單細胞多組學(xué)分析確定了 調(diào)節(jié)淋巴管平滑肌瘤樣細胞的存活的HOX-PBX基因網(wǎng)絡(luò)

淋巴管平滑肌瘤樣病（LAM）是一種罕見的、進展性的肺部疾病，主要影響女性。LAM細胞攜帶TSC1/TSC2突變，導(dǎo)致mTORC1過度活化和細胞無法受控地增殖。mTORC1抑制劑可以穩(wěn)定肺功能，但持續(xù)療效需要長期給藥，而一些患者無法耐受或?qū)χ委煙o響應(yīng)。雖然 LAM 的遺傳基礎(chǔ)是已知的，但其發(fā)病機制仍然不清楚。作者整合了LAM肺部的單細胞RNA測序和單核ATAC-seq，構(gòu)建了控制LAM細胞轉(zhuǎn)錄程序的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。作者發(fā)現(xiàn)，子宮特異性HOX-PBX轉(zhuǎn)錄程序在肺部LAMCORE細胞中被激活，作為依賴于HOXD11-PBX1二聚化的細胞存活調(diào)節(jié)因子。因此，通過HXR9阻斷HOXD11-PBX1二聚化可以抑制LAM細胞在體外和體內(nèi)的存活。PBX1調(diào)節(jié)STAT1/3，增加抗凋亡基因的表達，促進LAM細胞在體外的存活。HOX-PBX基因網(wǎng)絡(luò)為治療LAM/TSC mTORC1過度活化癌癥提供了有前途的靶點。

技術(shù)路線：

實驗方法：細胞培養(yǎng)、RNA干擾、免疫印跡分析、實時熒光定量PCR、動物模型、細胞毒性實驗、snATAC-seq分析、scRNA-seq、snATAC-seq和10x多組數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析、TRN分析、共焦顯微鏡、免疫熒光染色。

1、單細胞基因表達和DNA可及性綜合分析鑒定出LAM中具有子宮選擇性的HOX家族轉(zhuǎn)錄因子的激活

該研究利用LAM患者肺部樣本的單細胞RNA測序(scRNA-seq)鑒定了一種獨特的細胞群體，稱為LAM^CORE，該群體可以與內(nèi)源性肺細胞類型輕松區(qū)分，并且與子宮肌細胞具有最接近的轉(zhuǎn)錄組相似性。本研究利用10x Multiome、單核測序轉(zhuǎn)座酶可接近染色質(zhì)測序(snATAC-seq)和現(xiàn)有的10x scRNA-seq產(chǎn)生的單細胞染色質(zhì)可及性和基因表達的配對檢測，并對人類LAM組織中的單細胞基因表達和染色質(zhì)可及性進行了整合分析。使用LungMAP CellRef對整合的LAM單細胞數(shù)據(jù)進行映射，鑒定出33種不同的細胞類型，包括先前鑒定的LAM^CORE細胞群體(圖1A)。作者發(fā)現(xiàn)LAM^CORE細胞特異性的ATAC-seq峰值可及性區(qū)域在子宮選擇性homeobox轉(zhuǎn)錄因子的模體中高度富集，包括PBX1、PBX3、HOXA9、HOXA10和HOXD11 (圖1B)。

LAM^CORE細胞中，HOXD11、PBX1、MITF和TEAD2被預(yù)測為具有富集表達的特征基因（圖1C，粉色條），而MYH11、ACTA2、STAT1和STAT3在多種細胞類型中表達，其平均表達水平在LAM^CORE細胞中增加（圖1C，藍色條）。在獲取LAM^CORE細胞的差異性可及峰集之后，使用Hypergeometric Optimization of Motif EnRichment（HOMER）將峰分配給最近或重疊的基因，從而實現(xiàn)染色質(zhì)可及性與基因表達的關(guān)聯(lián)。與LAM^CORE細胞選擇性峰相關(guān)的最近基因在肌肉結(jié)構(gòu)發(fā)育和細胞外基質(zhì)組織方面功能豐富（圖1D）。

