除了滋養(yǎng)肌膚，膠原蛋白還能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的干細(xì)胞性

實(shí)驗(yàn)方法：HLF、Hep3B、SK-Hep1和HEK293 T細(xì)胞培養(yǎng)，Sphere Assay，克隆形成實(shí)驗(yàn)，流式細(xì)胞術(shù)分析，藥物抵抗和IC50，質(zhì)粒和慢病毒敲低小RNA，考馬斯亮藍(lán)染色，質(zhì)譜，反轉(zhuǎn)錄PCR，RT-qPCR，免疫印跡，免疫共沉淀（co-IP），谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（GST）pull-down，免疫熒光，共聚焦顯微鏡成像，熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，異種移植腫瘤形成，體內(nèi)藥物治療，RNA-Seq

腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells，CSCs）是一小群具有干性和多向分化潛能的腫瘤細(xì)胞，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展和治療抵抗。然而，CSCs在肝細(xì)胞癌（HCC）中的具體作用機(jī)制尚不清楚。作者發(fā)現(xiàn)在晚期HCC組織中，膠原蛋白表達(dá)上調(diào)，與其受體DDR1的表達(dá)一致。因此，高膠原水平伴隨DDR1高表達(dá)與HCC患者的不良預(yù)后相關(guān)。膠原誘導(dǎo)的DDR1活化增強(qiáng)了肝癌細(xì)胞在體外和體內(nèi)的干性。機(jī)制上，DDR1與CD44相互作用，CD44作為共受體放大膠原誘導(dǎo)的DDR1信號(hào)，膠原- DDR1信號(hào)通過(guò)促進(jìn)PP2AA募集到MST1來(lái)拮抗Hippo信號(hào)，導(dǎo)致YAP活化過(guò)度。DDR1和YAP聯(lián)合抑制可協(xié)同抑制肝癌細(xì)胞的體外干性和體內(nèi)成瘤性?；赥2加權(quán)圖像的放射組學(xué)模型可以無(wú)創(chuàng)預(yù)測(cè)膠原表達(dá)。這些發(fā)現(xiàn)揭示了膠原- DDR1信號(hào)抑制Hippo信號(hào)的分子基礎(chǔ)，并突出了CD44 / DDR1 / YAP軸在促進(jìn)癌細(xì)胞干性中的作用，提示DDR1和YAP可能作為HCC新的預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1、高膠原蛋白I和DDR1水平預(yù)示HCC患者預(yù)后不良

為分析HCC腫瘤內(nèi)膠原的類(lèi)型，作者對(duì)HCC組織進(jìn)行Picro-Sirius red染色。結(jié)果顯示，Ⅰ型膠原占膠原的比例最高（圖1A）。為探索Ⅰ型膠原在HCC中的臨床意義，作者檢測(cè)了123例具有相應(yīng)臨床病理特征的HCC組織芯片中Ⅰ型膠原的表達(dá)。與高分化HCC組織相比，Ⅰ型膠原在中分化HCC組織中高表達(dá)，在低分化組織中表達(dá)最高（圖1B）。Kaplan-Meier分析顯示，腫瘤中Ⅰ型膠原蛋白高表達(dá)的患者比Ⅰ型膠原蛋白低表達(dá)的患者具有更低的總生存率和更高的復(fù)發(fā)率（圖1C）。Tumor sphere-forming assays顯示膠原I促進(jìn)HCC細(xì)胞干性的能力（圖1D）。

為檢測(cè)DDR1在HCC中的臨床意義，作者分析了相同組織芯片和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中DDR1的水平。結(jié)果表明DDR1與Ⅰ型膠原呈正相關(guān)（圖1E-F）。根據(jù)Ⅰ型膠原和DDR1表達(dá)情況，將患者分為三組Col1⁺DDR1⁺（n?=?54）、Ⅰ型膠原/DDR1雙高表達(dá)；Col1⁺DDR1^-或Col1^-DDR1⁺（n?=?33），Ⅰ型膠原或DDR1單高表達(dá)；Col1^-DDR1^-（n?=?36），Ⅰ型膠原/DDR1雙低表達(dá)。與其他組相比，Col1⁺DDR1⁺組的總生存時(shí)間和無(wú)病生存時(shí)間最短（圖1G）?？傊?，臨床樣本中Ⅰ型膠原和DDR1之間的關(guān)系表明，在HCC患者中，Ⅰ型膠原和DDR1的協(xié)同作用導(dǎo)致了較差的臨床結(jié)果，可能在HCC的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。

