抑制HDAC3通過增強(qiáng)CXCL10介導(dǎo)的趨化性和免疫細(xì)胞募集促進(jìn)抗腫瘤免疫

實驗方法：細(xì)胞增殖和活力分析，組織分離，免疫熒光染色，ELISA，ELISpot (酶聯(lián)免疫斑點測定法)，腫瘤浸潤性CD4⁺和CD8⁺ T細(xì)胞的大量RNA測序及分析，腫瘤RNA測序及分析，qRT-PCR，ChIP-seq和ChIP-qPCR檢測，流式細(xì)胞術(shù)，Western blot，TMA的IHC測量與分析

組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDAC)抑制劑是一類新的抗癌藥物，一般認(rèn)為其抗腫瘤活性是通過直接引起腫瘤細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡來發(fā)揮的。然而，我們證明了I類HDAC抑制劑，如Entinostat和Panobinostat，可以有效抑制免疫正常而非免疫缺陷小鼠的腫瘤生長。對Hdac1, 2, 3敲除腫瘤細(xì)胞的進(jìn)一步研究表明，HDAC3的腫瘤特異性失活通過激活抗腫瘤免疫來抑制腫瘤生長。具體來說，我們發(fā)現(xiàn)HDAC3可以直接結(jié)合到啟動子區(qū)域，抑制CXCL9, 10, 11化學(xué)因子的表達(dá)。Hdac3缺陷的腫瘤細(xì)胞高水平表達(dá)這些趨化因子，通過將CXCR3⁺ T細(xì)胞募集到腫瘤微環(huán)境(TME)中，抑制免疫能力小鼠的腫瘤生長。此外，HDAC3與CXCL10在肝細(xì)胞癌腫瘤組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，也提示HDAC3可能參與抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)和患者生存。因此，抑制HDAC3通過增強(qiáng)免疫細(xì)胞向TME的浸潤來抑制腫瘤生長。這一抗腫瘤機(jī)制可能有助于指導(dǎo)基于HDAC3抑制劑的治療。

技術(shù)路線：

結(jié)果：

(1) HDAC抑制劑以免疫依賴的方式抑制腫瘤生長

HDAC抑制劑已被廣泛用于癌癥治療。其中，Panobinostat(也稱為LBH589，一種泛HDAC抑制劑)和Entinostat(也稱為MS275, HDAC1和3選擇性抑制劑)正在進(jìn)行III期臨床試驗。我們首先檢測了恩替諾他和帕比諾他對MC38小鼠結(jié)腸腺癌和MCA205纖維肉瘤腫瘤生長的影響。我們發(fā)現(xiàn)Entinostat和Panobinostat在免疫正常的C57BL/6小鼠中有效抑制MC38和MCA205腫瘤的生長(圖1A-D)，但在免疫缺陷的裸小鼠中無效(圖1E-H)。這些結(jié)果表明，I類HDAC抑制劑Entinostat和Panobinostat以免疫依賴的方式抑制MCA205和MC38腫瘤的生長。

圖1：HDAC抑制劑以免疫依賴的方式抑制腫瘤生長

(2) Hdac3缺乏抑制腫瘤生長，而腫瘤生長依賴于宿主免疫反應(yīng)

