邪惡推手：apCAFs新亞群誘導(dǎo)Treg細(xì)胞擴(kuò)增

實驗方法：免疫組化，RT-qPCR，WB，小鼠模型，譜系追蹤測定，腫瘤類器官，流式分選，細(xì)胞共培養(yǎng)，Treg抑制實驗，RNA測序，單細(xì)胞RNA測序及其生信分析

最新研究發(fā)現(xiàn)了一種獨(dú)特的癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAF）群體，稱為抗原呈遞CAFs（apCAFs），其特征是主要MHC II類分子的表達(dá)，表明其具有調(diào)節(jié)腫瘤免疫方面的功能。本研究通過整合多項單細(xì)胞RNA測序和進(jìn)行穩(wěn)健的譜系追蹤分析，發(fā)現(xiàn)apCAFs來源于間皮細(xì)胞；在胰管腺癌（PDA）進(jìn)展過程中，間皮細(xì)胞通過下調(diào)間皮特征并獲得成纖維細(xì)胞特征形成apCAFs，這一過程由IL-1和TGF-β誘導(dǎo)；apCAFs以抗原特異性方式直接連接并誘導(dǎo)初始CD4+ T細(xì)胞分化為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）；靶向間皮細(xì)胞標(biāo)志物mesothelin可有效抑制間皮細(xì)胞向apCAF轉(zhuǎn)化和apCAF誘導(dǎo)的Treg形成。

技術(shù)路線：

主要實驗結(jié)果：

1、apCAFs來源于間皮細(xì)胞

作者之前通過scRNA-seq分析了多種PDA的基因工程小鼠模型（GEMMs）（正常胰腺、早期KIC、晚期KIC、晚期KPC和晚期KPfC [Kras^LSL-G12D/+; Trp53 ^fl/fl; Pdx1^Cre/+]），并確定了正常胰腺和早期PDA中的三個成纖維細(xì)胞群（FB1、FB2和FB3）以及后期PDA中的兩個群（FB1和FB3）。為了解成纖維細(xì)胞在這些模型之間的關(guān)系，將來自正常胰腺、早期KIC、晚期KIC、晚期KPC和晚期KPfC的所有成纖維細(xì)胞投影到tSNE圖上，并進(jìn)行聚類（圖1A），并鑒定到成纖維細(xì)胞的四種分子亞型（圖1B），其中FB1和FB2在此前的報道中已有描述，但此前鑒定的FB3亞群在這里聚為了3類，所以命名為FB3和FB3B，其中FB3B在所有晚期GEMMs中都有特異性擴(kuò)增（圖1C）。然后研究FB3A和FB3B的轉(zhuǎn)錄譜，發(fā)現(xiàn)每個亞型都以MHC II通路和間皮細(xì)胞基因的表達(dá)為特征（圖1D-1E）。但與FB3A相比，F(xiàn)B3B的間皮標(biāo)志基因表達(dá)水平較低，炎癥和肌纖維母細(xì)胞性基因表達(dá)水平升高（圖1D，1F）。這些數(shù)據(jù)表明FB3A和FB3B為間皮細(xì)胞，F(xiàn)B3A為正常間皮細(xì)胞，F(xiàn)B3B為成纖維表型的間皮細(xì)胞。

為了解這些間皮細(xì)胞相關(guān)群體之間的關(guān)系，作者整合了三個成纖維細(xì)胞數(shù)據(jù)集，并使用UMAP進(jìn)行聚類和降維，結(jié)果顯示來成纖維細(xì)胞分為11個不同的集群（圖1G）。為識別間皮細(xì)胞簇，生成MHC II通路和間皮細(xì)胞基因的UMAP圖，發(fā)現(xiàn)聚類7和9表達(dá)這些特征基因（圖1H）。根據(jù)數(shù)據(jù)集的來源強(qiáng)調(diào)成纖維細(xì)胞的分布，以了解FB3A、FB3B、apCAFs和正常間皮細(xì)胞之間的關(guān)系（圖1I）。發(fā)現(xiàn)合并數(shù)據(jù)中的聚類7（圖1G）具有與FB3A相同的特征，聚類9與FB3A相同，提示簇7代表正常間皮細(xì)胞，簇9代表成纖維細(xì)胞間皮細(xì)胞群。因此，本研究中將簇9定義為apCAFs，簇7定義為正常間皮細(xì)胞。