圖1 I型膠原和DDR1在臨床肝癌患者中的臨床意義

2、膠原I-DDR1信號(hào)增強(qiáng)腫瘤干細(xì)胞特征

為驗(yàn)證體外DDR1對(duì)肝癌細(xì)胞干性的影響，作者進(jìn)行sphere-forming assays。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與相應(yīng)培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞（non-CSCs）相比，DDR1蛋白水平在HCC球（CSCs）中顯著上調(diào)（圖2A）。DDR1作為維持干細(xì)胞自我更新潛能的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子和膜蛋白，過(guò)表達(dá)DDR1促進(jìn)SOX2、NANOG和EPCAM的mRNA表達(dá)。I型膠原刺激進(jìn)一步放大了這種效應(yīng)。然而，過(guò)表達(dá)DDR1激酶死亡突變體（DDR1-K618A）和膠原結(jié)合缺陷突變體（DDR1-R105A）并沒(méi)有達(dá)到這種效果。TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中DDR1表達(dá)與CD133呈正相關(guān)，組織芯片的IHC驗(yàn)證了這一點(diǎn)（圖2B-C）。此外，DDR1過(guò)表達(dá)或I型膠原刺激誘導(dǎo)球形成效率、CD133陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、單細(xì)胞克隆形成和對(duì)sorafenib或doxorubicin的耐藥性顯著增加。相反，過(guò)表達(dá)DDR1-K618A和DDR1-R105A突變體未能表現(xiàn)出相同的結(jié)果。相比之下，DDR1缺失顯著降低了這些CSC相關(guān)的生物學(xué)效應(yīng)（圖2D-G）。

在體內(nèi)，作者使用異種移植模型來(lái)檢測(cè)DDR1在肝癌細(xì)胞中的作用。DDR1敲低成球細(xì)胞形成的皮下瘤明顯小于scramble細(xì)胞形成的皮下瘤（圖3A）。IHC結(jié)果顯示DDR1、Ki67和CD133的蛋白水平在亂序腫瘤中高于DDR1敲低腫瘤（圖3B）。為進(jìn)一步研究DDR1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，作者通過(guò)皮下注射N(xiāo)OD/SCID小鼠細(xì)胞，在NOD/SCID小鼠細(xì)胞中加入或不加入上調(diào)的DDR1細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋實(shí)驗(yàn)。DDR1過(guò)表達(dá)顯著增強(qiáng)腫瘤形成能力，增加干細(xì)胞頻率（圖3C-E）。上述研究表明DDR1在體外和體內(nèi)促進(jìn)肝癌細(xì)胞干性和腫瘤發(fā)生，依賴(lài)于其激酶活性和膠原刺激。