在最近的基因附近，宮頸TFs（PBX1、PITX2、ESR1和HAND2）、編碼肌肉和膠原蛋白的基因（ACTA2、MYH11、COL1A2和COL4A1）以及參與凋亡的基因（CRYAB、PTGIS和PDE3A）在LAM中表達增加（圖1C）。ATAC測序和RNA表達模式在所有細胞類型中高度一致（圖1E）。作者分析了HOXA10和PBX1基因組區(qū)域的峰值到基因（P2G）連接（圖1F），并在LAM^CORE細胞的HOXA10和HOXA11啟動子區(qū)域中發(fā)現(xiàn)了獨特的可訪問峰，與LAM^CORE細胞中HOXA10和HOXA11 RNA的選擇性表達一致（圖1F）。PBX1被預(yù)測為LAM^CORE細胞的標(biāo)志性基因之一，其基因表達和染色質(zhì)可訪問峰在其他細胞類型中被檢測到，并且PBX1在LAM^CORE細胞中的選擇性可能受到其與HOX蛋白的二聚化的影響（圖1F）。因此，目前整合的scRNA-seq/snATAC-seq數(shù)據(jù)分析確定了子宮特異性轉(zhuǎn)錄編程（即homeobox轉(zhuǎn)錄因子家族）在LAM^CORE細胞中的表達和活性增加，支持HOX-PBX信號通路激活的理論，在LAM^CORE細胞的轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳調(diào)控中發(fā)揮重要作用。

圖1

2、LAM細胞中HOXs、PBX1和靶基因的表達顯著。

為了驗證單細胞研究的發(fā)現(xiàn)，作者使用逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)測量了5例LAM患者和3例非LAM患者組織中PBX1基因表達水平(表 1)。作者的發(fā)現(xiàn)表明，LAM患者肺組織中PBX1 mRNA水平升高（圖2A）。這證實了作者對公開可獲得的PBX1基因表達數(shù)據(jù)進行分析的結(jié)果，這些數(shù)據(jù)來自激光捕獲的LAM患者肺細胞（n=14，GSE12027）與女性癌癥患者肺組織（n=38，GSE10072和GSE19804）（圖2B）。

已經(jīng)在肺LAM患者中鑒定出了子宮LAM病變。子宮組織是從一位散發(fā)性LAM患者進行子宮切除術(shù)時獲取的。LAM子宮的組織病理學(xué)顯示多個形態(tài)清晰、堅實的結(jié)節(jié)，具有由肌層形成的卷曲網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，從肌層表面凸出，與平滑肌瘤一致。免疫組化染色顯示ACTA2呈陽性免疫反應(yīng)。免疫熒光染色顯示PBX1位于ACTA2陽性子宮平滑肌瘤細胞核中（圖2D）。作者已經(jīng)發(fā)表的單細胞RNA測序分析鑒定了三種主要的細胞類型：ACTA2+細胞、免疫細胞和內(nèi)皮細胞。蘇木精-伊紅(H&E)染色顯示ACTA2+群體具有明顯的上皮細胞特征（圖2E）。免疫熒光染色顯示PBX1位于ACTA2陽性腎臟脂肪瘤細胞核中（圖2E）。

接下來，作者研究了鼠瘤性硬化2（Tsc2）基因缺失大鼠子宮平滑肌瘤來源的ELT3（Eker大鼠子宮平滑肌瘤）細胞的異種移植瘤模型中PBX1蛋白水平。在接種后6周，ELT3-V3（表達空載體）和ELT3-T3（表達TSC2）細胞均形成皮下腫瘤。與Tsc2陽性的ELT3-T3細胞相比，Tsc2缺失的ELT3-V3腫瘤細胞中PBX1陽性細胞核的百分比增加（圖2F和G）。最后，在肺轉(zhuǎn)移小鼠模型中，與安慰劑治療相比，PBX1在雌激素誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)移性肺病變中的積累更為突出（圖2H）。與單細胞多組學(xué)發(fā)現(xiàn)一致，作者的數(shù)據(jù)證明了LAM組織和TSC2缺陷小鼠腫瘤模型中PBX1表達和PBX1蛋白水平的增加。

圖2

3、PBX1 ChIP-seq 和 LAM 肺部 scRNA-seq 數(shù)據(jù)的綜合分析，鑒定 HOX和STAT作為PBX1的靶點

PBX1是一種先鋒因子，能夠打開染色質(zhì)以招募雌激素受體α到乳腺癌細胞中。PBX(PBX1到PBX4)和HOX(HOX1到HOX11)是一類包含homeobox結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，它們可以形成功能性二聚體，在不同類型的癌癥中促進增殖、抑制細胞凋亡、誘導(dǎo)血管生成并推動轉(zhuǎn)移。作者應(yīng)用乳腺癌PBX1染色質(zhì)免疫沉淀測序(ChIP-seq)數(shù)據(jù)集(GSE28008)和LAM肺單細胞RNA測序(scRNA-seq)數(shù)據(jù)集進行整合分析，以在LAM^CORE細胞中鑒定潛在的PBX1靶點。具有正向PBX1結(jié)合峰和在LAM^CORE細胞中選擇性表達的基因包括HOXD11、PITX2、ESR1和NR2F2 (圖3A)。

