TGF-β信號通過circRNA CDR1as促進宮頸癌轉移

實驗方法：芯片測序，RNase R消化實驗，RT-qPCR，Western blot，RNA 干擾，過表達，細胞遷移實驗，傷痕愈合實驗，熒光原位雜交、RNA pull-down，RIP以及建立宮頸癌體內模型。

宮頸癌的發(fā)病率和死亡率由于宮頸癌轉移居高不下，轉移的總體生存率仍然很低。因此，有效的預測性生物標志物對于緩解病情進展至關重要。在這里，作者首先通過TGF-β誘導宮頸癌細胞，發(fā)現CDR1as顯著上調。接著通過CDR1as預測淋巴結轉移和不良預后并且實驗驗證CDR1as能促進宮頸癌細胞的轉移。為尋找與CDR1as相互作用的miRNA和蛋白，通過多種數據庫進行生物信息學分析預測到IGF2BPs與CDR1as相互作用，并通過RIP和RNA pull-down實驗驗證，表明IGF2BP1可能是一個特定的潛在下游靶點。接著作者分析了CDR1as上調后不同mRNA和m6A水平的變化，結果表明TGF-β信號通過CDR1as和m6A在宮頸癌細胞中激活EMT。這些數據表明，TGF-β信號通過circRNA CDR1as促進宮頸癌轉移。

技術路線：

主要實驗結果：

1、TGF - β誘導宮頸癌細胞中CDR1as表達上調

EMT是腫瘤進展過程中早期的標志之一，其信號維持在很大程度上依賴于TGF- β的激活。用SRI-011381處理Siha細胞3天后，Siha細胞誘導EMT表型（圖1A）。RNA測序顯示6964個circRNA表達上調，6596個circRNA表達下調（圖1B）。作者選擇了50個變化最明顯的環(huán)狀RNA（circRNA）進行RT-PCR檢測。結果顯示，CDR1as的變化倍數最大（圖1C）。因此，作者推測CDR1as參與TGF-β誘導的宮頸癌轉移。

圖1 TGF- β對宮頸癌細胞EMT的誘導作用

2、CDR1as與淋巴結轉移不良預后相關

RNase R酶切實驗顯示，環(huán)狀CDR1as只能在cDNA樣品中擴增，而CDR1在gDNA和cDNA中均存在線型CDR1as（圖2A）；RNase R消化后，環(huán)狀結構的穩(wěn)定性明顯高于線狀結構（圖2B）。Sanger測序結果顯示，擴增的寡核苷酸序列與circbase數據庫中的序列相似（圖2C）。這些結果表明CDR1as是一種環(huán)狀RNA。FISH和核漿萃取實驗顯示CDR1as主要在細胞質中表達（圖2D-E），這表明CDR1as可能在轉錄后起作用。采用原位雜交技術評估CDR1as與臨床參數的關系（圖2F，表2），結果顯示CDR1as在淋巴結轉移中表達較高（圖2G），與總生存期較短、預后較差相關（圖2K-L），但CDR1as與腫瘤分級、分期、原發(fā)腫瘤體積無顯著關系（圖2H-J）。

圖2 CDR1as預測淋巴結轉移和更差的總生存期

表2 CDR1as與臨床病理因素

3、CDR1as促進宮頸癌細胞的轉移

在三種癌細胞中過表達CDR1as后，qPCR結果顯示，CDR1as成功轉染到三種癌細胞中（圖3A-C）；細胞遷移實驗結果顯示，與對照組比較，癌細胞的侵襲率和轉移率分別增加了1.86倍和2.07倍，表明宮頸癌的轉移顯著加快（圖3D-G）；細胞劃痕實驗結果顯示，傷口愈合時間更短（圖3H-I），這二者結果表明癌細胞的活性增強。作者還通過檢測過表達CDR1as后細胞形態(tài)變化，以及RT-qPCR和Western blot檢測E-CAD、N-CAD和SLUG等的表達情況（圖3K-L）。這些結果表明CDR1as能促進宮頸癌的轉移。

