胰腺褪黑素通過調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞浸潤和NETosis來增強(qiáng)胰腺腺癌的抗腫瘤免疫

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞增殖測定，酶聯(lián)免疫吸附，蛋白質(zhì)陣列，免疫印跡，免疫熒光，定量 RT-PCR，HE染色，流式細(xì)胞術(shù)，活體成像

胰腺癌（PAAD）是2020年男性和女性第7大死亡原因，死亡率/發(fā)病率極高。由于缺乏早期癥狀和異常侵襲性的發(fā)展，其5年生存率仍然不令人滿意。手術(shù)切除是目前唯一的根治性治療方案，但患者確診時(shí)通常已處于晚期并有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，因此無法治愈。為改善患者預(yù)后，目前已采用吉西他濱和5-氟尿嘧啶等新輔助或輔助化療，或靶向藥物厄洛替尼和奧拉帕利，然而治療結(jié)果不令人滿意。據(jù)報(bào)道，由腫瘤微環(huán)境調(diào)節(jié)的成纖維細(xì)胞和免疫細(xì)胞由于其免疫抑制和治療抵抗的特性，與PAAD的不良預(yù)后相關(guān)。然而，適應(yīng)性免疫人群的研究進(jìn)展令人失望，迫切需要將研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)向其他類型的細(xì)胞，特別是髓樣細(xì)胞。褪黑素是一種調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律的天然激素，在大腦的松果體中合成。褪黑素還參與免疫反應(yīng)和抗炎作用，具有抗腫瘤特性。然而，褪黑素在介導(dǎo)腫瘤免疫應(yīng)答中的作用尚不清楚。

技術(shù)路線：

圖形摘要：

主要研究結(jié)果：

1. 褪黑素表達(dá)降低與PAAD患者不良預(yù)后相關(guān)

雖然多項(xiàng)體外研究揭示了褪黑素對(duì)永生化PAAD細(xì)胞系的抑制作用，但褪黑素在PAAD患者腫瘤組織中的內(nèi)源性表達(dá)及其臨床意義仍有待揭示。作者通過免疫組化方法檢測了90例PAAD標(biāo)本和鄰近胰腺組織褪黑素的表達(dá)（圖1A）。與配對(duì)的正常鄰近組織相比，PAAD腫瘤中褪黑素的存在顯著減少（圖1B）。值得注意的是，胰腺組織中的褪黑素水平與PAAD患者的OS直接相關(guān)，其中這種關(guān)聯(lián)在腫瘤組織中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在癌旁組織中無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1C、D）。

有趣的是，褪黑素水平與腫瘤進(jìn)展標(biāo)志物KI67和P53無關(guān)（圖1E、F），這表明褪黑素的減少可能不是由高度增殖的腫瘤細(xì)胞引起的。因此，橋接褪黑素減少和不良預(yù)后的機(jī)制可能更為復(fù)雜。將患者按性別分層時(shí)，PAAD和癌旁組織中褪黑素的相對(duì)水平并沒有顯示出偏倚差異（圖1G）。另一方面，研究報(bào)道血漿褪黑素水平隨著年齡的增長而下降。它是許多衰老相關(guān)疾病的病因，包括阿爾茨海默病和帕金森病。有趣的是，作者的組織陣列染色結(jié)果顯示，PAAD中的褪黑素表達(dá)與患者的年齡無關(guān)，但在胰腺的鄰近組織中觀察到這一關(guān)聯(lián)（圖1H）。提示胰腺腫瘤組織褪黑素生成減少提示PAAD患者預(yù)后不良。

圖1 胰腺褪黑素水平降低與PAAD患者較短的生存期相關(guān)

