(yàn)證明NDCit1-DS/AA在野生型（WT）細(xì)胞中的穩(wěn)定性與NDCit1在ucc1D細(xì)胞（5 ~ 8車道）中的穩(wěn)定性相同（圖3D , 17 ~ 20車道）。這些結(jié)果表明，前序列缺失的非輸入型Cit1（NDCit1）被SCFUcc1復(fù)合體識(shí)別并泛素化降解。此外，作者的研究結(jié)果還表明Ucc1似乎可以識(shí)別折疊的檸檬酸合酶，因?yàn)閷?duì)Ucc1結(jié)合至關(guān)重要的氨基酸殘基在三維結(jié)構(gòu)中組裝在同一表面上，盡管它們位于初級(jí)序列的較遠(yuǎn)位置（圖2）。
圖2 NDCit1被蛋白酶體以依賴于SCFUcc1泛素連接酶的方式降解
圖3 Ucc1通過(guò)其保守的氨基酸識(shí)別折疊的檸檬酸合酶
3、NΔCit1毒性取決于酶的活性
為檢驗(yàn)SCFUcc1介導(dǎo)的非輸入性Cit1降解的生理意義，作者分析NDCit1在細(xì)胞質(zhì)中積累的細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。細(xì)胞過(guò)表達(dá)NDCit1在GAL1啟動(dòng)子控制下的生長(zhǎng)速度略慢于攜帶空質(zhì)粒的對(duì)照細(xì)胞（圖4A）。當(dāng)UCC1被刪除時(shí)，NDCit1的表達(dá)加劇或DS/AA突變引入NDCit1（圖4A-B），表明毒性是劑量依賴性的。相比之下，過(guò)表達(dá)WT Cit1的細(xì)胞無(wú)論是否存在Ucc1或DS/AA突變（圖4A），其生長(zhǎng)速度均與對(duì)照細(xì)胞相當(dāng)，表明NDCit1和Cit2作為胞質(zhì)中的酶沒(méi)有實(shí)質(zhì)性差異。
由于作者的結(jié)構(gòu)分析表明Ucc1只識(shí)別折疊的檸檬酸合成酶，作者假設(shè)NDCit1在細(xì)胞質(zhì)中形成酶活性構(gòu)象。作者通過(guò)直接測(cè)量細(xì)胞的檸檬酸證實(shí)NDCit1的檸檬酸合成酶活性（圖4C, line3）。此外，表達(dá)NDCit1的ucc1D細(xì)胞或表達(dá)NDCit1-DS/AA的WT細(xì)胞比WT細(xì)胞或表達(dá)NDCit1的細(xì)胞積累了更多的檸檬酸（圖4C）。相比之下，當(dāng)對(duì)檸檬酸合成酶活性至關(guān)重要的組氨酸312突變?yōu)楦拾彼釙r(shí)，NDCit1和NDCit1-DS/AA的檸檬酸合成酶活性幾乎被消除（圖4C）。此外，H/G突變消除了NDCit1或NDCit1-DS/AA積累導(dǎo)致的生長(zhǎng)缺陷表型（圖4B），表明NDCit1毒性來(lái)源于酶活性。值得注意的是，H/G突變并不影響NDCit1和NDCit1-DS/AA變體的半衰期（圖3D），表明較低的檸檬酸水平和生長(zhǎng)缺陷表型的消除并不是由于蛋白水平的降低。作者還注意到NDCit1及其變體在細(xì)胞內(nèi)是可溶性的，沒(méi)有形成不溶性的聚集體（圖4D）?？傊?，這些結(jié)果表明異位積累的檸檬酸合成酶的細(xì)胞毒性取決于其酶活性（圖4E）。