圖2 DDR1在體外增強(qiáng)HCC細(xì)胞系的干性

圖3 DDR1在體內(nèi)增強(qiáng)HCC細(xì)胞系的干性

3、膠原誘導(dǎo)的DDR1激活是由CD44協(xié)同促進(jìn)的

為研究DDR1在肝細(xì)胞癌中的分子機(jī)制，作者使用IP/MS方法研究了其相互作用的伙伴。用FLAG-DDR1或FLAG-vector轉(zhuǎn)染SK-Hep1細(xì)胞，用抗FLAG抗體免疫沉淀。作者發(fā)現(xiàn)CD44（CSCs標(biāo)記物）是DDR1潛在的相互作用蛋白之一（圖4A）。免疫共沉淀（Co-IP）和谷胱甘肽S -轉(zhuǎn)移酶（GST） pull-down實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DDR1與CD44存在相互作用和結(jié)合（圖4B-C）。此外，免疫熒光和激光共聚焦檢測(cè)外源性DDR1和CD44在293T細(xì)胞中的空間共定位。在HLF細(xì)胞中觀察到類(lèi)似的內(nèi)源性DDR1和CD44表達(dá)（圖4D）。隨后，作者進(jìn)行了有/無(wú)I型膠原蛋白激活的co-IP實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)膠原蛋白I增加DDR1與CD44的相互作用（圖4E）。由于CD44可以作為輔助受體介導(dǎo)受體內(nèi)化、激活、降解或調(diào)節(jié)受體激酶活性，作者推測(cè)CD44是否可以調(diào)節(jié)I型膠原誘導(dǎo)的DDR1活化。Co-IP實(shí)驗(yàn)表明，CD44敲低降低了DDR1的酪氨酸磷酸化（圖4F）。過(guò)表達(dá)CD44以時(shí)間依賴(lài)的方式促進(jìn)Ⅰ型膠原誘導(dǎo)的DDR1的磷酸化。在HLF細(xì)胞中敲低DDR1則減弱這種作用（圖4G）。結(jié)果提示CD44促進(jìn)Ⅰ型膠原誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞DDR1的活化。CD44在肝癌中的功能是否依賴(lài)于DDR1，作者在CD44過(guò)表達(dá)的HLF細(xì)胞中敲低DDR1，在CD44敲低的Hep3B細(xì)胞中過(guò)表達(dá)DDR1。DDR1敲除部分降低了肝癌細(xì)胞的成球率、單細(xì)胞克隆形成率、CD133陽(yáng)性的干細(xì)胞樣細(xì)胞比例以及CD44過(guò)表達(dá)導(dǎo)致的化療耐藥。DDR1的過(guò)表達(dá)部分增強(qiáng)了I型膠原內(nèi)CD44缺失所降低的CSCs特性（圖5A-D）。CD44過(guò)表達(dá)細(xì)胞形成的皮下腫瘤的體積和重量明顯大于空載體或CD44/shDDR1細(xì)胞形成的皮下腫瘤（圖5E）。以上證據(jù)表明DDR1是CD44介導(dǎo)的肝癌細(xì)胞干性信號(hào)所必需的關(guān)鍵蛋白。

圖4 CD44與DDR1相互作用，促進(jìn)DDR1磷酸化

圖5 體內(nèi)外CD44與DDR1的交互作用增強(qiáng)了HCC細(xì)胞系的干細(xì)胞性

4、DDR1通過(guò)促進(jìn)PP2AA募集到MST1/2而使Hippo信號(hào)失活

為確定DDR1影響HCC細(xì)胞干性的途徑，作者對(duì)DDR1敲低的HCC細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行了RNA測(cè)序。KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)DDR1缺失顯著改變了Hippo信號(hào)通路（圖6A）。基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)，DDR1與YAP、CTGF、BCL2、AXL呈正相關(guān)。Hippo信號(hào)與腫瘤干性密切相關(guān)，作者檢測(cè)了DDR1對(duì)YAP/TAZ（Hippo通路核心蛋白）下游基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，在Hep3B細(xì)胞中過(guò)表達(dá)DDR1后，CTGF、CYR61、BCL2和AXL的mRNA水平上調(diào)。膠原蛋白I的存在進(jìn)一步增強(qiáng)了這些作用。相反，DDR1敲低顯著降低CTGF、CYR61、BCL2和AXL的表達(dá)（圖6B）。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)提示DDR1增強(qiáng)了Ⅰ型膠原中YAP/TEAD反應(yīng)元件的活性（圖6C）。核質(zhì)分離和免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明，DDR1過(guò)表達(dá)促進(jìn)YAP易位進(jìn)入細(xì)胞核（圖6D-E）。Western blotting顯示，I型膠原刺激的DDR1磷酸化降低了MST1磷酸化，增強(qiáng)了YAP的激活，而DDR1敲除則表現(xiàn)出相反的效果（圖6F）。這些結(jié)果表明膠原I-DDR1信號(hào)通路可誘導(dǎo)YAP活化。

protein phosphatase 2 scaffold subunit A alpha（PP2AA; PPP2R1A）作為經(jīng)典的上游磷酸酶，可以使MST1/2去磷酸化，從而使Hippo信號(hào)通路失活。作者分析了與DDR1相互作用的蛋白。PP2AA是DDR1潛在的相互作用蛋白（圖4A）。募集實(shí)驗(yàn)表明DDR1以膠原依賴(lài)的方式促進(jìn)PP2AA向MST1的募集（圖6G）。PP2AA缺失減弱了膠原IDDR1信號(hào)誘導(dǎo)的MST1和LAST1去磷酸化，導(dǎo)致YAP激活（圖6H）。這些結(jié)果表明，PP2AA是膠原I-DDR1信號(hào)誘導(dǎo)YAP活化所必需的。

