CYP1B1在結(jié)直腸癌中抑制鐵死亡并誘導(dǎo)抗PD-1耐藥

實驗方法：CCK8、C11-BODIPY試驗、WB、泛素化試驗、qPCR、動物模型構(gòu)建、免疫組化。

免疫檢查點阻斷(ICB)是一種很有前途的治療結(jié)直腸癌(CRC)的策略。然而，大多數(shù)結(jié)直腸癌患者對ICB治療反應(yīng)不佳。越來越多的證據(jù)表明，鐵死亡在免疫治療中起著關(guān)鍵作用。誘導(dǎo)腫瘤鐵死亡可提高ICB的療效。CYP1B1是一種參與花生四烯酸代謝的代謝酶。然而，CYP1B1在鐵死亡中的作用尚不清楚。在本研究中，我們證明CYP1B1來源的20-HETE激活蛋白激酶C途徑，增加FBXO10的表達，進而促進ACSL4的泛素化和降解，最終誘導(dǎo)腫瘤細胞對鐵死亡的抵抗。此外，在小鼠模型中，抑制CYP1B1使腫瘤細胞對抗PD-1抗體敏感。此外，CYP1B1表達與ACSL4表達呈負相關(guān)，高表達提示CRC預(yù)后較差。綜上所述，我們的工作確定CYP1B1是增強CRC抗PD-1治療的潛在生物標(biāo)志物。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）CYP1B1使CRC細胞抵抗鐵死亡

為了測試CYP1B1是否參與鐵死亡，我們在RKO、HCT116和HT29細胞系中產(chǎn)生了CYP1B1過表達或敲低的細胞(圖1A、B)，并測試了這些細胞對RSL3的藥物敏感性。正如預(yù)期的那樣，CYP1B1異位表達的細胞對RSL3具有抗性(圖1C)。相反，CYP1B1敲低導(dǎo)致細胞對RSL3更敏感(圖1D)。同時，我們用BODIPY-C11氧化法測量了RKO細胞的膜脂過氧化氫水平。過表達CYP1B1的RKO細胞表現(xiàn)出脂質(zhì)過氧化降低(圖1E, F)。相反，CYP1B1敲低細胞的膜脂過氧化水平顯著升高(圖1G, H)。這些結(jié)果表明，CYP1B1表達減輕了脂質(zhì)過氧化，保護細胞免受鐵死亡，并有助于鐵死亡抵抗。

2）CYP1B1促進ACSL4泛素化和降解

接下來，我們探討了CYP1B1在鐵死亡抗性中的機制作用。Western blot分析顯示，CYP1B1過表達降低了ACSL4蛋白水平(圖2A)，而CYP1B1敲低則增加了RKO、HCT116和HT29細胞中ACSL4蛋白水平(圖2B)。接下來，我們研究CYP1B1抑制鐵死亡是否是ACSL4下調(diào)的結(jié)果。我們用空載體(EV)或ACSL4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CYP1B1過表達的RKO細胞(圖2C)，并進行CCK8檢測。結(jié)果顯示，外源性表達ACSL4逆轉(zhuǎn)了細胞對RSL3的抗性(圖2D)，表明CYP1B1以ACSL4依賴的方式抑制鐵死亡。隨后，我們檢測了ACSL4 mRNA的變化。有趣的是，我們未能檢測到CYP1B1過表達或敲低的細胞中ACSL4 mRNA水平的變化(圖2E, F)。這些結(jié)果表明CYP1B1在翻譯后水平調(diào)控ACSL4蛋白。為了檢測CYP1B1是否影響ACSL4蛋白的穩(wěn)定性，在指定的時間點用環(huán)己亞胺(CHX)處理EV或CYP1B1過表達的RKO細胞以抑制蛋白質(zhì)合成。Western blot結(jié)果顯示，CYP1B1過表達降低了ACSL4的半衰期(圖2G)?；谶@些結(jié)果，我們認為CYP1B1通過提高ACSL4的泛素化水平來降低ACSL4蛋白的穩(wěn)定性。接下來，我們分析了CYP1B1對ACSL4泛素化的影響。正如預(yù)期的那樣，我們發(fā)現(xiàn)CYP1B1過表達增加了多泛素鏈連接的ACSL4(圖2H)，而CYP1B1敲低則降低了ACSL4的多泛素化水平(圖2I)。這些結(jié)果表明，CYP1B1通過增加ACSL4的泛素化來促進ACSL4的降解。