有趣的是，與表達(dá)NDCit1的細(xì)胞相比，表達(dá)Cit1的細(xì)胞表現(xiàn)出更低的檸檬酸水平，其中大部分Cit1被導(dǎo)入到線粒體中成為成熟形式（mtCit1）（圖4C，比較品系2 ~ 3和品系6 ~ 7）。這很可能是因?yàn)?/span>mtCit1在線粒體中產(chǎn)生的檸檬酸可能被TCA循環(huán)中的酶迅速消耗，而NDCit1產(chǎn)生的檸檬酸可能被消耗的程度較小。作者注意到，在釀酒酵母中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)三磷酸腺苷檸檬酸裂解酶，它將檸檬酸裂解為乙酰輔酶A和齊墩果酸。也有可能調(diào)節(jié)mtCit1活性的線粒體組分的可用性可能被限制在胞質(zhì)中。
圖4 積聚在細(xì)胞質(zhì)中NDCit1以酶活性依賴的方式對(duì)細(xì)胞有毒
4、preCit1的毒性取決于酶的活性
到目前為止，作者的研究是基于一個(gè)缺乏線粒體靶向序列的突變體（圖5A，左），這個(gè)元素將保留在由線粒體輸入失敗引起的真正錯(cuò)定位的蛋白質(zhì)中。為研究含序列Cit1的穩(wěn)定性，作者使用一個(gè)tom40-97溫度敏感突變體（圖5A，右）。當(dāng)Cit1在tom40-97細(xì)胞中過(guò)表達(dá)時(shí)，preCit1會(huì)積累（圖5B，lane1），并隨著時(shí)間的推移而降解（lane 1-4）由于對(duì)該菌株進(jìn)行遺傳操作的未知難度，作者發(fā)現(xiàn)preCit1-ds/AA是穩(wěn)定的（圖5B，lane 5-12），這表明preCit1的降解取決于Ucc1。作者注意到在Tom40-97細(xì)胞中積累的Hsp60的前體形式在追趕期保持不變（圖5B）。這一觀察強(qiáng)調(diào)前體蛋白質(zhì)量控制的特異性。
接下來(lái)，作者使用這種交替系統(tǒng)研究積累preCit1是否也具有毒性，毒性取決于酶活性。當(dāng)Cit1在GAL1啟動(dòng)子的調(diào)控下過(guò)表達(dá)時(shí)，tom40-97細(xì)胞在允許溫度26℃和限制溫度35℃的條件下幾乎和含有空質(zhì)粒的對(duì)照細(xì)胞一樣生長(zhǎng)（圖5C，第6、7行）。然而，在35℃條件下，表達(dá)Cit1-DS/AA的tom40-97細(xì)胞逃避Ucc1介導(dǎo)的降解，生長(zhǎng)速度比空質(zhì)粒的細(xì)胞慢（圖5C第6、8行）。在半允許溫度30℃的液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)也觀察到類似的趨勢(shì)（圖5D-E）。通過(guò)引入消除活性（圖5C，5E）的H/G突變，消除了表達(dá)Cit1-DS/AA的tom40-97酵母的生長(zhǎng)缺陷表型。與這些結(jié)果一致，表達(dá)Cit1-DS/AA的tom40-97細(xì)胞中檸檬酸鹽的水平高于表達(dá)Cit1或Cit1-DS/AA-H/G的tom40-97細(xì)胞（圖5F）。這一數(shù)據(jù)表明，從純內(nèi)源位點(diǎn)表達(dá)的preCit1在導(dǎo)入失敗時(shí)積累在細(xì)胞質(zhì)中時(shí)可以表現(xiàn)出酶活性。
