在上皮性卵巢癌模型中，ODF2L作為WEE1抑制的合成致死伴侶

實(shí)驗(yàn)方法：抗體和小分子抑制劑，合成致死性RNAi篩選，細(xì)胞活力測定和菌落形成試驗(yàn)，細(xì)胞同步和G1/S釋放，CDK1激酶活性測定，EdU摻入試驗(yàn)，蛋白過表達(dá)的質(zhì)粒構(gòu)建，BRET化驗(yàn)

WEE1已成為上皮性卵巢癌(EOC)的一個有吸引力的靶點(diǎn)，但EOC細(xì)胞如何改變其對WEE1抑制的敏感性尚不清楚。本文通過細(xì)胞周期機(jī)制相關(guān)基因RNAi篩選，發(fā)現(xiàn)靶向精子尾部外致密纖維2樣(ODF2L)是EOC細(xì)胞中具有WEE1激酶抑制作用的合成致死伴侶。在體外和體內(nèi)異種移植的EOC細(xì)胞系中，敲低ODF2L可使細(xì)胞對WEE1抑制劑AZD1775敏感。機(jī)制上，ODF2L丟失后對WEE1抑制的敏感性增加伴隨著DNA損傷的累積。ODF2L將WEE1的功能冗余激酶PKMYT1募集到CDK1-cyclin B復(fù)合物上，從而在WEE1被抑制時限制了CDK1的活性。臨床上，O?DF2L的上調(diào)與患者來源的EOC細(xì)胞中CDK1活性、DNA損傷水平和對WEE1抑制的敏感性相關(guān)。此外，在EOC患者來源的異種移植模型中，ODF2L水平預(yù)測了對WEE1抑制的反應(yīng)。在ID8卵巢癌同基因小鼠模型中，包裝ODF2L siRNA和AZD1775的腫瘤靶向脂質(zhì)納米顆粒聯(lián)合治療可協(xié)同抑制腫瘤生長。這些數(shù)據(jù)表明，對于表達(dá)低水平ODF2L的EOC細(xì)胞，WEE1抑制是一種很有前景的精確治療策略。

技術(shù)路線：

結(jié)果：

(1) EOC細(xì)胞中ODF2L的表達(dá)與對WEE1抑制的敏感性相關(guān)

為深入了解影響EOC細(xì)胞對WEE1抑制敏感性的機(jī)制，我們使用從TRC慢病毒shRNA文庫中篩選的定制慢病毒shRNA文庫進(jìn)行了細(xì)胞周期機(jī)制相關(guān)基因RNAi篩選，并針對由1,295個shRNA構(gòu)建物代表的263個人類細(xì)胞周期相關(guān)基因。初步篩選涉及將A2780轉(zhuǎn)化為含有針對263個單個基因的shRNA的慢病毒池，并用亞致死劑量的AZD1775處理它們。從使用A2780細(xì)胞的初級篩選中，從263個基因中選擇前30個基因進(jìn)行二級驗(yàn)證篩選(圖1A)。ODF2L在初級篩選中被確定為第三個最有效的靶點(diǎn)，并在次級篩選中作為先導(dǎo)靶點(diǎn)出現(xiàn)，因?yàn)樗孤殉舶╊愋偷陌┘?xì)胞對WEE1抑制敏感(圖1B)。ODF2L的表達(dá)與卵巢癌對AZD1775的耐藥性呈正相關(guān)(圖1C)。為了進(jìn)一步證實(shí)ODF2L參與了EOC對WEE1抑制的應(yīng)答，我們建立了體內(nèi)AZD1775耐藥模型，模擬化療耐藥的臨床發(fā)展過程(圖1D)。用A2780細(xì)胞接種裸鼠SC。在AZD1775的作用下，A2780異種移植物在最初15天內(nèi)生長緩慢。然而，腫瘤的生長最終在晚期明顯增加。在終點(diǎn)處死小鼠進(jìn)行腫瘤切除，AZD1775處理組與對照組之間腫瘤體積無顯著差異(圖1D)。相比之下，AZD1775處理后的腫瘤細(xì)胞中AZD1775 IC50比未經(jīng)處理的腫瘤細(xì)胞增加了約4.5倍(圖1E)，表明在體內(nèi)成功誘導(dǎo)了對WEE1誘導(dǎo)的抗性。在這個體內(nèi)模型中，AZD1775處理組的腫瘤細(xì)胞中ODF2L的表達(dá)顯著增加，通過RT-qPCR和免疫印跡驗(yàn)證了這一點(diǎn)(圖1F)。在來自配對親本細(xì)胞系的4個AZD1775抗性卵巢細(xì)胞系中，ODF2L的表達(dá)一致且顯著增加(圖1G)。此外，在RNAi篩選中鑒定的30個基因中，有19個在具有WEE1抑制的特定親本細(xì)胞系中具有亞致死功能(圖1B)，并且它們在配對抗性細(xì)胞系中的表達(dá)特異性增加。綜上所述，ODF2L表達(dá)與卵巢癌對WEE1抑制的敏感性呈負(fù)相關(guān)。