圖1 scRNA-seq綜合分析正常間皮細(xì)胞與apCAFs的關(guān)系

2、在PDA進(jìn)展過程中，間皮細(xì)胞擴(kuò)張并促進(jìn)粘連形成

收集3只KPfC小鼠的晚期腫瘤（PDA1、PDA2、PDA3），消化成單細(xì)胞懸液，分析apCAFs的比例（圖2A），發(fā)現(xiàn)所有三種腫瘤都由apCAFs組成，其百分比與iCAFs和myCAFs相當(dāng)。為追蹤PDA進(jìn)展過程中間皮細(xì)胞的命運(yùn)，作者使用CFSE燃料進(jìn)行譜系追蹤測定，將CFSE注射到野生型小鼠的腹腔內(nèi)，并在2天后獲取胰腺，發(fā)現(xiàn)正常胰腺的間皮被細(xì)胞示蹤染料標(biāo)記（圖2B），相反，在60天大的KIC或KPfC荷瘤小鼠身上進(jìn)行了同樣的檢測，并且發(fā)現(xiàn)CFSE標(biāo)記的細(xì)胞從間皮區(qū)域滲入到腫瘤基質(zhì)中（圖2B）。為確保CFSE信號是間皮細(xì)胞特異性的，將CFSE標(biāo)記的組織與cadherin-11共同染色（圖2C），發(fā)現(xiàn)在正常的胰腺和PDA中，CFSE+細(xì)胞也是cadherin-11+；此外，與胰腺癌細(xì)胞標(biāo)志物SOX9共同染色，發(fā)現(xiàn)CFSE+的細(xì)胞與SOX9+的癌細(xì)胞不同（圖2C），進(jìn)一步支持CFSE信號對間質(zhì)細(xì)胞的特異性。

鑒于在胚胎發(fā)育過程中，間皮細(xì)胞可以分化為成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，所以作者用正常的間皮細(xì)胞（簇7）、apCAF（簇9）和其他密切相關(guān)的成纖維細(xì)胞群（集群1、4、8和10）進(jìn)行偽時間分析，發(fā)現(xiàn)盡管正常的間皮細(xì)胞在成為apCAF時獲得了成纖維細(xì)胞的特征并趨向于成纖維細(xì)胞，但它們對其他CAF群體的形成貢獻(xiàn)有限（圖2D），這支持iCAF和myCAF系來自常駐成纖維細(xì)胞。由于apCAFs通過下調(diào)間皮細(xì)胞基因和上調(diào)成纖維細(xì)胞基因獲得了差異基因標(biāo)簽（圖2E），所以對apCAFs中上調(diào)的基因進(jìn)行通路和功能富集分析，以確定驅(qū)動這種基因特征變化的生物學(xué)過程，結(jié)果發(fā)現(xiàn)許多已識別的生物過程與損傷或炎癥反應(yīng)有關(guān)（圖2F），這表明來自腫瘤小生境的創(chuàng)傷相關(guān)信號可以誘導(dǎo)apCAF的形成。

圖2 間皮細(xì)胞在PDA形成過程中擴(kuò)增并獲得成纖維細(xì)胞特征

3、創(chuàng)傷相關(guān)腫瘤旁分泌信號誘導(dǎo)間皮細(xì)胞—apCAF轉(zhuǎn)變

為驗證間皮細(xì)胞—apCAF的轉(zhuǎn)化，以及在PDA進(jìn)展過程中確定間皮細(xì)胞的命運(yùn)，利用一個由間皮細(xì)胞特異性基因Wt1啟動子驅(qū)動的可誘導(dǎo)Cre-loxP系統(tǒng)構(gòu)建Wt1^CreERT2;R26^LSL-tdTomato模型（圖3A）。Wt1^CreERT2/+;R26^{LSL-tdTomato/+}小鼠在Wt1基因位點表達(dá)Cre-ERT2融合蛋白。CreERT2在他莫昔芬（TAM）處理后會從R26位點切除LSL序列，這將不可逆地誘導(dǎo)tdTomato表達(dá)。將TAM注射入Wt1^CreERT2;R26^LSL-tdTomato模型小鼠并收集胰腺（圖3B）。結(jié)果顯示正常胰腺間皮表達(dá)tdTomato（圖3C-3D）。作為陰性對照，R26^LSL-tdTomato小鼠沒有Wt1^CreERT2不表達(dá)tdTomato（圖3E）。接下來，追蹤PDA進(jìn)展過程中間皮細(xì)胞的命運(yùn)。將Wt1^CreERT2;R26^LSL-tdTomato小鼠胰腺內(nèi)的間皮細(xì)胞標(biāo)記為tdTomato+，原位注射源自KPfC小鼠的同基因PDA細(xì)胞系，在植入后3周收獲成熟腫瘤（圖3B），發(fā)現(xiàn)間皮細(xì)胞在PDA中大量擴(kuò)增，tdTomato+細(xì)胞分布在腫瘤周圍和內(nèi)部（圖3F-H）。此外，在正常胰腺中，間皮細(xì)胞不表達(dá)成纖維細(xì)胞標(biāo)志物，如aSMA和IL-6（圖3C-3D），而PDA內(nèi)可見tdTomato+aSMA+（圖3F）或tdTomato+IL-6+（圖3G）細(xì)胞。間皮譜系追蹤實驗強(qiáng)有力的證明間皮細(xì)胞獲得成纖維細(xì)胞特征，并有助于PDA的間質(zhì)形成。