3）20-HETE促進FBXO10表達，對CYP1B1誘導(dǎo)的ACSL4降解至關(guān)重要

ACSL4催化AA生成花生四烯?；o酶A，從而促進鐵死亡。外源性AA可增強RSL3誘導(dǎo)的鐵死亡。同時，CYP1B1將AA代謝為羥基二十碳四烯酸(HETEs)。因此，我們質(zhì)疑CYP1B1是否通過下調(diào)細胞內(nèi)AA來降低ACSL4蛋白水平。用EV或Flag-CYP1B1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RKO細胞，并用10 μM AA處理24 h。Western blot結(jié)果顯示，在CYP1B1過表達的細胞中，AA并沒有恢復(fù)ACSL4的表達，ACSL4的表達出現(xiàn)降低(圖3A)。根據(jù)這一結(jié)果，我們推測CYP1B1可能通過AA的代謝物降解ACSL4，從而保護細胞免受鐵死亡。在人體內(nèi)，CYP1B1產(chǎn)生的AA代謝產(chǎn)物主要是12-HETE和20HETE，因此，我們接下來測試了CYP1B1誘導(dǎo)的ACSL4下調(diào)是由于12-HETE還是20-HETE。10 μM 12-HETE或20-HETE作用RKO細胞24 h，western blot檢測ACSL4蛋白水平。結(jié)果顯示，20-HETE降低了ACSL4蛋白水平，而12-HETE沒有降低ACSL4蛋白水平(圖3B)。為了確定CYP1B1敲低引起的ACSL4蛋白水平升高是否由于20-HETE，我們用10 μM  20-HETE處理CYP1B1敲低的RKO細胞24小時，檢測ACSL4蛋白水平。如圖3C所示，20-HETE降低了ACSL4蛋白水平，逆轉(zhuǎn)了CYP1B1敲低誘導(dǎo)的ACSL4蛋白升高。此外，20HETE而非12-HETE降低了CYP1B1敲低的RKO細胞對RSL3的敏感性(圖3D)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明CYP1B1下調(diào)ACSL4蛋白，并通過20-HETE促進鐵死亡耐受。另外，已知20-HETE可激活PKC信號通路，觸發(fā)下游信號和靶基因的轉(zhuǎn)錄。我們的目的是確定20-HETE是否促進了FBXO10的表達，FBXO10是ACSL4的E3泛素連接酶。我們發(fā)現(xiàn)20-HETE增加了FBXO10的表達，這種增加被sotrastaurin(一種PKC抑制劑)消除，而ACSL4呈現(xiàn)相反的趨勢(圖3E)。此外，外源性CYP1B1表達增加了FBXO10蛋白水平，而CYP1B1敲低則降低了FBXO10的表達(圖3F, G)。接下來，我們研究了ACSL4的多聚泛素化水平是否也受到20-HETE和PKC抑制劑的調(diào)節(jié)。如圖3H所示，20-HETE增加了多泛素鏈連接的ACSL4，而單用sotrastaurin或聯(lián)用20-HETE處理的細胞ACSL4多泛素化水平降低。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，AA的代謝物20-HETE通過激活PKC信號通路和誘導(dǎo)E3泛素連接酶FBXO10的表達來增強ACSL4的降解。

4）CYP1B1表達降低抗PD-1治療的療效

鐵死亡在癌癥免疫治療中發(fā)揮重要作用，因此我們旨在確定CYP1B1是否會破壞抗PD-1治療的有效性。我們使用慢病毒感染的方法敲低MC38細胞中的CYP1B1，并用western blot分析蛋白表達(圖4A)。我們將穩(wěn)定表達ctrl shRNA或CYP1B1 shRNA的MC38細胞皮下注射到C57BL/6J小鼠的右側(cè)，并根據(jù)治療方案給這些小鼠注射抗mPD-1抗體或同型對照IgG(圖4B)?？?/span>mPD-1治療顯著抑制了CYP1B1敲低小鼠的腫瘤生長(圖4C, D)。當(dāng)CYP1B1敲低的小鼠接受抗PD-1治療時，IHC顯示4-HNE(一種脂質(zhì)過氧化標(biāo)志物)的表達增加(圖4E, F)。這些數(shù)據(jù)表明，CYP1B1缺乏增強了鐵死亡，并使腫瘤細胞對抗PD-1治療敏感。

5）在結(jié)直腸癌組織中CYP1B1水平與ACSL4水平呈負相關(guān)

為了評估CYP1B1和ACSL4在結(jié)直腸癌腫瘤中的臨床相關(guān)性，我們首先比較了CYP1B1和ACSL4在結(jié)直腸癌癌組織和鄰近正常組織中的表達。免疫組化染色顯示，CYP1B1在結(jié)直腸癌癌組織中高表達(圖5A)。接下來，我們確定了CRC腫瘤組織中CYP1B1與ACSL4的相關(guān)性。免疫組化分析顯示ACSL4蛋白水平與CYP1B1蛋白水平呈負相關(guān)(圖5B, C)。此外，我們使用GEPIA數(shù)據(jù)庫分析了CYP1B1的預(yù)后價值，發(fā)現(xiàn)CYP1B1水平的高表達與結(jié)腸腺癌(COAD)患者較差的總生存率顯著相關(guān)(圖5D)。這些結(jié)果表明，CYP1B1可能是一種潛在的生物標(biāo)志物，并可能為結(jié)直腸癌患者提供新的治療靶點。

結(jié)論：我們證明CYP1B1是鐵死亡的重要調(diào)節(jié)因子，并影響抗PD-1治療的敏感性。在機制上，CYP1B1通過增加ACSL4泛素化并促進其降解來誘導(dǎo)腫瘤細胞對鐵死亡的抵抗。我們的研究結(jié)果對臨床工作具有重要意義，表明CYP1B1可能作為一個有希望的治療靶點來增強CRC的抗PD-1治療。

參考文獻：Chen C, Yang Y, Guo Y, He J, Chen Z, Qiu S, Zhang Y, Ding H, Pan J, Pan Y. CYP1B1 inhibits ferroptosis and induces anti-PD-1 resistance by degrading ACSL4 in colorectal cancer. Cell Death Dis. 2023 Apr 14;14(4):271. doi: 10.1038/s41419-023-05803-2.