圖1：EOC細(xì)胞中ODF2L的表達(dá)與對WEE1抑制的敏感性相關(guān)?

(2) ODF2L在EOC細(xì)胞中作為WEE1的合成致死伴侶

為了研究ODF2L在EOC細(xì)胞對WEE1抑制反應(yīng)中的作用，我們在4個EOC細(xì)胞系中使用2個不同的shRNA克隆靶向下調(diào)ODF2L(圖2A)。雖然單獨(dú)敲除ODF2L不會顯著降低細(xì)胞活力或集落形成潛力，但在亞致死劑量AZD1775處理后，ODF2L的缺失導(dǎo)致細(xì)胞活力和集落形成顯著降低(圖2A, B)。此外，使用FACS， ODF2L敲除顯著加重了亞致死劑量AZD1775處理的EOC細(xì)胞的凋亡細(xì)胞死亡。進(jìn)一步證實(shí)了ODF2L在EOC細(xì)胞中作為WEE1的合成致死伴侶的作用(圖2C)。此外，在異種移植小鼠模型中，還觀察到ODF2L缺失后對AZD1775處理的致敏性。在AZD1775處理的小鼠中，ODF2L敲低導(dǎo)致腫瘤生長和腫瘤大小顯著降低(圖2D, E)。這些數(shù)據(jù)表明，ODF2L表達(dá)顯著影響EOC細(xì)胞對WEE1抑制的反應(yīng)。

圖2：ODF2L在EOC細(xì)胞中作為WEE1的合成致死伴侶

(3) ODF2L缺失加重了WEE1抑制引起的EOC細(xì)胞DNA損傷

WEE1抑制可通過CDK1的異位激活促進(jìn)有絲分裂進(jìn)入并增加基因組的不穩(wěn)定性。組成型活性CDK1 T14A/Y15F突變體的單等位基因表達(dá)可誘導(dǎo)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEFs)的復(fù)制應(yīng)激和細(xì)胞死亡，并顯著增加γ-H2AX水平、染色體斷裂和DNA損傷反應(yīng)(DDR)激活。為深入了解ODF2L使細(xì)胞對AZD1775敏感的機(jī)制，我們使用DSB標(biāo)記物γH2AX來監(jiān)測DNA損傷水平。如圖3A所示，在A2780和SKOV3細(xì)胞中，通過免疫熒光染色檢測，AZD1775處理后，ODF2L敲低顯著增加了γ-H2AX⁺細(xì)胞的百分比。與γ-H2AX一致，與對照細(xì)胞相比，在AZD1775處理下，ODF2L敲低的細(xì)胞中，彗星尾部的DNA數(shù)量(圖3B)和ATM、CHK2和RPA32/RPA2的磷酸化水平(圖3C)顯著增加。為了測試DNA損傷的增加是否是ODF2L敲除細(xì)胞中存在WEE1抑制的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的綜合缺陷的結(jié)果，我們使用基于click化學(xué)的EdU測定法結(jié)合DNA含量染色Hoechst 33342來監(jiān)測細(xì)胞周期分布。如圖3D所示，AZD1775處理下，ODF2L敲低細(xì)胞中DNA含量介于1C和2C之間但EdU-(1C<DNA含量<2C/EdU-)的細(xì)胞群百分比顯著增加，這也可以通過在ODF2L敲低細(xì)胞中強(qiáng)制表達(dá)耐shRNA的ODF2L來挽救(補(bǔ)充圖未展示)。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持了ODF2L缺失和WEE1抑制的結(jié)合導(dǎo)致非計劃進(jìn)入有絲分裂，導(dǎo)致有絲分裂中DNA含量不完全的細(xì)胞數(shù)量顯著增加，這是一種有害的DNA損傷形式。與此結(jié)果一致的是，通過流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞分選后的免疫印跡檢測，DNA含量在1C和2C之間但EdU-(1C<DNA含量<2C/EdU-)的細(xì)胞群表達(dá)了大量的γ-H2AX(圖3E)。以上結(jié)果表明，ODF2L敲低可促進(jìn)EOC細(xì)胞周期失調(diào)，進(jìn)一步加重WEE1抑制誘導(dǎo)的DNA損傷。

