線粒體代謝酶輸入缺陷引起異位代謝應(yīng)激
實(shí)驗(yàn)方法：蛋白表達(dá)與純化，質(zhì)粒構(gòu)建，免疫印跡，熒光顯微法，亞細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)，體內(nèi)泛素化實(shí)驗(yàn)，Pull-down分析，斑點(diǎn)試驗(yàn)，RNA sequencing，嘌呤霉素?fù)饺朐囼?yàn)，陽離子代謝產(chǎn)物的LC-MS/MS分析，多核糖體分析
線粒體蛋白輸入缺陷與多種疾病相關(guān)。盡管非輸入的線粒體蛋白具有很大的聚集風(fēng)險(xiǎn)，但它們的積聚如何導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙仍不清楚。在這里，作者證明了非進(jìn)口的檸檬酸合成酶被泛素連接酶SCFUcc1靶向蛋白酶體降解。出乎意料的是，作者的結(jié)構(gòu)和遺傳分析表明，非輸入的檸檬酸合酶似乎在細(xì)胞質(zhì)中形成了酶活性構(gòu)象。它的過量積累引起檸檬酸鹽的異位合成，進(jìn)而導(dǎo)致糖的碳通量失衡，氨基酸和核苷酸庫減少，以及生長缺陷。在這些條件下，翻譯抑制被誘導(dǎo)，并作為一種保護(hù)機(jī)制緩解了生長缺陷。作者認(rèn)為，線粒體輸入失敗的后果并不局限于蛋白毒性損傷，而是非輸入性代謝酶的積累引發(fā)了異位代謝應(yīng)激。本研究于2023年4月發(fā)表在期刊《Science Advances》（IF：14.957）上。
技術(shù)路線：
主要研究結(jié)果：
1、F-box蛋白Ucc1識(shí)別檸檬酸合成酶相對(duì)微量但精細(xì)的結(jié)構(gòu)變化
為研究底物識(shí)別亞基Ucc1識(shí)別檸檬酸合成酶的機(jī)制，作者進(jìn)行了X射線晶體結(jié)構(gòu)分析。與常用的模擬底物蛋白的肽段不同，作者在2.30-?分辨率下成功確定了Ucc1-Skp1與全長Cit2復(fù)合物的結(jié)構(gòu)（圖1A）。Skp1（殘基1 ~ 84和97 ~ 112）的N端區(qū)域的電子密度在該復(fù)合物中不可見（圖1A）。Cit2-Ucc1-Skp1復(fù)合物結(jié)構(gòu)包含1個(gè)Ucc1-Skp1復(fù)合物和1個(gè)Cit2二聚體（圖1A）。該四元復(fù)合物具有彎曲的結(jié)構(gòu)，其中Skp1和Cit2位于Ucc1的兩端。此外，Ucc1持有兩個(gè)Cit2分子中的一個(gè)（圖1A）。
在相互作用面上，Cit2中的H14和H20螺旋分別與Ucc1中的H9和H10螺旋相關(guān)聯(lián)，Cit2中的H6-H7 loop與Ucc1中的S10鏈相關(guān)聯(lián)（圖1B）。位于這些表面的殘基中，Cit2中的D154和E309分別與Ucc1中的K345和R184形成鹽橋，而Cit2中的E309和S409/S410分別與Ucc1中的Y185和E212形成氫鍵（圖1B）。含有D154A、E309A或S409A/S410A突變的Cit2突變體與Ucc1的結(jié)合減少（圖1C）。類似地，含有R184A/Y185A、E212A或K345A突變的Ucc1突變體與Cit2的結(jié)合減少（圖1D）。