2. 補(bǔ)充褪黑素可抑制PAAD的腫瘤進(jìn)展

越來越多的證據(jù)表明，褪黑素可能抑制多種人類癌癥的腫瘤進(jìn)展。為了了解其在PAAD中的作用，作者首先通過胰腺注射小鼠PAAD細(xì)胞系Panc02建立了小鼠原位PAAD模型。為了確定胰腺褪黑素在PAAD進(jìn)展中的作用，作者每天通過灌胃給PAAD小鼠補(bǔ)充飲食褪黑素。口服褪黑素治療顯著增加了PAAD小鼠胰腺中的褪黑素水平（圖2A），并以劑量依賴性方式延緩腫瘤生長（圖2B、C）。為了進(jìn)一步測量褪黑素的抗腫瘤作用是否與PAAD中的褪黑素信號(hào)有關(guān)，在褪黑素受體拮抗劑luzindole存在的情況下給予治療劑量的褪黑素。luzindole對(duì)褪黑素受體活性的抑制作用完全阻斷了褪黑素對(duì)小鼠腫瘤進(jìn)展和PAAD大小的抑制作用(圖2D、E)。在使用另一鼠PAAD細(xì)胞系KPCY和人SW1990細(xì)胞系在裸鼠中的重復(fù)模型中，結(jié)果一致（圖2F、G）。這些發(fā)現(xiàn)表明胰腺褪黑素的存在通過其信號(hào)通路限制了PAAD的腫瘤進(jìn)展。

圖2 胰腺褪黑素抑制PAAD的腫瘤發(fā)展

3. 褪黑素誘導(dǎo)胰腺中CD11bLy6G中性粒細(xì)胞樣細(xì)胞的豐度

褪黑素在多種癌細(xì)胞中都有抑制癌細(xì)胞生長的報(bào)道。為了說明作者在體內(nèi)觀察到的褪黑素對(duì)PAAD腫瘤的抑制是否歸因于其對(duì)PAAD細(xì)胞的活性的直接抑制，作者在體外用不同劑量的褪黑素培養(yǎng)Panc02細(xì)胞。作者確定了褪黑素治療是否可以改變小鼠PAAD微環(huán)境的免疫特征。通過測量循環(huán)和胰腺腫瘤中的CD11bF4/80巨噬細(xì)胞、CD11bLy6G粒細(xì)胞、CD11bCD11c樹突狀細(xì)胞、CD3CD4輔助性T細(xì)胞、CD3CD8細(xì)胞毒性T細(xì)胞以及B220 B淋巴細(xì)胞的數(shù)量，作者發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充褪黑素特異性地增加了胰腺腫瘤內(nèi)的CD11bLy6G細(xì)胞的數(shù)量（圖3A）。體內(nèi)注射BrdU證實(shí)褪黑素誘導(dǎo)的CD11bLy6G群體在腫瘤微環(huán)境中幾乎不增殖（圖3B）。由于中性粒細(xì)胞和髓源性抑制細(xì)胞（MDSCs）都具有CD11b和Ly6G的細(xì)胞標(biāo)記，但在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮不同的功能，作者進(jìn)一步研究了褪黑素誘導(dǎo)的CD11bLy6G細(xì)胞在PAAD腫瘤微環(huán)境中的特異性表型。從褪黑素處理的PAAD中分選出CD11bLy6G細(xì)胞，he染色觀察細(xì)胞形態(tài)。與骨髓來源單核細(xì)胞GM-CSF和IL-6誘導(dǎo)的典型MDSCs相比，褪黑素誘導(dǎo)的PAAD腫瘤CD11bLy6G細(xì)胞呈中性粒細(xì)胞樣形態(tài)（圖3C）。在分選的CD11bLy6G細(xì)胞中增加的TNFα表達(dá)也提示這個(gè)群體比MDSCs更傾向于中性粒細(xì)胞（圖3D）。此外，分選的CD11bLy6G細(xì)胞不抑制CD8細(xì)胞毒性T細(xì)胞的增殖或活化T細(xì)胞標(biāo)志物KI67、顆粒酶B（圖3F、G）的表達(dá)。這些結(jié)果表明，補(bǔ)充褪黑素顯著誘導(dǎo)PAAD腫瘤微環(huán)境中的中性粒細(xì)胞豐度。