圖3 PDA中間皮細(xì)胞的譜系示蹤與可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因小鼠模型

4、間皮細(xì)胞系再現(xiàn)間皮細(xì)胞—apCAF轉(zhuǎn)變

為研究腫瘤旁分泌信號是否能誘導(dǎo)間皮細(xì)胞分化為apCAFs，建立小鼠胰腺間皮細(xì)胞系。將間皮外植體接種到組織培養(yǎng)皿中，接種后5天，細(xì)胞開始從間皮遷移（圖4A）。一旦融合，這些細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)，其中95%的細(xì)胞為podoplanin和MHC II雙陽細(xì)胞（圖4A），將這些細(xì)胞命名為胰腺間皮細(xì)胞（PanMeso）。對第10-20代PanMeso細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)其具有穩(wěn)定的間皮基因標(biāo)簽和低表達(dá)的成纖維細(xì)胞基因（圖4B）。用KPfC PDA類器官條件培養(yǎng)（CM）基處理PanMeso細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其顯著降低間皮細(xì)胞基因的表達(dá)（圖4C）。對差異上調(diào)的基因進(jìn)行功能富集分析，發(fā)現(xiàn)其主要參與傷口和炎癥響應(yīng)（圖4D），這與單細(xì)胞測序結(jié)果一致。進(jìn)一步對腫瘤進(jìn)行eGFP和aSMA或IL-6的IHC染色，發(fā)現(xiàn)TME誘導(dǎo)eGFP+ PanMeso細(xì)胞表達(dá)aSMA和IL-6（圖4E和4F）。綜上所述，使用PanMeso細(xì)胞的體外數(shù)據(jù)再現(xiàn)了間皮細(xì)胞的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并強(qiáng)調(diào)了腫瘤旁分泌信號在促進(jìn)這一過程中的重要性。

圖4 PanMeso細(xì)胞中間皮細(xì)胞- apCAF轉(zhuǎn)變的概述

5、apCAFs誘導(dǎo)幼稚CD4+ T細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)門regs細(xì)胞

采用圖5A中的方案對KPfC腫瘤進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分選，對分選的細(xì)胞進(jìn)行OVA處理，然后和CD4+ T細(xì)胞共培養(yǎng)。結(jié)果顯示正常間皮細(xì)胞和apCAFs能以O(shè)VA依賴的方式誘導(dǎo)T細(xì)胞擴(kuò)增早期激活標(biāo)志物CD25和CD69的表達(dá)，而iCAFs和myCAFs則不能（圖5B-C）。隨后使用PanMeso細(xì)胞重復(fù)上述實驗（圖5A），PDA類器官CM誘導(dǎo)的apCAFs形成導(dǎo)致PanMeso細(xì)胞的抗原提呈能力增加（圖5B-C）。

隨后為探究apCAFs是否誘導(dǎo)Treg細(xì)胞形成，檢測和OVA處理的apCAFs細(xì)胞共培養(yǎng)的CD4+ T細(xì)胞的Treg細(xì)胞的存在，結(jié)果顯示apCAFs以抗原特異性的方式誘導(dǎo)Treg的形成（圖5D-E）。進(jìn)一步檢測apCAFs誘導(dǎo)形成的Tregs細(xì)胞的免疫抑制功能，如圖5F-G所示，其顯著抑制CD8+ T細(xì)胞的增殖。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明apCAFs可能是一個獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)CAF群體，可以通過抗原依賴的TCR連接誘導(dǎo)Treg的形成和擴(kuò)增。

圖5 apCAFs誘導(dǎo)幼稚CD4 + T細(xì)胞進(jìn)入Tregs

6、apCAFs存在于人類腫瘤中并與Tregs相關(guān)

為證明apCAFs與人類的相關(guān)性，收集人PDA腫瘤組織并進(jìn)行多色免疫熒光觀察apCAFs與Tregs。PDGFRa在除了間質(zhì)細(xì)胞外的所有CAF類群中表達(dá)，所以PDGFRa⁺CD74⁺特異性標(biāo)記apCAFs，PDGFRa⁺CD74^—標(biāo)記其余類型CAFs（圖6A）。結(jié)果顯示，在人PDA中，apCAFs豐度具有異質(zhì)性（圖6B），并且與Tregs具有相關(guān)性，與其它CAF無相關(guān)性（圖6C-D）。此外，作者使用上述小鼠apCAFs基因特征表征了兩個人PDA和卵巢癌的單細(xì)胞數(shù)據(jù)集，發(fā)現(xiàn)兩者間有重疊（圖6F-G）。因此，以上表明在人腫瘤中也存在apCAFs并與Tregs相關(guān)。