STAT3被預(yù)測為PBX1的轉(zhuǎn)錄靶點。雖然STAT3在LAM和對照組肺細胞中均表達，但其總體表達量在LAM組與對照組肺中存在顯著差異(圖1C)。具有正向PBX1結(jié)合位點和在LAM^CORE細胞中選擇性表達的基因在與LAM病理機制相關(guān)的通路中發(fā)生功能富集，包括LAM^CORE細胞中雌激素、ERK/絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和mTOR信號通路的激活(圖3B)，這支持PBX1參與調(diào)控導(dǎo)致LAM發(fā)生的基因和通路的概念。雌激素處理增加了ESR1和PGR的轉(zhuǎn)錄水平，但并未影響621-101細胞中PBX1的表達(圖3C)，這表明TSC2缺陷細胞中PBX1表達沒有負反饋調(diào)控。

圖3

4、PBX1在TSC2缺陷細胞中與HOXD11相互作用。

為了確定LAM特異性的HOX/PBX相互作用，作者使用兩種獨立的anti-HOXD11抗體進行免疫共沉淀實驗，檢測來自大鼠子宮平滑肌瘤衍生的ELT3細胞中HOXD11免疫復(fù)合物中的PBX1蛋白（圖3D）。共聚焦顯微鏡顯示，在TSC2缺陷細胞的細胞核中，PBX1和HOXD11免疫染色共定位（圖3E）。免疫熒光染色顯示，在LAM患者的平滑肌肌動蛋白（ACTA2）陽性肺細胞核中，PBX1和HOXD11共定位（圖3F）。

作者構(gòu)建了一個子宮特異性Tsc2敲除的基因小鼠模型（圖3G，a），并在27周齡時在PRCre;Tsc2f/f（Tsc2KO）小鼠中識別出子宮增大、囊腫形成和子宮腫瘤的增生（圖3G，b）。組織病理學(xué)顯示Tsc2KO小鼠的子宮內(nèi)膜和肌層細胞（圖3G，c）。免疫印跡分析表明，與野生型（WT）小鼠相比，Tsc2KO小鼠子宮組織中Tsc2蛋白的喪失和S6（Ser235/236）磷酸化的增加，這表明mTORC1的激活（圖3G，d）。免疫熒光染色顯示，在LAM的PRCre;Tsc2f/f小鼠模型的子宮肌層腫瘤細胞中，PBX1在細胞核中明顯表達，而HOXD11在細胞質(zhì)周圍的區(qū)域豐富表達（圖3G，e）。

綜上所述，作者的研究結(jié)果通過綜合基因組分析表明了在TSC2缺陷細胞中PBX1和HOXD11之間的相互作用。

5、HOXD11和PBX1是LAMCORE細胞中活躍的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

為揭示決定LAM特異性細胞命運的基因組和表觀遺傳調(diào)控回路，作者利用成對的基因表達和染色質(zhì)可及性數(shù)據(jù)（PECA）構(gòu)建了LAM^CORE細胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（TRNs）。PECA是一種統(tǒng)計模型，可以基于基因表達和染色質(zhì)可及性數(shù)據(jù)來計算目標(biāo)基因表達的概率推斷出特定情境下的TRN。為確保TRN是LAMCORE特異性的，作者要求轉(zhuǎn)錄因子（TFs）在LAM^CORE細胞中高度表達，并且目標(biāo)基因與對照間充質(zhì)細胞相比要么是LAM^CORE標(biāo)志基因，要么是在LAM^CORE中誘導(dǎo)的基因。作者確定了在LAM^CORETRN中與最多相互作用的TFs節(jié)點（網(wǎng)絡(luò)的前1％），包括激素受體PGR（孕激素受體）、雄激素受體和Homeobox轉(zhuǎn)錄因子（HOXA10、HOXA11、HOXD11、PBX1和PBX3）（圖4A）。