圖3 褪黑素增加體內(nèi)胰腺腫瘤的中性粒細(xì)胞群

4. 褪黑素誘導(dǎo)的腫瘤微環(huán)境中性粒細(xì)胞參與了PAAD的腫瘤抑制作用

為了進(jìn)一步確定中性粒細(xì)胞在介導(dǎo)褪黑素對(duì)PAAD進(jìn)展的抑制作用中的作用，作者使用了一種針對(duì)Ly6G的特異性抗體來去除腫瘤微環(huán)境中的CD11bLy6G中性粒細(xì)胞。腹腔內(nèi)注射抗ly6g抗體可有效減少褪黑素處理的PAAD中CD11bLy6G細(xì)胞的存在（圖4）。清除CD11bLy6G中性粒細(xì)胞顯著減弱褪黑素對(duì)PAAD進(jìn)展的抑制作用（圖4B）和實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)的腫瘤大?。▓D4C）。然后，作者從接受或未接受褪黑素治療的小鼠的PAAD腫瘤中分選了CD11bLy6G中性粒細(xì)胞。褪黑素處理的PAAD小鼠的CD11bLy6G中性粒細(xì)胞混合培養(yǎng)顯著誘導(dǎo)Panc02細(xì)胞凋亡（圖4D）。相反，在Transwell系統(tǒng)中，CD11bLy6G中性粒細(xì)胞不能誘導(dǎo)PAAD細(xì)胞凋亡（圖4E），表明褪黑素誘導(dǎo)的CD11bLy6G中性粒細(xì)胞通過直接細(xì)胞-細(xì)胞接觸機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用。從褪黑素處理的PAAD小鼠分選出的CD11bLy6G中性粒細(xì)胞顯示出比來自溶劑處理的PAAD小鼠的更高的細(xì)胞質(zhì)ROS水平（圖4F）。在褪黑素處理的PAAD的中性粒細(xì)胞中，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）和NAPDH氧化酶2（NOX2）的表達(dá)得到了一致的誘導(dǎo)（圖4G）。此外，正如瓜氨酸化組蛋白H3（H3Cit）和髓過氧化物酶（MPO）染色增加所示，褪黑素處理誘導(dǎo)了PAAD腫瘤微環(huán)境中更高水平的中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（NETs）（圖4H）。這些結(jié)果表明，TME中的CD11bLy6G中性粒細(xì)胞通過誘導(dǎo)ROS依賴的NETs發(fā)揮褪黑素在PAAD中的抗腫瘤凋亡作用。

圖4 中性粒細(xì)胞通過細(xì)胞-細(xì)胞接觸促進(jìn)褪黑素誘導(dǎo)的抗腫瘤作用

5. 腫瘤細(xì)胞來源的CXCL2招募抗腫瘤中性粒細(xì)胞進(jìn)入褪黑素處理的PAAD微環(huán)境

中性粒細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中既不是增殖性群體，也不是局部群體，主要是通過其前體在循環(huán)系統(tǒng)中的募集和成熟。為了確認(rèn)褪黑素治療是否與PAAD小鼠的中性粒細(xì)胞遷移和浸潤相關(guān)，作者用PKH26染色分選的中性粒細(xì)胞。作者通過腹腔注射給予或不給予褪黑素干預(yù)的PAAD小鼠重新補(bǔ)充它們。在褪黑素處理的PAAD小鼠的腫瘤中檢測到較高數(shù)量的PKH26CD11bLy6G中性粒細(xì)胞（圖5A），證實(shí)褪黑素治療誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞浸潤到PAAD的腫瘤微環(huán)境中。為了評(píng)估褪黑素對(duì)中性粒細(xì)胞的這種作用是否是直接的，作者將褪黑素添加到TCDS誘導(dǎo)的來自骨髓分離株的中性粒細(xì)胞中。作者注意到，在TCDS中補(bǔ)充褪黑素對(duì)誘導(dǎo)TCDS誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞遷移或成熟的影響很?。▓D5B、C）。同時(shí)，從褪黑素處理的Panc02細(xì)胞收集的上清液誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞顯示出顯著較高的CD11bLy6G細(xì)胞群豐度和運(yùn)動(dòng)能力（圖5D、E）。這一觀察結(jié)果表明，褪黑素不是直接調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞的細(xì)胞活性，而是觸發(fā)腫瘤細(xì)胞獲得中性粒細(xì)胞遷移和成熟所需的因子。蛋白質(zhì)芯片檢測上清液中腫瘤細(xì)胞來源的細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)變化。與溶劑處理的腫瘤細(xì)胞相比，含褪黑素的Panc02細(xì)胞釋放了不同的細(xì)胞因子和趨化因子譜（圖5F）。一些趨化因子，包括CXCL2、皮膚T細(xì)胞吸引趨化因子（CTACK）和p-選擇素，在褪黑素處理后表現(xiàn)出顯著的表達(dá)變化（圖5G）。CXCL2已被證明是中性粒細(xì)胞在各種生理和病理?xiàng)l件下的趨化劑。與正常鄰近組織相比，人PAAD中的Cxcl2表達(dá)顯著降低（圖5H），而在褪黑素處理的小鼠胰腺中觀察到Cxcl2增加（圖5I）。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測MT1和MT2在不同細(xì)胞上的表達(dá)，探討褪黑素誘導(dǎo)的CXCL2升高是否僅來自于腫瘤細(xì)胞。有趣的是，作者觀察到，在腫瘤細(xì)胞和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TANs）中，褪黑素處理后MT1和MT2水平顯著增加，而TANs保持不變（圖5J）。為了確定CXCL2水平升高的來源，作者使用細(xì)胞內(nèi)染色來確認(rèn)CXCL2水平的升高主要來自腫瘤細(xì)胞，而不是TAMs，TAMs是一種釋放相同細(xì)胞因子的已知免疫細(xì)胞（圖5K）。此外，褪黑素處理以劑量和時(shí)間依賴性誘導(dǎo)CXCL2的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)（圖5L）。隨后，作者建立了Cxcl2穩(wěn)定敲低的Panc02細(xì)胞（圖5M）。使用MOCK和cxcl2敲低（CXCL2KD）Panc02細(xì)胞的上清液（經(jīng)過或未經(jīng)過褪黑素處理）從骨髓分離出中性粒細(xì)胞。結(jié)果表明，Cxcl2敲低的褪黑素處理Panc02細(xì)胞的上清液未能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和引起中性粒細(xì)胞遷移（圖5N、O）。這些觀察表明，褪黑素誘導(dǎo)的PAAD細(xì)胞Cxcl2表達(dá)是抗腫瘤中性粒細(xì)胞募集到腫瘤微環(huán)境的原因。