圖6 apCAFs存在于人類腫瘤中，并與Treg相關(guān)

7、IL-1和TGF-β參與間皮細(xì)胞—apCAF轉(zhuǎn)化

為確定驅(qū)動間皮細(xì)胞向apCAF轉(zhuǎn)化的信號通路，提取在apCAF中上調(diào)的差異基因，并對它們進(jìn)行motif富集分析，鑒定到NF-kB通路的Nfkb1和Rela，TGF-β信號通路的Smad1，Smad3，Smad4（圖7A）。IL-1誘導(dǎo)的NF-kB信號通路被預(yù)測負(fù)責(zé)iCAF譜系的形成，而TGFβ被預(yù)測驅(qū)動myCAF譜系。為驗證這一結(jié)果，使用PDA類器官CM處理PanMeso細(xì)胞，結(jié)果顯示NF-kB和TGF-β信號通路均被激活了（圖7B）。隨后檢測IL-1和TGFβ是否驅(qū)動間皮細(xì)胞的apCAF表型，結(jié)果顯示，與對照組比較，IL-1和TGFβ處理的PanMeso細(xì)胞中間質(zhì)細(xì)胞基因的表達(dá)顯著下降（圖7C），相反成纖維細(xì)胞相關(guān)基因顯著上調(diào)表達(dá)（圖7D）。這些結(jié)果表明IL-1和TGFβ可以驅(qū)動間皮細(xì)胞向apCAF表型轉(zhuǎn)化。

接下來探究IL-1和TGFβ是否影響間皮細(xì)胞的功能。結(jié)果顯示OVA特異性TCR激活被IL-1和/或TGFβ預(yù)處理的PanMeso細(xì)胞增強(qiáng)（圖7E-7F）。此外，IL-1和/或TGFβ預(yù)處理的PanMeso細(xì)胞顯著增強(qiáng)Treg細(xì)胞數(shù)量（圖7G-7H）。以上數(shù)據(jù)表明，IL-1/NF-kB和TGFb信號通路負(fù)責(zé)正常間皮細(xì)胞分化為apCAFs，并具有活化CD4+ T細(xì)胞和促進(jìn)其分化為Treg的能力。

圖7 IL-1和TGF-β參與間皮細(xì)胞—apCAF轉(zhuǎn)化

8、靶向間皮素可抑制間皮細(xì)胞向apCADs轉(zhuǎn)化

有兩篇報道使用小鼠特異性阻斷單克隆抗體（mAb）對抗間皮細(xì)胞標(biāo)記物間皮素（MSLN Ab）來抑制間皮細(xì)胞向成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)變。因此，作者測試了mAb對間皮細(xì)胞apCAF形成的影響。使用PDA類器官CM、對照Ab、MSLN Ab處理PanMeso細(xì)胞，結(jié)果顯示MSLN Ab顯著抑制由PDA類器官CM引起的間質(zhì)基因的下調(diào)和EMT及成纖維細(xì)胞基因的上調(diào)（圖8A）。在小鼠體內(nèi)，MSLN Ab顯著減少TAM誘導(dǎo)的Wt1^CreERT2;R26^LSL-tdTomato小鼠的tdTomato陽性細(xì)胞（圖8B-C）、tdTomato+aSMA/IL6+雙陽性細(xì)胞（圖8D-E）。

功能實驗顯示，MSLN Ab可抑制因PanMeso細(xì)胞的PDA類器官CM引起的抗原呈遞和Treg細(xì)胞誘導(dǎo)能力（圖8F-I）。重要的是，MSLN Ab可抑制腫瘤生長和腫瘤中Treg細(xì)胞比例（圖8J-M）。綜上所述，以上表明靶向MSLN可能是有效抑制間皮細(xì)胞向apCAF轉(zhuǎn)化和克服apCAF誘導(dǎo)的免疫抑制的潛在策略。

圖8靶向間皮素可抑制間皮細(xì)胞向apCADs轉(zhuǎn)化

參考文獻(xiàn)：

Huang H, Wang Z, Zhang Y, Pradhan RN, Ganguly D, Chandra R, Murimwa G, Wright S, Gu X, Maddipati R, Müller S, Turley SJ, Brekken RA. Mesothelial cell-derived antigen-presenting cancer-associated fibroblasts induce expansion of regulatory T cells in pancreatic cancer. Cancer Cell. 2022 Jun 13;40(6):656-673.e7. doi: 10.1016/j.ccell.2022.04.011. Epub 2022 May 5. PMID: 35523176; PMCID: PMC9197998.