圖3：ODF2L缺失加重了WEE1抑制引起的EOC細(xì)胞DNA損傷

(4) ODF2L抑制AZD1775誘導(dǎo)的CDK1活性

我們探討了ODF2L在EOC細(xì)胞中促進(jìn)細(xì)胞周期失調(diào)并進(jìn)一步加劇WEE1抑制誘導(dǎo)的DNA損傷的機(jī)制。考慮到WEE1的主要下游靶點(diǎn)是CDK1-cyclin B1復(fù)合物，我們首先通過監(jiān)測體外CDK1活性的變化來檢測當(dāng)WEE1被抑制時，ODF2L是否恢復(fù)了CDK1的失活。首先，在G1-S釋放后，用AZD1775處理ODF2L敲低或過表達(dá)的細(xì)胞和指定的對照細(xì)胞4小時。然后提取細(xì)胞裂解液并與重組CDK1底物GST-PP1Cα孵育。然后我們通過Western blotting定量pT320 GST-PP1Cα的總水平以監(jiān)測CDK1活性。ODF2L敲低和WEE1抑制的結(jié)合增強(qiáng)了CDK1的活性(圖4A)，延長了CDK1的激活狀態(tài)(補(bǔ)充圖未展示)。Tyr15和Thr14的磷酸化是控制CDK1活性的關(guān)鍵，這使CDK1-cyclin B1復(fù)合物在細(xì)胞接近有絲分裂前受到抑制。WEE1特異性磷酸化CDK1的Tyr15，而PKMYT1在Tyr15和Thr14上具有雙重活性。我們觀察到ODF2L的缺失影響Tyr15和Thr14的磷酸化，尤其是CDK1中Thr14磷酸化的強(qiáng)烈衰減，與PKMYT1的功能驚人地相似(圖4B)。為了確定ODF2L是否在CDK1 Thr14磷酸化中起重要作用，我們產(chǎn)生了表達(dá)CDK1 T14A-、CDK1 Y15F-或CDK1 WT-的EOC細(xì)胞，去除內(nèi)源性CDK1，并監(jiān)測AZD1775處理下這些EOC細(xì)胞中CDK1活性的變化。ODF2L缺失顯著增加了CDK1 WT細(xì)胞的CDK1活性，但在CDK1 T14A細(xì)胞中沒有(圖4C)。相反，當(dāng)ODF2L被敲低時，在CDK1 WT和CDK1 Y15F細(xì)胞中也同樣觀察到CDK1活性的增加(圖4D)，這表明ODF2L可能特異性地通過CDK1 Thr14磷酸化來抑制WEE1抑制下的CDK1活性。與WEE1抑制后的對照細(xì)胞相比，使用CDK1抑制劑Ro-3306治療可以有效地挽救ODF2L敲除細(xì)胞的集落形成潛力(圖4E)，并減少凋亡細(xì)胞死亡(圖4F)。綜上所述，ODFL2可以促進(jìn)CDK1 Thr14磷酸化，從而在WEE1抑制的情況下抑制EOC細(xì)胞中的CDK1活性。