Ucc1-Skp1-Cit2四元復(fù)合物中Cit2的結(jié)構(gòu)與圖1E中Cit2的開放形式[Apo-Cit2（A）]幾乎完全一致。該形式不含其底物草酰乙酸（OAA）和乙酰輔酶A。作者還測定了Cit2與OAA和CoA形成復(fù)合物的閉合形式的晶體結(jié)構(gòu)。這里用CoA代替乙酰CoA，以防止結(jié)晶過程中的反應(yīng)。作者發(fā)現(xiàn)，在OAA和CoA存在下，Cit2發(fā)生了配體誘導(dǎo)的構(gòu)象變化，包括E309的移動(dòng)，導(dǎo)致Cit2中的E309與Ucc1中的Y185之間的氫鍵以及Cit2中的E309與Ucc1中的R184之間的鹽橋被破壞（圖S2A）。也許更關(guān)鍵的是，這種構(gòu)象變化還涉及Cit2中螺旋14的大量移動(dòng)，導(dǎo)致空間位阻，很可能阻止了Ucc1（圖S2 , A ~ C）的識(shí)別。Ucc1優(yōu)先識(shí)別開放（無配體）形式的酶，而不識(shí)別閉合（有配體結(jié)合）形式的酶（圖S2D）。這些結(jié)果表明，與其他研究較多的F-box蛋白，如Fbw7、Cdc4、β-TrCP1和Skp2，發(fā)生的典型的degron介導(dǎo)的底物識(shí)別不同，Ucc1識(shí)別催化過程中底物結(jié)合引起的相對(duì)細(xì)微但精細(xì)的結(jié)構(gòu)變化。這是由于極性界面通過氫鍵和鹽橋相互補(bǔ)充的結(jié)果。此外，這些結(jié)果為之前提出的較高量的糖異生代謝物（如乙酰輔酶A和齊墩果酸）穩(wěn)定Cit2進(jìn)一步激活乙醛酸循環(huán)的正反饋環(huán)路提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
圖1 Ucc1-Skp1復(fù)合物識(shí)別檸檬酸合酶的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)
圖S2 配體誘導(dǎo)的Cit2構(gòu)象變化阻止了它識(shí)別Ucc1
2、非進(jìn)口線粒體檸檬酸合成酶是被SCFUcc1泛素連接酶復(fù)合物蛋白酶體降解的靶標(biāo)
作者解析Apo-Cit1的晶體結(jié)構(gòu)，與Apo-Cit2的晶體結(jié)構(gòu)基本一致（圖2A）。因此，作者推斷胞質(zhì)中未導(dǎo)入的Cit1也可以通過SCFUcc1靶向蛋白酶體降解。為驗(yàn)證假設(shè)，作者首先構(gòu)建一個(gè)缺少第2至第42位氨基酸的Cit1突變體，該區(qū)域含有N端線粒體靶向序列（以下作者稱該突變體為NDCit1）（圖2B-C）。綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記的NDCit1定位在細(xì)胞質(zhì)中（圖2D）。亞細(xì)胞定位分析進(jìn)一步證實(shí)了NDCit1的細(xì)胞質(zhì)定位（圖2D）。為評(píng)估NDCit1的穩(wěn)定性，作者進(jìn)行放線菌酮追逐實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)NDCit1被降解，半衰期約為45 min，但加入蛋白酶體抑制劑MG132后，NDCit1被穩(wěn)定（圖2E）。作者還發(fā)現(xiàn)，在溫度敏感的cdc34-2、cdc53-1和skp1-11突變細(xì)胞以及Ucc1缺失的細(xì)胞中，NDCit1降解減弱（圖2F-G）。此外，NDCit1在體內(nèi)以Ucc1依賴的方式被泛素化，而不是線粒體形式的成熟Cit1（mtCit1）（圖2H）。這些結(jié)果表明NDCit1被SCFUcc1泛素化降解。