考慮到作者發(fā)現(xiàn)PBX1與HOXD11在人類和嚙齒動物的TSC2缺陷細胞中結(jié)合（圖3），作者接下來專注于以PBX1-HOXD11為中心的TRN，通過提取直接連接到PBX1和HOXD11的基因節(jié)點，包括共同的上游調(diào)節(jié)因子、共同的輔因子和共同的靶基因（圖4B）。共享的PBX1-HOXD11靶基因在功能上富集于“肌肉增殖/發(fā)育”、“細胞命運承諾”、“傷口愈合”、“激素反應(yīng)”、“Wnt信號通路”、“凋亡信號通路”、“重點支持”和“磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-Akt-mTOR信號通路”（圖4C）。作者的TRN分析確定了LAM^CORE細胞中，以PBX1-HOXD11為中心的TRN上游和下游的精確調(diào)控回路，并提供了功能驗證和鑒定PBX1-HOXD11調(diào)控LAM病理機制的分子和細胞機制的理論藍圖。

因為STAT家族轉(zhuǎn)錄因子（STAT1和STAT3）是LAM^CORE細胞特異染色質(zhì)可及性區(qū)域中高度富集的模體（圖1，C和D），并且預(yù)測它們是PBX1的直接轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)（圖3A），因此作者構(gòu)建了PBX1/3和STAT1/3共同網(wǎng)絡(luò)以確定共享的靶標(biāo)（圖4D）。由于轉(zhuǎn)錄因子家族通常共享轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點和motif，作者將PBX1和PBX3組合為PBX家族，將STAT1和STAT3組合為STAT家族。 "程序性細胞死亡的調(diào)節(jié)"是PBX / STAT共同靶標(biāo)基因中最豐富的功能。其中大多數(shù)基因與"細胞死亡的負調(diào)節(jié)"相關(guān)（圖4E）。

網(wǎng)絡(luò)分析表明，PBX和STAT轉(zhuǎn)錄因子家族協(xié)同作用，抑制LAM細胞凋亡并促進LAM細胞生存。免疫組化證實PBX1，HOXA11和HOXD11蛋白存在于LAM肺結(jié)節(jié)中的ACTA2陽性細胞中（圖2C和4F）。磷酸化STAT1（磷酸化STAT1）和磷酸化STAT3定位于LAM肺結(jié)節(jié)中的細胞核中（圖4G）。 RT-PCR驗證了LAM中幾個PBX-STAT共同靶標(biāo)基因在細胞死亡的負調(diào)節(jié)中的表達增加，包括CRYAB和HAND2（圖4，H和I）。與單細胞分析和網(wǎng)絡(luò)預(yù)測一致，作者證明了LAM結(jié)節(jié)中PBX1、HOXA11、HOXD11、磷酸化STAT1/3蛋白水平增加，并且預(yù)測的PBX-STAT基因靶點（CRYAB和HAND2）表達增加，從而抑制凋亡。

圖4

6、抑制PBX1會減弱LAM源細胞中STAT1/3的磷酸化

利用慢病毒短發(fā)夾RNA(shRNA)在621-101細胞中降低PBX1的表達。結(jié)果顯示PBX1敲除可將磷酸化Ser727-STAT1水平降低45％和88％，將磷酸化Ser727-STAT3水平降低80％和75％（圖5，A和B）。細胞周期蛋白D1的蛋白水平，即STAT3的轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)，不受PBX1減少的影響（圖5A），表明PBX1在LAM衍生細胞中不控制cyclin D1依賴的增殖信號。

此外，PBX1敲除減少了LAM衍生細胞中PBX1和ESR1的轉(zhuǎn)錄水平（圖5C）。這些結(jié)果表明，在TSC2缺失的LAM細胞中，STAT1、STAT3和雌激素受體α(ESR1)的增加表達依賴于PBX1。

