TGF-β信號(hào)通過circRNA CDR1as促進(jìn)宮頸癌轉(zhuǎn)移

實(shí)驗(yàn)方法：芯片測(cè)序，RNase R消化實(shí)驗(yàn)，RT-qPCR，Western blot，RNA 干擾，過表達(dá)，細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，傷痕愈合實(shí)驗(yàn)，熒光原位雜交、RNA pull-down，RIP以及建立宮頸癌體內(nèi)模型。

宮頸癌的發(fā)病率和死亡率由于宮頸癌轉(zhuǎn)移居高不下，轉(zhuǎn)移的總體生存率仍然很低。因此，有效的預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物對(duì)于緩解病情進(jìn)展至關(guān)重要。在這里，作者首先通過TGF-β誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)CDR1as顯著上調(diào)。接著通過CDR1as預(yù)測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后并且實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證CDR1as能促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。為尋找與CDR1as相互作用的miRNA和蛋白，通過多種數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)到IGF2BPs與CDR1as相互作用，并通過RIP和RNA pull-down實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，表明IGF2BP1可能是一個(gè)特定的潛在下游靶點(diǎn)。接著作者分析了CDR1as上調(diào)后不同mRNA和m6A水平的變化，結(jié)果表明TGF-β信號(hào)通過CDR1as和m6A在宮頸癌細(xì)胞中激活EMT。這些數(shù)據(jù)表明，TGF-β信號(hào)通過circRNA CDR1as促進(jìn)宮頸癌轉(zhuǎn)移。

技術(shù)路線：

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1、TGF - β誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞中CDR1as表達(dá)上調(diào)

EMT是腫瘤進(jìn)展過程中早期的標(biāo)志之一，其信號(hào)維持在很大程度上依賴于TGF- β的激活。用SRI-011381處理Siha細(xì)胞3天后，Siha細(xì)胞誘導(dǎo)EMT表型（圖1A）。RNA測(cè)序顯示6964個(gè)circRNA表達(dá)上調(diào)，6596個(gè)circRNA表達(dá)下調(diào)（圖1B）。作者選擇了50個(gè)變化最明顯的環(huán)狀RNA（circRNA）進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，CDR1as的變化倍數(shù)最大（圖1C）。因此，作者推測(cè)CDR1as參與TGF-β誘導(dǎo)的宮頸癌轉(zhuǎn)移。

圖1 TGF- β對(duì)宮頸癌細(xì)胞EMT的誘導(dǎo)作用

2、CDR1as與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移不良預(yù)后相關(guān)

RNase R酶切實(shí)驗(yàn)顯示，環(huán)狀CDR1as只能在cDNA樣品中擴(kuò)增，而CDR1在gDNA和cDNA中均存在線型CDR1as（圖2A）；RNase R消化后，環(huán)狀結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性明顯高于線狀結(jié)構(gòu)（圖2B）。Sanger測(cè)序結(jié)果顯示，擴(kuò)增的寡核苷酸序列與circbase數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列相似（圖2C）。這些結(jié)果表明CDR1as是一種環(huán)狀RNA。FISH和核漿萃取實(shí)驗(yàn)顯示CDR1as主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)（圖2D-E），這表明CDR1as可能在轉(zhuǎn)錄后起作用。采用原位雜交技術(shù)評(píng)估CDR1as與臨床參數(shù)的關(guān)系（圖2F，表2），結(jié)果顯示CDR1as在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中表達(dá)較高（圖2G），與總生存期較短、預(yù)后較差相關(guān)（圖2K-L），但CDR1as與腫瘤分級(jí)、分期、原發(fā)腫瘤體積無顯著關(guān)系（圖2H-J）。

圖2 CDR1as預(yù)測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和更差的總生存期

表2 CDR1as與臨床病理因素

3、CDR1as促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移

在三種癌細(xì)胞中過表達(dá)CDR1as后，qPCR結(jié)果顯示，CDR1as成功轉(zhuǎn)染到三種癌細(xì)胞中（圖3A-C）；細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，癌細(xì)胞的侵襲率和轉(zhuǎn)移率分別增加了1.86倍和2.07倍，表明宮頸癌的轉(zhuǎn)移顯著加快（圖3D-G）；細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，傷口愈合時(shí)間更短（圖3H-I），這二者結(jié)果表明癌細(xì)胞的活性增強(qiáng)。作者還通過檢測(cè)過表達(dá)CDR1as后細(xì)胞形態(tài)變化，以及RT-qPCR和Western blot檢測(cè)E-CAD、N-CAD和SLUG等的表達(dá)情況（圖3K-L）。這些結(jié)果表明CDR1as能促進(jìn)宮頸癌的轉(zhuǎn)移。

圖3 CDR1as能促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移

4、CDR1as通過與IGF2BP1結(jié)合促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的EMT