圖4：ODF2L抑制AZD1775誘導(dǎo)的CDK1活性

(5) ODF2L允許PKMYT1招募到CDK1復(fù)合體

我們探討了ODF2L如何在WEE1抑制的情況下促進(jìn)EOC細(xì)胞中CDK1的磷酸化。與WEE1和PKMYT1水平與其底物CDK1水平之間的強(qiáng)相關(guān)性類似，ODF2L水平也與CDK1水平顯著相關(guān)(圖5A)。因此，ODF2L可能參與WEE1或PKMYT1復(fù)合物調(diào)控CDK1磷酸化?？紤]到ODF2L在調(diào)節(jié)CDK1磷酸化Thr14 (p-Thr14)中的作用與PKMYT1重疊，我們首先測試了ODF2L是否與PKMYT1共同調(diào)節(jié)CDK1磷酸化。G1-S釋放4小時后提取EOC細(xì)胞裂解液，用于對ODF2L或PKMYT1的免疫沉淀。ODF2L和PKMYT1之間有很強(qiáng)的相互作用(圖5B)。ODF2L敲低在很大程度上減少了EOC細(xì)胞中CDK1免疫沉淀復(fù)合物中PKMYT1的存在(圖5C)；相比之下，PKMYT1敲低對EOC細(xì)胞CDK1免疫沉淀復(fù)合物中ODF2L的水平?jīng)]有顯著影響(圖5D)。此外，在完整細(xì)胞的背景下，CDK1和PKMYT1之間的相互作用也被ODF2L的敲低所消除，這可以通過恢復(fù)ODF2L的表達(dá)來恢復(fù)，正如在共轉(zhuǎn)染了Halo-PKMYT1和Nluc-CDK1的EOC細(xì)胞中進(jìn)行的生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(BRET)實(shí)驗(yàn)所示(圖5E)。在轉(zhuǎn)染了表達(dá)有Flag標(biāo)記的ODF2L的n端、中程和c端結(jié)構(gòu)域的質(zhì)粒的EOC細(xì)胞中，通過對Flag的免疫沉淀，我們證實(shí)了ODF2L的n端和c端結(jié)構(gòu)域分別直接與PKMYT1和CDK1相互作用(圖5F)。一致地，在EOC細(xì)胞中，PKMYT1的過表達(dá)或下調(diào)分別增加或降低對AZD1775的抗性，而ODF2L的下調(diào)則完全消除了這種作用(圖5G, H)，這表明ODF2L在介導(dǎo)PKMYT1恢復(fù)G2/M檢查點(diǎn)方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用。單獨(dú)敲除ODF2L比敲除PKMYT1在致敏AZD1775方面更有效，這可能是因?yàn)闅埩舻腜KMYT1仍然可以被ODF2L募集和富集以滅活CDK1(圖5H)。綜上所述，ODF2L介導(dǎo)了PKMYT1與CDK1復(fù)合物的相互作用，因此當(dāng)WEE1在EOC細(xì)胞中被抑制時，PKMYT1使CDK1和G2/M檢查點(diǎn)恢復(fù)失活。

圖5：ODF2L允許PKMYT1招募到CDK1復(fù)合體

(6) ODF2L表達(dá)水平與AZD1775在EOC中的敏感性有臨床相關(guān)性

為了進(jìn)一步驗(yàn)證ODF2L與WEE1抑制EOC應(yīng)答之間的關(guān)系，我們在一組來自57例卵巢癌患者組織樣本的AZD1775處理的原代EOC細(xì)胞中檢測了ODF2L水平、CDK1活性和細(xì)胞活力的相關(guān)性。為了檢測CDK1活性，分離的原代細(xì)胞在G1-S釋放后用AZD1775處理4小時。然后提取細(xì)胞裂解液并與重組CDK1底物GST-PP1Cα孵育。然后用Western blotting檢測細(xì)胞總裂解物中p-Thr320 GST-PP1Cα和ODF2L的總水平，并用ImageJ軟件進(jìn)行定量(圖6A)。我們還監(jiān)測了AZD1775處理后72小時的細(xì)胞活力(圖6B)。在AZD1775處理的原代EOC細(xì)胞中，ODF2L表達(dá)水平與CDK1活性呈強(qiáng)負(fù)相關(guān)(圖6C)，與細(xì)胞活力呈顯著正相關(guān)(圖6D)，表明ODF2L在EOC細(xì)胞對WEE1抑制的反應(yīng)中起重要作用。此外，ODF2L表達(dá)水平也預(yù)測了患者源性異種移植(PDX)小鼠模型體內(nèi)對AZD1775治療的不同反應(yīng)。AZD1775治療在ODF2L低表達(dá)的患者癌組織中導(dǎo)致腫瘤生長明顯延遲，而在ODF2L高表達(dá)的患者癌組織中則沒有(圖6E)。綜上所述，這些結(jié)果有力地支持了ODF2L表達(dá)水平在臨床上與AZD1775在EOC中的敏感性相關(guān)的觀點(diǎn)。