圖5 褪黑素刺激下胰腺腫瘤分泌的CXCL2可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞募集

6. 褪黑素誘導(dǎo)PAAD中性粒細(xì)胞的N1樣抗腫瘤表型發(fā)展

有證據(jù)表明，腫瘤微環(huán)境中的中性粒細(xì)胞可能具有不同的表型，即N1樣抗腫瘤表型或N2樣促腫瘤表型，其特征是細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞代謝的差異以及一系列基因的表達(dá)。為了研究褪黑素治療是否使中性粒細(xì)胞群體向N1樣表型傾斜，作者分析了PAAD小鼠腫瘤微環(huán)境中的中性粒細(xì)胞群體。作者觀察到，接受褪黑素治療的PAAD小鼠的中性粒細(xì)胞表現(xiàn)出較低水平的前向散射（圖6A）和較高水平的CD11b（圖6B），這提示其具有抗腫瘤特性和活化表型?？紤]到N1和N2表型可能在不同水平表達(dá)相似的基因譜，作者測量了幾個(gè)可以代表特定表型的基因表達(dá)，并計(jì)算了N1/N2樣基因表達(dá)標(biāo)志物的比值。來自褪黑素處理的PAAD小鼠的分選CD11bLy6G中性粒細(xì)胞顯示N1/ N2樣基因表達(dá)標(biāo)志物的比率增加（圖6C），提示褪黑素治療可將PAAD腫瘤微環(huán)境中的中性粒細(xì)胞極化為N1樣表型。透射電子顯微鏡下的形態(tài)學(xué)評(píng)估顯示，褪黑素處理的PAAD的中性粒細(xì)胞中有更多的空泡化結(jié)構(gòu)和脫顆粒（圖6D），HE染色顯示褪黑素處理的PAAD的中性粒細(xì)胞中有更多的細(xì)胞質(zhì)嗜天青顆粒和超分葉的細(xì)胞核（圖6E、F），進(jìn)一步提示N1樣表型。

為了進(jìn)一步研究褪黑素處理的PAAD腫瘤中性粒細(xì)胞向N1樣抗腫瘤表型極化的細(xì)胞機(jī)制，作者從褪黑素處理和未處理的小鼠PAAD腫瘤中分選了CD11bLy6G中性粒細(xì)胞。作者使用非標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)分析來鑒定差異表達(dá)譜（圖6G）。突顯蛋白富集的生物學(xué)通路表明，褪黑素處理可能在PAAD腫瘤的中性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)糧農(nóng)組織（圖6H）。增加的FAO產(chǎn)生細(xì)胞ROS和NETs54。為了確定褪黑素誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞的抗腫瘤活性是否依賴于脂肪酸氧化的激活，作者用FAO抑制劑etomoxir預(yù)處理褪黑素處理的PAAD中的中性粒細(xì)胞，然后與Panc02細(xì)胞共培養(yǎng)。etomoxir預(yù)處理顯著減少了褪黑素誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生（圖6I），并消除了其誘導(dǎo)Panc02細(xì)胞凋亡的活性（圖6J）。這些發(fā)現(xiàn)表明，褪黑素誘導(dǎo)的細(xì)胞FAO導(dǎo)致了PAAD TME內(nèi)中性粒細(xì)胞的N1樣表型和抗腫瘤特性。