由于Ucc1識(shí)別折疊的檸檬酸合成酶（圖1-3），非導(dǎo)入的preCit1被Ucc1識(shí)別并靶向降解的事實(shí)表明preCit1很可能折疊成類似于NDCit1的三維構(gòu)象，在胞質(zhì)中具有催化活性，盡管需要進(jìn)一步的分析來(lái)充分證明preCit1在體內(nèi)胞質(zhì)中是否形成二聚體。preCit1-DS/AA可溶的觀察結(jié)果支持了這一觀點(diǎn)（圖5G）。此外，酶活性檸檬酸合成酶在胞質(zhì)中的積累比在線粒體中的毒性更大（圖4）。基于這些結(jié)果，作者提出表達(dá)Cit1-DS/AA的tom40-97細(xì)胞的生長(zhǎng)缺陷（圖5C-E）可歸因于非導(dǎo)入的preCit1在胞內(nèi)合成檸檬酸鹽。
當(dāng)這些細(xì)胞在只含有必需氨基酸的合成“最小”培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，表達(dá)WT Cit1的細(xì)胞比表達(dá)Cit1-ds/AA的細(xì)胞表現(xiàn)出更低的適應(yīng)度（圖5M），這表明適度的preCit1積累可以根據(jù)環(huán)境增加或降低細(xì)胞適應(yīng)度。這些結(jié)果進(jìn)一步支持了作者的觀點(diǎn)，即在導(dǎo)入失敗時(shí)積聚在細(xì)胞質(zhì)中的preCit1表現(xiàn)出酶活性并影響細(xì)胞活性。
圖5 preCit1的積累以酶活性依賴的方式對(duì)細(xì)胞有毒
5、異位檸檬酸鹽合成引發(fā)代謝失衡
作者的數(shù)據(jù)表明，非輸入Cit1的異位檸檬酸鹽合成代表一種代謝擾動(dòng)形式，可能模仿線粒體輸入失敗的后果。為全面評(píng)估胞質(zhì)檸檬酸鹽合成對(duì)代謝的影響，作者比較表達(dá)NDCit1-DS/AA和NDCit1-DS/AA-h/G的WT細(xì)胞（圖6A）和表達(dá)Cit1的tom40-97細(xì)胞的代謝組學(xué)特征DS/AA和Cit1-DS/AA-h/G（圖6A）。為此，分別采用液相色譜-質(zhì)譜法（LCMS）和離子色譜-質(zhì)譜法（IC-MS）對(duì)陽(yáng)離子代謝物和陰離子代謝物進(jìn)行了全面定量。作者從圖4C和5F中發(fā)現(xiàn)，在這兩種情況下，檸檬酸鹽的積累都很明顯，導(dǎo)致各種代謝物的波動(dòng)（圖6B）。累積的檸檬酸池的大小明顯大于TCA循環(huán)中其他有機(jī)酸的大?。▓D6C）。由于檸檬酸來(lái)源于碳水化合物代謝，作者在給藥后24小時(shí)評(píng)估13C流入檸檬酸池。作者發(fā)現(xiàn)大量糖源性13C被納入檸檬酸池（圖6D）。基于這些結(jié)果，作者得出結(jié)論，碳水化合物的通量主要指向檸檬酸鹽池。碳水化合物池的重新連接可能會(huì)影響糖衍生的其他代謝物的產(chǎn)生，因?yàn)榘|(zhì)檸檬酸鹽的合成擾亂了正常的碳通量，通過(guò)這種碳通量，己糖被氧化并最終在線粒體中轉(zhuǎn)化為二氧化碳。途徑分析表明，除TCA和GL外，許多氨基酸和核苷酸代謝途徑受到影響。有趣的是，在積累NDCit1的WT細(xì)胞和積累preCit1的tom40-97細(xì)胞中，觀察到天冬氨酸顯著減少，谷氨酰胺和谷氨酸顯著增加（圖6F）。由于這些氨基酸用于核苷酸的從頭合成，因此預(yù)測(cè)觀察到的氨基酸失衡會(huì)影響核酸代謝，核苷酸和脫氧核苷酸水平確實(shí)會(huì)下降（圖6G）。異位檸檬酸合成可能導(dǎo)致不同種類代謝物的減少和增加，破壞全球代謝平衡。