圖6：ODF2L表達(dá)水平與AZD1775在EOC中的敏感性有臨床相關(guān)性

(7) 在同基因小鼠模型中，使用RNAi治療平臺靶向ODF2L可使卵巢癌細(xì)胞對WEE1抑制劑治療增敏

ODF2L是WEE1的合成致死伙伴，ODF2L的缺失使卵巢癌對WEE1抑制劑的反應(yīng)增敏，這表明ODF2L可能是卵巢癌治療的一個有希望的轉(zhuǎn)化靶點(diǎn)。我們利用之前建立的卵巢癌ID8Luc同基因小鼠模型，評估了靶向ODF2L聯(lián)合WEE1抑制劑的體內(nèi)治療潛力。ODF2L是一種沒有市售抑制劑的支架蛋白；因此，我們使用靶向RNAi治療性脂質(zhì)納米顆粒(LNP)平臺ASSET(錨定繼發(fā)性scFv靶向)在體內(nèi)特異性地降低ID8癌細(xì)胞中的ODF2L。通過與識別大鼠IgG2a Fc區(qū)(ASSET)的脂質(zhì)錨定單鏈抗體連接體結(jié)合，這些靶向LNPs被細(xì)胞靶向抗體包裹。由于卵巢ID8細(xì)胞特異性且高度表達(dá)EGFR，我們將負(fù)載ODF2L siRNA (siODF2L-loaded)或負(fù)載scramble siRNA (siScramble-loaded)的LNPs包被抗EGFR抗體，并將其靶向到ID8細(xì)胞(圖7A)。腹腔轉(zhuǎn)移性ID8-Luc腫瘤小鼠在腫瘤接種后7天腹腔注射與抗EGFR結(jié)合的siScramble-LNPs或siODF2L-LNPs (0.75 mg/kg)，同時每天注射DMSO或AZD1775 (30 mg/kg)。采用活體生物發(fā)光成像(BLI)監(jiān)測腫瘤生長情況。siODF2L-LNPs和AZD1775聯(lián)合使用可顯著抑制腫瘤生長潛力，而對照小鼠，單獨(dú)使用siODF2L-LNPs或單獨(dú)使用AZD1775均未觀察到腫瘤生長的顯著差異(圖7B, C)。一致地，總生存率顯著提高(圖7D)，腹膜出血性腹水減少，ODF2L丟失和AZD1775聯(lián)合治療組腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)減少(圖7E)。siODF2L-LNPs治療成功地降低了ODF2L在ID8腫瘤中的表達(dá)，但在主要器官，包括心臟、肝臟、脾臟、肺和肝臟(圖7F)中沒有降低ODF2L的表達(dá)(圖7F)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞中CDK1的大量激活(圖7F)和DNA損傷加劇(圖7G)。這些數(shù)據(jù)為ODF2L與WEE1抑制劑在卵巢癌治療中作為有效的合成致死靶標(biāo)伴侶提供了原理證明。

圖7：在同基因小鼠模型中，使用RNAi治療平臺靶向ODF2L使卵巢癌細(xì)胞對WEE1抑制劑治療增敏

結(jié)論：ODF2L是WEE1的合成致死伴侶，在恢復(fù)人類EOC細(xì)胞中AZD1775抗性G2/M細(xì)胞周期檢查點(diǎn)信號通路中起關(guān)鍵作用。臨床上，ODF2L可作為一種預(yù)測標(biāo)志物，并作為一種有希望的治療靶點(diǎn)，聯(lián)合WEE1抑制劑治療EOC患者。

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