圖6 中性粒細(xì)胞在褪黑素存在的情況下表現(xiàn)出抗腫瘤N1表型

7. 褪黑素相關(guān)NETosis提示PAAD患者預(yù)后較好

為了進(jìn)一步研究褪黑素相關(guān)NETosis在PAAD中的臨床意義，作者采用多重?zé)晒馊旧z測了人PAAD標(biāo)本中褪黑素、CXCL2、中性粒細(xì)胞標(biāo)志物MPO和NETosis標(biāo)志物H3Cit的表達(dá)。與作者在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中觀察到的情況相似，較高的褪黑素水平與PAAD組織中CXCL2表達(dá)增多、中性粒細(xì)胞浸潤增多和NETosis激活增加相關(guān)（圖7A）。定量分析顯示褪黑素水平與CXCL2的表達(dá)顯著相關(guān)（圖7B）和中性粒細(xì)胞浸潤（圖7C）。CXCL2的表達(dá)與中性粒細(xì)胞浸潤呈正相關(guān)，進(jìn)一步證明褪黑素誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞浸潤需要CXCL2（圖7D）。此外，胰腺褪黑素與MPO中性粒細(xì)胞中H3Cit的表達(dá)呈正相關(guān)，表明中性粒細(xì)胞中的NETosis激活與PAAD中的褪黑素相關(guān)（圖7E）。

對(duì)PAAD患者OS進(jìn)行亞組分析，也發(fā)現(xiàn)褪黑素生成與NETosis相關(guān)事件相關(guān)。高水平的褪黑素只能預(yù)測CXCL2相對(duì)高表達(dá)的患者更好的生存，而不能預(yù)測CXCL2相對(duì)低表達(dá)的患者（圖7F）。類似地，只有當(dāng)中性粒細(xì)胞MPO浸潤水平相對(duì)較高時(shí)，PAAD患者的褪黑素生成與較好的生存率相關(guān)（圖7G）。在CXCL2相對(duì)高表達(dá)的情況下，更多的中性粒細(xì)胞延長了患者的生存時(shí)間，中性粒細(xì)胞僅在高表達(dá)CXCL2的PAAD患者中分化生存（圖7H）。這些觀察表明CXCL2/中性粒細(xì)胞在褪黑素在PAAD中的腫瘤抑制作用中起重要作用。此外，在浸潤到腫瘤組織的中性粒細(xì)胞中H3Cit水平相對(duì)較高的PAAD患者中，發(fā)現(xiàn)褪黑素水平與更好的生存相關(guān)（圖7I），提示NETosis激活在介導(dǎo)PAAD中褪黑素的腫瘤抑制功能中潛在的重要作用。這些觀察結(jié)果表明，褪黑素相關(guān)的CXCL2/中性粒細(xì)胞NETosis可能也存在于人類中，并且可以預(yù)測PAAD患者更好的生存。

圖7 

結(jié)論：

該研究表明褪黑素在胰腺癌中通過促進(jìn)TME中中性粒細(xì)胞的浸潤和NETosis發(fā)揮抗腫瘤作用。盡管其他研究報(bào)道了NETs在腫瘤發(fā)展中的負(fù)面影響，包括組織損傷、炎癥和可能的轉(zhuǎn)移，但該研究證明了中性粒細(xì)胞募集到腫瘤免疫微環(huán)境中的有益作用，以及NETs對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷機(jī)制。臨床樣本中的類似關(guān)聯(lián)表明，褪黑素可能是驅(qū)動(dòng)胰腺癌腫瘤抑制的免疫調(diào)節(jié)劑。

參考文獻(xiàn)：

Chan YT, Tan HY, Lu Y, Zhang C, Cheng CS, Wu J, et al. Pancreatic melatonin enhances anti-tumor immunity in pancreatic adenocarcinoma through regulating tumor-associated neutrophils infiltration and NETosis. Acta Pharm Sin B. 2023 Apr; 13(4):1554-1567.