接下來，作者利用pull-down實(shí)驗(yàn)分析Ucc1與NDCit1之間的物理相互作用。將裝載有重組3x FLAG-Ucc1-Skp1復(fù)合物的抗FLAG親和凝膠與表達(dá)血凝素（HA）標(biāo)記的Cit1或NDCit1細(xì)胞制備的酵母裂解液中孵育。如圖2I所示，NDCit1與3xFLAG-Ucc1-Skp1復(fù)合物結(jié)合（泳道3）。用純化的重組麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）標(biāo)記的Cit1和Ucc1-Skp1復(fù)合物的pull-down實(shí)驗(yàn)證實(shí)了直接結(jié)合（圖2J ,泳道9）。此外，純化的MBP-Cit2與Ucc1-Skp1復(fù)合物的直接結(jié)合在同一實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)（泳道10）。作者注意到，當(dāng)使用含有Cit1的全細(xì)胞裂解液進(jìn)行基于裂解液的pull-down實(shí)驗(yàn)時(shí)，Cit1的成熟線粒體形式（mtCit1）被3xFLAG-Ucc1-Skp1復(fù)合物拉下（圖2I ,泳道1 ,中間面板較快遷移帶）。這一發(fā)現(xiàn)很可能是由于去垢劑誘導(dǎo)mtCit1從線粒體基質(zhì)中溶解到裂解液中，并隨后與Ucc1結(jié)合。值得注意的是，盡管它在全細(xì)胞裂解液中幾乎檢測不到，但與含有導(dǎo)肽的Cit1前體形式（preCit1）相對(duì)應(yīng)的較慢遷移帶也被3xFLAGUcc1-Skp1復(fù)合物拉下富集。這一結(jié)果提出preCit1也可以被SCFUcc1復(fù)合體識(shí)別降解的有趣可能性。
盡管Skp1-Ucc1-Cit1復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)目前尚不清楚，但作者發(fā)現(xiàn)Cit2中預(yù)測對(duì)Ucc1結(jié)合至關(guān)重要的氨基酸殘基在Cit1中是保守的（圖3A）。當(dāng)NDCit1的D173和S429分別與Cit2的D154和S410同時(shí)突變?yōu)楸彼釙r(shí)，突變體（以下簡稱NDCit1-DS/AA）不再被Ucc1識(shí)別并泛素化。與這些結(jié)果一致，放線菌酮追趕實(shí)驗(yàn)證明NDCit1-DS/AA在野生型（WT）細(xì)胞中的穩(wěn)定性與NDCit1在ucc1D細(xì)胞（5 ~ 8車道）中的穩(wěn)定性相同（圖3D , 17 ~ 20車道）。這些結(jié)果表明，前序列缺失的非輸入型Cit1（NDCit1）被SCFUcc1復(fù)合體識(shí)別并泛素化降解。此外，作者的研究結(jié)果還表明Ucc1似乎可以識(shí)別折疊的檸檬酸合酶，因?yàn)閷?duì)Ucc1結(jié)合至關(guān)重要的氨基酸殘基在三維結(jié)構(gòu)中組裝在同一表面上，盡管它們位于初級(jí)序列的較遠(yuǎn)位置（圖2）。
圖2 NDCit1被蛋白酶體以依賴于SCFUcc1泛素連接酶的方式降解
圖3 Ucc1通過其保守的氨基酸識(shí)別折疊的檸檬酸合酶
3、NΔCit1毒性取決于酶的活性
為檢驗(yàn)SCFUcc1介導(dǎo)的非輸入性Cit1降解的生理意義，作者分析NDCit1在細(xì)胞質(zhì)中積累的細(xì)胞的生長情況。細(xì)胞過表達(dá)NDCit1在GAL1啟動(dòng)子控制下的生長速度略慢于攜帶空質(zhì)粒的對(duì)照細(xì)胞（圖4A）。當(dāng)UCC1被刪除時(shí)，NDCit1的表達(dá)加劇或DS/AA突變引入NDCit1（圖4A-B），表明毒性是劑量依賴性的。相比之下，過表達(dá)WT Cit1的細(xì)胞無論是否存在Ucc1或DS/AA突變（圖4A），其生長速度均與對(duì)照細(xì)胞相當(dāng)，表明NDCit1和Cit2作為胞質(zhì)中的酶沒有實(shí)質(zhì)性差異。