CDR1as過表達(dá)后，細(xì)胞呈紡錘形形態(tài)，而轉(zhuǎn)染載體的細(xì)胞上仍有明顯的邊緣，qPCR和Western blot結(jié)果顯示，CDR1as的升高降低了E-cadherin的表達(dá)，增加了間充質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin的表達(dá)（圖3K-L），其中Slug的上調(diào)幅度最大。根據(jù)生物信息學(xué)分析，作者將幾個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的搜索結(jié)果進(jìn)行了重疊來鑒定CDR1as和miRNA之間的潛在結(jié)合，結(jié)果顯示25個(gè)miRNA與CDR1as結(jié)合。其中，經(jīng)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，miR-203能夠調(diào)控Slug的表達(dá)。然而，CDR1as探針下拉實(shí)驗(yàn)沒有發(fā)現(xiàn)Slug通路相關(guān)的miRNA（圖4A），表明Slug的激活可能不受miRNA海綿的調(diào)節(jié)。除了競(jìng)爭(zhēng)的內(nèi)源性RNA （ceRNAs）外，有報(bào)道表明CDR1as能夠影響蛋白質(zhì)相互作用。例如CDR1as可以釋放IGF2BP3的促轉(zhuǎn)移功能。因此，作者進(jìn)行了RNA-pull-down來鑒定可能與CDR1as結(jié)合的潛在蛋白質(zhì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在35kD-70kD之間有幾個(gè)單獨(dú)的條帶（圖4B）。通過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)檢測(cè)到IGF2BPs與CDR1as相互作用。此外，在70 kD附近有條帶，正好與IGF2BPs的分子量相吻合。作者進(jìn)行了RIP和RNA pull-down實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示， CDR1as探針只能檢測(cè)到IGF2BP1（圖4C-D），表明IGF2BP1可能是一個(gè)特定的潛在下游靶點(diǎn)。為了探討IGF2BP1是否影響過表達(dá)CDR1as細(xì)胞中的Slug表達(dá)，作者沉默了CDR1as過表達(dá)細(xì)胞中的IGF2BP1。結(jié)果表明，敲降IGF2BP1后Slug表達(dá)上調(diào)（圖4E）。此外，RIP實(shí)驗(yàn)表明IGF2BP1優(yōu)先結(jié)合Slug mRNA上的m6A修飾位點(diǎn)（圖4F-H）。沉默IGF2BP1后也能通過CDR1as抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲潛能（圖4I）。綜上所述，CDR1as與IGF2BP1特異性結(jié)合以穩(wěn)定和提高Slug的表達(dá)。

圖4 CDR1as通過與IGF2BP1結(jié)合促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的EMT

5、TGF - β信號(hào)可能通過CDR1as和m6A在宮頸癌細(xì)胞中激活EMT

N6-甲基腺苷（m6A）幾乎參與了RNA代謝的所有步驟，是轉(zhuǎn)錄修飾的重要組成部分。結(jié)合對(duì)CDR1as功能和機(jī)制的初步驗(yàn)證，作者分析了CDR1as上調(diào)后不同mRNA和m6A水平的變化。KEGG和GO分析表明，CDR1as顯著激活了TGF-β信號(hào)（圖5A）。此外，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，過表達(dá)的CDR1as顯著激活了p-smad2和p-smad3（圖5B-C）。當(dāng)用LY2109761處理過表達(dá)CDR1as的細(xì)胞后， EMT表型與過表達(dá)載體的相同，這表明CDR1as通過激活TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)EMT（圖5D）。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與過表達(dá)的CDR1as細(xì)胞相比，用LY2109761處理過表達(dá)CDR1as的細(xì)胞組穿透細(xì)胞數(shù)量明顯減少（圖5E）。這些結(jié)果提示CDR1as激活TGF-β信號(hào)和EMT促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

圖5 TGF - β信號(hào)通過CDR1as和m6A在宮頸癌細(xì)胞中激活EMT

6、CDR1as在體內(nèi)促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的進(jìn)展

作者進(jìn)行了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，通過將宮頸癌細(xì)胞注射到小鼠皮下組織和足墊來評(píng)估CDR1as在宮頸癌轉(zhuǎn)移中的體內(nèi)作用。注射6周后，原發(fā)腫瘤的生長(zhǎng)情況與對(duì)照組和CDR1as組有差異。裸鼠前腹皮下注射時(shí)，與對(duì)照組相比，腫瘤體積增大（圖6A-B）， CDR1as過表達(dá)時(shí)，腫瘤體積增大，體重減輕（圖6C-D）。足墊注射小鼠腹股溝，CDR1as組淋巴結(jié)明顯腫脹（圖6E）。最后，作者做了“TGF-β信號(hào)通過CDR1as促進(jìn)宮頸癌轉(zhuǎn)移”的通路圖（圖7）。

圖6 CDR1as在體內(nèi)促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的進(jìn)展

圖7 “TGF-β信號(hào)通過CDR1as促進(jìn)宮頸癌轉(zhuǎn)移”信號(hào)通路

參考文獻(xiàn)：

Zhong GL, Zhao Q, Chen ZL, Yao TT. TGF-β signaling promotes cervical cancer

metastasis via CDR1as. Molecular Cancer. 2023 March; 22(1):66. https://doi.org/10.1186/s12943-023-01743-9.