在臨床樣本中，作者評(píng)估了39例HCC患者組織樣本中p-DDR1、CD44和YAP蛋白水平。結(jié)果顯示，肝癌組織中p-DDR1、CD44和YAP水平呈正相關(guān)（圖6I）。基于I型膠原的IHC染色，將樣本分為I型膠原陽(yáng)性（Ⅰ型膠原⁺）和I型膠原陰性（Ⅰ型膠原^-）表達(dá)組。作者隨后進(jìn)行了多色免疫熒光（IF）來(lái)分析這三種蛋白的共定位（圖6J）。如上所述，在I型膠原沉積過(guò)程中，p-DDR1和CD44水平與YAP的表達(dá)密切相關(guān)。

圖6 DDR1通過(guò)滅活YAP阻礙Hippo信號(hào)傳導(dǎo)

5、聯(lián)合抑制DDR1和YAP在肝癌細(xì)胞干性中具有協(xié)同作用

為驗(yàn)證DDR1是否通過(guò)YAP發(fā)揮作用，作者使用DDR1抑制劑（7rh）和YAP抑制劑（verteporfin; VP）進(jìn)行體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。7rh是一種ATP競(jìng)爭(zhēng)性口服DDR1特異性小分子抑制劑。Verteporfin（VP）是YAP/TAZ的抑制劑，在FDA批準(zhǔn)的小分子化合物庫(kù)中被鑒定，并被報(bào)道在空間上阻礙YAP和TEAD之間的相互作用。單獨(dú)使用7rh或VP處理分別減少了成球效率、克隆形成和CD133?^+?細(xì)胞比例的細(xì)胞數(shù)量，并減少了移植瘤的體積和重量。與單藥相比，7rh和VP聯(lián)合處理進(jìn)一步減弱了這些效應(yīng)（圖7A-D）。IHC結(jié)果顯示，與7rh或VP處理的腫瘤相比，Ki67和CD133在scrambled腫瘤中染色更強(qiáng)烈。聯(lián)合組腫瘤中Ki67和CD133表達(dá)最低（圖7E），聯(lián)合治療顯示出良好的抗腫瘤治療效果。

圖7 DDR1和YAP信號(hào)共同抑制體外和體內(nèi)腫瘤增殖

6、臨床放射組學(xué)預(yù)測(cè)模型

在組織芯片的患者中，作者獲得了92張T2WI圖像，共有65例患者最終納入本次回顧性研究。預(yù)測(cè)模型依賴(lài)于Ⅰ型膠原IHC評(píng)分。將患者分為高、低兩組。采用受試者工作特征（ROC）曲線分析評(píng)估模型性能。結(jié)果顯示，基于14個(gè)特征的模型在驗(yàn)證數(shù)據(jù)集上獲得了最高的AUC（圖8A）。此時(shí)，對(duì)于測(cè)試數(shù)據(jù)集，模型的AUC和預(yù)測(cè)精度分別為0.717和0.700。臨床診斷統(tǒng)計(jì)及所選特征見(jiàn)圖8B。

圖8 預(yù)測(cè)膠原I表達(dá)的放射組學(xué)模型

結(jié)論

總之，本研究結(jié)果表明，CD44介導(dǎo)的膠原I-DDR1信號(hào)作為腫瘤激勵(lì)因子，通過(guò)募集PP2AA激活YAP來(lái)促進(jìn)HCC細(xì)胞的干細(xì)胞性。在HCC組織中，膠原I和DDR1表達(dá)的增加預(yù)示著預(yù)后不良，因此可以作為HCC有希望的生物標(biāo)志物和新的治療策略。

參考文獻(xiàn)

Xiong YX, Zhang XC, Zhu JH, Zhang YX, Pan YL, Wu Y, Zhao JP, Liu JJ, Lu YX, Liang HF, Zhang ZG, Zhang WG.（2023）. Collagen I-DDR1 signaling promotes hepatocellular carcinoma cell stemness via Hippo signaling repression. Cell Death Differ. doi: 10.1038/s41418-023-01166-5.