由于作者的結(jié)構(gòu)分析表明Ucc1只識(shí)別折疊的檸檬酸合成酶，作者假設(shè)NDCit1在細(xì)胞質(zhì)中形成酶活性構(gòu)象。作者通過直接測量細(xì)胞的檸檬酸證實(shí)NDCit1的檸檬酸合成酶活性（圖4C, line3）。此外，表達(dá)NDCit1的ucc1D細(xì)胞或表達(dá)NDCit1-DS/AA的WT細(xì)胞比WT細(xì)胞或表達(dá)NDCit1的細(xì)胞積累了更多的檸檬酸（圖4C）。相比之下，當(dāng)對(duì)檸檬酸合成酶活性至關(guān)重要的組氨酸312突變?yōu)楦拾彼釙r(shí)，NDCit1和NDCit1-DS/AA的檸檬酸合成酶活性幾乎被消除（圖4C）。此外，H/G突變消除了NDCit1或NDCit1-DS/AA積累導(dǎo)致的生長缺陷表型（圖4B），表明NDCit1毒性來源于酶活性。值得注意的是，H/G突變并不影響NDCit1和NDCit1-DS/AA變體的半衰期（圖3D），表明較低的檸檬酸水平和生長缺陷表型的消除并不是由于蛋白水平的降低。作者還注意到NDCit1及其變體在細(xì)胞內(nèi)是可溶性的，沒有形成不溶性的聚集體（圖4D）?？傊?，這些結(jié)果表明異位積累的檸檬酸合成酶的細(xì)胞毒性取決于其酶活性（圖4E）。
有趣的是，與表達(dá)NDCit1的細(xì)胞相比，表達(dá)Cit1的細(xì)胞表現(xiàn)出更低的檸檬酸水平，其中大部分Cit1被導(dǎo)入到線粒體中成為成熟形式（mtCit1）（圖4C，比較品系2 ~ 3和品系6 ~ 7）。這很可能是因?yàn)?/span>mtCit1在線粒體中產(chǎn)生的檸檬酸可能被TCA循環(huán)中的酶迅速消耗，而NDCit1產(chǎn)生的檸檬酸可能被消耗的程度較小。作者注意到，在釀酒酵母中沒有發(fā)現(xiàn)三磷酸腺苷檸檬酸裂解酶，它將檸檬酸裂解為乙酰輔酶A和齊墩果酸。也有可能調(diào)節(jié)mtCit1活性的線粒體組分的可用性可能被限制在胞質(zhì)中。
圖4 積聚在細(xì)胞質(zhì)中NDCit1以酶活性依賴的方式對(duì)細(xì)胞有毒
4、preCit1的毒性取決于酶的活性
到目前為止，作者的研究是基于一個(gè)缺乏線粒體靶向序列的突變體（圖5A，左），這個(gè)元素將保留在由線粒體輸入失敗引起的真正錯(cuò)定位的蛋白質(zhì)中。為研究含序列Cit1的穩(wěn)定性，作者使用一個(gè)tom40-97溫度敏感突變體（圖5A，右）。當(dāng)Cit1在tom40-97細(xì)胞中過表達(dá)時(shí)，preCit1會(huì)積累（圖5B，lane1），并隨著時(shí)間的推移而降解（lane 1-4）由于對(duì)該菌株進(jìn)行遺傳操作的未知難度，作者發(fā)現(xiàn)preCit1-ds/AA是穩(wěn)定的（圖5B，lane 5-12），這表明preCit1的降解取決于Ucc1。作者注意到在Tom40-97細(xì)胞中積累的Hsp60的前體形式在追趕期保持不變（圖5B）。這一觀察強(qiáng)調(diào)前體蛋白質(zhì)量控制的特異性。
接下來，作者使用這種交替系統(tǒng)研究積累preCit1是否也具有毒性，毒性取決于酶活性。當(dāng)Cit1在GAL1啟動(dòng)子的調(diào)控下過表達(dá)時(shí)，tom40-97細(xì)胞在允許溫度26℃和限制溫度35℃的條件下幾乎和含有空質(zhì)粒的對(duì)照細(xì)胞一樣生長（圖5C，第6、7行）。然而，在35℃條件下，表達(dá)Cit1-DS/AA的tom40-97細(xì)胞逃避Ucc1介導(dǎo)的降解，生長速度比空質(zhì)粒的細(xì)胞慢（圖5C第6、8行）。在半允許溫度30℃的液體培養(yǎng)基中生長時(shí)也觀察到類似的趨勢(shì)（圖5D-E）。通過引入消除活性（圖5C，5E）的H/G突變，消除了表達(dá)Cit1-DS/AA的tom40-97酵母的生長缺陷表型。與這些結(jié)果一致，表達(dá)Cit1-DS/AA的tom40-97細(xì)胞中檸檬酸鹽的水平高于表達(dá)Cit1或Cit1-DS/AA-H/G的tom40-97細(xì)胞（圖5F）。這一數(shù)據(jù)表明，從純內(nèi)源位點(diǎn)表達(dá)的preCit1在導(dǎo)入失敗時(shí)積累在細(xì)胞質(zhì)中時(shí)可以表現(xiàn)出酶活性。