盡管如此，胞內(nèi)檸檬酸的保留似乎會(huì)減弱糖基天冬氨酸的產(chǎn)生，而天冬氨酸缺乏可能會(huì)損害核苷酸的產(chǎn)生。相比之下，谷氨酸和谷氨酰胺的水平升高，支持了這一解釋。因此，胞質(zhì)檸檬酸鹽合成可能通過(guò)碳通量從糖轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致氨基酸失衡和嘌呤/嘧啶核苷酸減少（圖6H）。
圖6 異位檸檬酸鹽合成引發(fā)代謝失衡
6、翻譯抑制減輕生長(zhǎng)缺陷的錯(cuò)誤定位的檸檬酸鹽周轉(zhuǎn)
為廣泛地研究細(xì)胞對(duì)異位檸檬酸合成的反應(yīng)，作者對(duì)表達(dá)NDCit1-DS/AA或NDCit1-DS/AA-H/G的細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)中檸檬酸的合成改變超過(guò)2600個(gè)編碼基因的轉(zhuǎn)錄本水平。編碼翻譯、核糖體生物合成、核糖體RNA加工和核糖體組裝的mRNA顯著下調(diào)（圖7A）。因此，作者進(jìn)行嘌呤霉素?fù)饺雽?shí)驗(yàn)來(lái)直接評(píng)估翻譯效率。嘌呤霉素是一種鏈終止劑，嵌入生長(zhǎng)的新生多肽鏈中，可以使用抗嘌呤霉素抗體進(jìn)行WB檢測(cè)。表達(dá)NDCit1-DS/AA（圖7B，lane 2）的細(xì)胞嘌呤霉素?fù)饺胄实陀诒磉_(dá)NDCit1-DS/AA-H/G的細(xì)胞（lane 4）。用放線菌酮預(yù)處理細(xì)胞阻斷嘌呤霉素?fù)饺耄?/span>lane 1，3），證實(shí)新合成蛋白的檢測(cè)。這一結(jié)果表明胞質(zhì)檸檬酸的合成降低了翻譯效率。為證實(shí)這一發(fā)現(xiàn)，作者還進(jìn)行多聚體分離實(shí)驗(yàn)，其中檢測(cè)到單聚體和多聚核糖體的相對(duì)含量。作者發(fā)現(xiàn)在表達(dá)NDCit1-DS/AA的細(xì)胞中，相對(duì)單體多聚體比例高于表達(dá)NDCit1-DS/AA-H/G的細(xì)胞（圖7C）。
最后，作者檢測(cè)翻譯抑制是否在緩解細(xì)胞功能障礙中發(fā)揮保護(hù)作用。為此，作者刪除了產(chǎn)物具有部分重疊功能的DOT6和TOD6基因，以抑制雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體1和環(huán)磷酸腺苷依賴的蛋白激酶通路下游的核糖體生物合成基因的表達(dá)。如圖7D所示，如前所述，NDCit1-DS/AA的過(guò)表達(dá)減緩了WT細(xì)胞以及dot6D細(xì)胞和tod6D細(xì)胞的生長(zhǎng)（圖4B）。當(dāng)DOT6和TOD6同時(shí)缺失（dot6Dtod6D）時(shí)，生長(zhǎng)缺陷被夸大。相反，當(dāng)表達(dá)H/G突變的NDCit1-DS/AA時(shí)，即使在dot6Dtod6D細(xì)胞中，細(xì)胞生長(zhǎng)也不受影響。當(dāng)在液體培養(yǎng)基中分析生長(zhǎng)表型時(shí)，觀察到類似的趨勢(shì)（圖7E）。這些結(jié)果表明翻譯抑制對(duì)異位檸檬酸鹽合成有保護(hù)作用。線粒體輸入失敗不僅會(huì)引起蛋白質(zhì)毒性損傷，還會(huì)引發(fā)異位代謝應(yīng)激（圖7F）。
圖7 翻譯抑制保護(hù)細(xì)胞在異位檸檬酸應(yīng)激
參考文獻(xiàn)
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