圖5

7、在體外抑制STAT1可促使TSC2缺陷 LAM細胞死亡

LAM患者來源的細胞用氟達拉濱(NSC 118218，FaraA，Fludarabine)處理，該處理可使 STAT1 mRNA 和蛋白質(zhì)降解。24和 48小時后，Fludarabine處理顯著提高了TSC2缺陷621-101細胞中 ESR1 的轉(zhuǎn)錄水平（圖5D）。與 TSC2-expressing 621-103 細胞（GI50 = 852.2 μM）相比，Fludarabine 處理顯著降低了 TSC2缺陷 621-101 細胞的存活率（生長抑制劑濃度50%（GI50）= 56.1 μM），這一結(jié)果在72小時內(nèi)出現(xiàn)（圖5E和F）。然后，作者對621-101和 621-103 細胞分別使用逐漸增加的濃度的Fludarabine處理72小時。相位對比顯微鏡顯示，55.6至500μM Fludarabine處理導(dǎo)致621-101細胞死亡明顯增加，而621-103細胞不受影響（圖5G）。使用水晶紫染色顯示，與 621-103 細胞相比，Fludarabine處理的621-101細胞的染色減少（圖5H和I）。與對照組相比，48小時的Fludarabine處理減少了磷酸化STAT1的水平，降低了PBX1的蛋白質(zhì)水平（圖5J）。去氧氟達拉濱處理后，TSC2缺陷621-101細胞中出現(xiàn)明顯的PARP（聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶）裂解（圖5J和K及表2），這表明TSC2缺陷細胞發(fā)生了凋亡。網(wǎng)絡(luò)分析和功能研究共同證明，PBX1和STAT 家族轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用抑制LAM細胞的凋亡并促進細胞存活，這種效應(yīng)可被STAT信號抑制所逆轉(zhuǎn)。

8、在活體實驗中，抑制STAT1并未影響Tsc2敲除的大鼠子宮肌瘤來源細胞的肺部定植

為了評估抑制STAT1活化的潛在治療效果，使用Fludarabine處理Tsc2缺陷 ERL4細胞16小時。與對照組相比，Fludarabine（100μM）沒有改變Tsc2缺陷 ERL4細胞的熒光素酶活性（圖6A）。免疫印跡分析顯示，Fludarabine處理降低了STAT1和STAT3的磷酸化水平（圖6B），這表明在體內(nèi)抑制了STAT1。接下來，作者測試了Fludarabine對ERL4細胞在肺部殖民化的影響。將ERL4細胞注入雌性NOD scid gamma（NSG）小鼠體內(nèi)。在1小時內(nèi)，所有小鼠胸部區(qū)域的生物熒光強度相似（基線），在細胞接種后6小時，所有小鼠的生物熒光強度略有增加。Fludarabine處理72小時不影響ERL4細胞在肺部的定植（圖6，C至E）?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)表明，在體內(nèi)抑制STAT1活化不足以抑制Tsc2缺陷 ERL4細胞的生存和/或在肺部的定植。

9、抑制HOX-PBX1二聚體化促進TSC2缺陷細胞死亡

為了評估抑制HOX-PBX1二聚化在LAM中的潛在治療效果，使用不斷增加濃度的HXR9（Bio-Synthesis Inc.，Lewisville，TX，USA）來處理TSC2缺陷 621-101和ERL4細胞，這是一種可滲透細胞的合成肽，可以抑制HOX-PBX相互作用。 HXR9（50μM）殺死了TSC2缺陷 621-101細胞（圖7A和B），表明阻止HOX-PBX1二聚化的細胞毒性作用。HXR9處理提高了TSC2缺陷621-101細胞中cleaved caspase-3和受體相互作用蛋白激酶1（RIPK1）的磷酸化水平，但在TSC2重新表達的621-103細胞中未觀察到這種效應(yīng)（圖7C），這表明增強了細胞凋亡和壞死。接下來，作者測試了HXR9對ERL4細胞的肺轉(zhuǎn)移的影響。HXR9預(yù)處理成功抑制了細胞接種后24和48小時的肺轉(zhuǎn)移（圖7D和E）。將表達熒光素的LAM衍生的621-101-luciferase（621L9）細胞轉(zhuǎn)染兩個獨立PBX1-shRNA的女性C.B-Igh-1b /IcrTac-Prkdcscid（SCID）小鼠進行注射（圖7F）。盡管在接種pLKO.1或PBX1-shRNA細胞的小鼠中，胸部區(qū)域的熒光強度在1小時內(nèi)相似（基線），但是在接種PBX1-shRNA細胞的小鼠中，在接種后24和48小時，熒光強度明顯降低（圖7G和H）。

圖6

總之，這些數(shù)據(jù)表明PBX1-HOX相互作用調(diào)節(jié)了TSC2缺陷 LAM患者衍生的細胞的存活和肺轉(zhuǎn)移。

圖7

參考文獻：

Tasnim Olatoke et al. ,Single-cell multiomic analysis identifies a HOX-PBX gene network regulating the survival of lymphangioleiomyomatosis cells.Sci. Adv.9,eadf8549(2023).DOI:10.1126/sciadv.adf8549