由于Ucc1識(shí)別折疊的檸檬酸合成酶（圖1-3），非導(dǎo)入的preCit1被Ucc1識(shí)別并靶向降解的事實(shí)表明preCit1很可能折疊成類似于NDCit1的三維構(gòu)象，在胞質(zhì)中具有催化活性，盡管需要進(jìn)一步的分析來充分證明preCit1在體內(nèi)胞質(zhì)中是否形成二聚體。preCit1-DS/AA可溶的觀察結(jié)果支持了這一觀點(diǎn)（圖5G）。此外，酶活性檸檬酸合成酶在胞質(zhì)中的積累比在線粒體中的毒性更大（圖4）?；谶@些結(jié)果，作者提出表達(dá)Cit1-DS/AA的tom40-97細(xì)胞的生長缺陷（圖5C-E）可歸因于非導(dǎo)入的preCit1在胞內(nèi)合成檸檬酸鹽。
當(dāng)這些細(xì)胞在只含有必需氨基酸的合成“最小”培養(yǎng)基中生長時(shí)，表達(dá)WT Cit1的細(xì)胞比表達(dá)Cit1-ds/AA的細(xì)胞表現(xiàn)出更低的適應(yīng)度（圖5M），這表明適度的preCit1積累可以根據(jù)環(huán)境增加或降低細(xì)胞適應(yīng)度。這些結(jié)果進(jìn)一步支持了作者的觀點(diǎn)，即在導(dǎo)入失敗時(shí)積聚在細(xì)胞質(zhì)中的preCit1表現(xiàn)出酶活性并影響細(xì)胞活性。
圖5 preCit1的積累以酶活性依賴的方式對(duì)細(xì)胞有毒
5、異位檸檬酸鹽合成引發(fā)代謝失衡
作者的數(shù)據(jù)表明，非輸入Cit1的異位檸檬酸鹽合成代表一種代謝擾動(dòng)形式，可能模仿線粒體輸入失敗的后果。為全面評(píng)估胞質(zhì)檸檬酸鹽合成對(duì)代謝的影響，作者比較表達(dá)NDCit1-DS/AA和NDCit1-DS/AA-h/G的WT細(xì)胞（圖6A）和表達(dá)Cit1的tom40-97細(xì)胞的代謝組學(xué)特征DS/AA和Cit1-DS/AA-h/G（圖6A）。為此，分別采用液相色譜-質(zhì)譜法（LCMS）和離子色譜-質(zhì)譜法（IC-MS）對(duì)陽離子代謝物和陰離子代謝物進(jìn)行了全面定量。作者從圖4C和5F中發(fā)現(xiàn)，在這兩種情況下，檸檬酸鹽的積累都很明顯，導(dǎo)致各種代謝物的波動(dòng)（圖6B）。累積的檸檬酸池的大小明顯大于TCA循環(huán)中其他有機(jī)酸的大?。▓D6C）。由于檸檬酸來源于碳水化合物代謝，作者在給藥后24小時(shí)評(píng)估13C流入檸檬酸池。作者發(fā)現(xiàn)大量糖源性13C被納入檸檬酸池（圖6D）?；谶@些結(jié)果，作者得出結(jié)論，碳水化合物的通量主要指向檸檬酸鹽池。碳水化合物池的重新連接可能會(huì)影響糖衍生的其他代謝物的產(chǎn)生，因?yàn)榘|(zhì)檸檬酸鹽的合成擾亂了正常的碳通量，通過這種碳通量，己糖被氧化并最終在線粒體中轉(zhuǎn)化為二氧化碳。途徑分析表明，除TCA和GL外，許多氨基酸和核苷酸代謝途徑受到影響。有趣的是，在積累NDCit1的WT細(xì)胞和積累preCit1的tom40-97細(xì)胞中，觀察到天冬氨酸顯著減少，谷氨酰胺和谷氨酸顯著增加（圖6F）。由于這些氨基酸用于核苷酸的從頭合成，因此預(yù)測觀察到的氨基酸失衡會(huì)影響核酸代謝，核苷酸和脫氧核苷酸水平確實(shí)會(huì)下降（圖6G）。異位檸檬酸合成可能導(dǎo)致不同種類代謝物的減少和增加，破壞全球代謝平衡。