圖3 CDR1as能促進宮頸癌細胞的轉移

4、CDR1as通過與IGF2BP1結合促進宮頸癌細胞的EMT

CDR1as過表達后，細胞呈紡錘形形態(tài)，而轉染載體的細胞上仍有明顯的邊緣，qPCR和Western blot結果顯示，CDR1as的升高降低了E-cadherin的表達，增加了間充質標志物N-cadherin和Vimentin的表達（圖3K-L），其中Slug的上調幅度最大。根據生物信息學分析，作者將幾個數據庫的搜索結果進行了重疊來鑒定CDR1as和miRNA之間的潛在結合，結果顯示25個miRNA與CDR1as結合。其中，經生物信息學預測，miR-203能夠調控Slug的表達。然而，CDR1as探針下拉實驗沒有發(fā)現Slug通路相關的miRNA（圖4A），表明Slug的激活可能不受miRNA海綿的調節(jié)。除了競爭的內源性RNA （ceRNAs）外，有報道表明CDR1as能夠影響蛋白質相互作用。例如CDR1as可以釋放IGF2BP3的促轉移功能。因此，作者進行了RNA-pull-down來鑒定可能與CDR1as結合的潛在蛋白質。實驗結果顯示在35kD-70kD之間有幾個單獨的條帶（圖4B）。通過生物信息學數據庫檢測到IGF2BPs與CDR1as相互作用。此外，在70 kD附近有條帶，正好與IGF2BPs的分子量相吻合。作者進行了RIP和RNA pull-down實驗，結果顯示， CDR1as探針只能檢測到IGF2BP1（圖4C-D），表明IGF2BP1可能是一個特定的潛在下游靶點。為了探討IGF2BP1是否影響過表達CDR1as細胞中的Slug表達，作者沉默了CDR1as過表達細胞中的IGF2BP1。結果表明，敲降IGF2BP1后Slug表達上調（圖4E）。此外，RIP實驗表明IGF2BP1優(yōu)先結合Slug mRNA上的m6A修飾位點（圖4F-H）。沉默IGF2BP1后也能通過CDR1as抑制腫瘤的轉移和侵襲潛能（圖4I）。綜上所述，CDR1as與IGF2BP1特異性結合以穩(wěn)定和提高Slug的表達。

圖4 CDR1as通過與IGF2BP1結合促進宮頸癌細胞的EMT

5、TGF - β信號可能通過CDR1as和m6A在宮頸癌細胞中激活EMT

N6-甲基腺苷（m6A）幾乎參與了RNA代謝的所有步驟，是轉錄修飾的重要組成部分。結合對CDR1as功能和機制的初步驗證，作者分析了CDR1as上調后不同mRNA和m6A水平的變化。KEGG和GO分析表明，CDR1as顯著激活了TGF-β信號（圖5A）。此外，Western blot檢測結果顯示，過表達的CDR1as顯著激活了p-smad2和p-smad3（圖5B-C）。當用LY2109761處理過表達CDR1as的細胞后， EMT表型與過表達載體的相同，這表明CDR1as通過激活TGF-β信號傳導促進EMT（圖5D）。細胞遷移實驗結果顯示，與過表達的CDR1as細胞相比，用LY2109761處理過表達CDR1as的細胞組穿透細胞數量明顯減少（圖5E）。這些結果提示CDR1as激活TGF-β信號和EMT促進宮頸癌細胞轉移。

圖5 TGF - β信號通過CDR1as和m6A在宮頸癌細胞中激活EMT

6、CDR1as在體內促進宮頸癌細胞的進展

作者進行了體內實驗，通過將宮頸癌細胞注射到小鼠皮下組織和足墊來評估CDR1as在宮頸癌轉移中的體內作用。注射6周后，原發(fā)腫瘤的生長情況與對照組和CDR1as組有差異。裸鼠前腹皮下注射時，與對照組相比，腫瘤體積增大（圖6A-B）， CDR1as過表達時，腫瘤體積增大，體重減輕（圖6C-D）。足墊注射小鼠腹股溝，CDR1as組淋巴結明顯腫脹（圖6E）。最后，作者做了“TGF-β信號通過CDR1as促進宮頸癌轉移”的通路圖（圖7）。

圖6 CDR1as在體內促進宮頸癌細胞的進展

圖7 “TGF-β信號通過CDR1as促進宮頸癌轉移”信號通路

參考文獻：

Zhong GL, Zhao Q, Chen ZL, Yao TT. TGF-β signaling promotes cervical cancer

metastasis via CDR1as. Molecular Cancer. 2023 March; 22(1):66. https://doi.org/10.1186/s12943-023-01743-9.