盡管如此，胞內(nèi)檸檬酸的保留似乎會(huì)減弱糖基天冬氨酸的產(chǎn)生，而天冬氨酸缺乏可能會(huì)損害核苷酸的產(chǎn)生。相比之下，谷氨酸和谷氨酰胺的水平升高，支持了這一解釋。因此，胞質(zhì)檸檬酸鹽合成可能通過碳通量從糖轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致氨基酸失衡和嘌呤/嘧啶核苷酸減少（圖6H）。
圖6 異位檸檬酸鹽合成引發(fā)代謝失衡
6、翻譯抑制減輕生長缺陷的錯(cuò)誤定位的檸檬酸鹽周轉(zhuǎn)
為廣泛地研究細(xì)胞對(duì)異位檸檬酸合成的反應(yīng)，作者對(duì)表達(dá)NDCit1-DS/AA或NDCit1-DS/AA-H/G的細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)中檸檬酸的合成改變超過2600個(gè)編碼基因的轉(zhuǎn)錄本水平。編碼翻譯、核糖體生物合成、核糖體RNA加工和核糖體組裝的mRNA顯著下調(diào)（圖7A）。因此，作者進(jìn)行嘌呤霉素?fù)饺雽?shí)驗(yàn)來直接評(píng)估翻譯效率。嘌呤霉素是一種鏈終止劑，嵌入生長的新生多肽鏈中，可以使用抗嘌呤霉素抗體進(jìn)行WB檢測。表達(dá)NDCit1-DS/AA（圖7B，lane 2）的細(xì)胞嘌呤霉素?fù)饺胄实陀诒磉_(dá)NDCit1-DS/AA-H/G的細(xì)胞（lane 4）。用放線菌酮預(yù)處理細(xì)胞阻斷嘌呤霉素?fù)饺耄?/span>lane 1，3），證實(shí)新合成蛋白的檢測。這一結(jié)果表明胞質(zhì)檸檬酸的合成降低了翻譯效率。為證實(shí)這一發(fā)現(xiàn)，作者還進(jìn)行多聚體分離實(shí)驗(yàn)，其中檢測到單聚體和多聚核糖體的相對(duì)含量。作者發(fā)現(xiàn)在表達(dá)NDCit1-DS/AA的細(xì)胞中，相對(duì)單體多聚體比例高于表達(dá)NDCit1-DS/AA-H/G的細(xì)胞（圖7C）。
最后，作者檢測翻譯抑制是否在緩解細(xì)胞功能障礙中發(fā)揮保護(hù)作用。為此，作者刪除了產(chǎn)物具有部分重疊功能的DOT6和TOD6基因，以抑制雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體1和環(huán)磷酸腺苷依賴的蛋白激酶通路下游的核糖體生物合成基因的表達(dá)。如圖7D所示，如前所述，NDCit1-DS/AA的過表達(dá)減緩了WT細(xì)胞以及dot6D細(xì)胞和tod6D細(xì)胞的生長（圖4B）。當(dāng)DOT6和TOD6同時(shí)缺失（dot6Dtod6D）時(shí)，生長缺陷被夸大。相反，當(dāng)表達(dá)H/G突變的NDCit1-DS/AA時(shí)，即使在dot6Dtod6D細(xì)胞中，細(xì)胞生長也不受影響。當(dāng)在液體培養(yǎng)基中分析生長表型時(shí)，觀察到類似的趨勢(shì)（圖7E）。這些結(jié)果表明翻譯抑制對(duì)異位檸檬酸鹽合成有保護(hù)作用。線粒體輸入失敗不僅會(huì)引起蛋白質(zhì)毒性損傷，還會(huì)引發(fā)異位代謝應(yīng)激（圖7F）。
圖7 翻譯抑制保護(hù)細(xì)胞在異位檸檬酸應(yīng)激
參考文獻(xiàn)
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