Panobinostat和Entinostat均抑制MCA205和MC38腫瘤的生長，提示抑制一種或多種I類HDAC可能抑制腫瘤生長。為了探索Hdac1, 2, 3基因在腫瘤生長中的作用，我們利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除MC38細(xì)胞中的Hdac1, 2, 3基因(補(bǔ)充圖S1A-S1C)，并將細(xì)胞注射到C57BL/6小鼠體內(nèi)。比較Hdac1^?/?，Hdac2^?/?和Hdac3^?/?我們發(fā)現(xiàn)Hdac3缺失顯著抑制MC38腫瘤的生長，而Hdac1和Hdac2缺失對MC38腫瘤的生長無明顯影響(圖2A)。為了證實Hdac3基因在腫瘤生長中的作用，我們進(jìn)一步敲除(Hdac3^+/?)和敲除(Hdac3^?/?) MC38和MCA205細(xì)胞中的Hdac3基因。比較Hdac3^+/?和Hdac3^?/?我們發(fā)現(xiàn)，在C57BL/6小鼠和裸鼠中，敲低和敲除MC38和MCA205腫瘤及其相應(yīng)的WT腫瘤均顯著抑制了C57BL/6小鼠中MC38和MCA205腫瘤的生長(圖2B和C)，而在裸鼠中則沒有抑制作用(圖2D和E)。這些結(jié)果表明，HDAC3促進(jìn)腫瘤生長并依賴于宿主免疫應(yīng)答。

將MCA205細(xì)胞靜脈注射到小鼠體內(nèi)后，腫瘤會發(fā)展并轉(zhuǎn)移到多個器官，導(dǎo)致小鼠死亡。然后我們比較靜脈注射WT或Hdac3^?/?的C57BL/6小鼠的存活率。MCA205細(xì)胞。移植WT MCA205細(xì)胞的小鼠在移植后不能存活超過17天，而所有移植Hdac3^?/? MCA205細(xì)胞存活(圖2F)，表明Hdac3缺失減少了轉(zhuǎn)移并保護(hù)小鼠免于轉(zhuǎn)移相關(guān)死亡。我們還分析了GEO和TCGA數(shù)據(jù)庫中876例胃癌患者Hdac1, 2, 3基因表達(dá)與OS的相關(guān)性。Hdac3基因的高表達(dá)與胃患者較低的OS相關(guān)，而Hdac1和Hdac2基因的高表達(dá)與胃患者較高的OS相關(guān)(圖2G-I)。此外，HDAC3 mRNA在各種癌癥組織中的表達(dá)均高于相應(yīng)的正常組織，包括膽管癌、宮頸鱗狀細(xì)胞癌和宮頸內(nèi)膜腺癌、肺腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌(補(bǔ)充圖S2)。這些結(jié)果提示特異性抑制Hdac3可能通過抗腫瘤免疫抑制腫瘤生長。

圖2：Hdac3缺乏抑制腫瘤生長并依賴于宿主免疫反應(yīng)

(3) Hdac3缺陷腫瘤的局部免疫反應(yīng)增強(qiáng)

CCK-8 (補(bǔ)充圖S3A和S3B)、Ki-67染色(補(bǔ)充圖S3C和S3D)和單克隆形成(補(bǔ)充圖S3E和S3F)檢測顯示，Hdac3缺乏對MC38和MCA205細(xì)胞的活力和增殖沒有影響。為了探索HDAC3是否在調(diào)節(jié)局部TME中發(fā)揮作用，我們使用流式細(xì)胞術(shù)檢測分析了WT和Hdac3^+/? MCA205腫瘤中的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TIL)，因為Hdac3^?/?細(xì)胞沒有形成足夠大的腫瘤進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。事實上，我們觀察到腫瘤浸潤的CD4⁺、CD8⁺、CD11c⁺、CD11b⁺F4/80⁺、CD4⁺ IFNγ⁺和CD8⁺ IFNγ⁺免疫細(xì)胞的數(shù)量增加。MCA205腫瘤(圖3A；補(bǔ)充圖S4)。結(jié)果表明，當(dāng)腫瘤細(xì)胞特異性缺乏Hdac3時，更多抗原呈遞DCs和腫瘤殺傷T細(xì)胞被招募到MCA205 TME中。為了更好地計數(shù)腫瘤浸潤T細(xì)胞的大小和分布，對WT、Hdac3^+/?和Hdac3^?/? MCA205腫瘤進(jìn)行免疫熒光染色。更多的CD4⁺、CD8⁺和IFNγ⁺細(xì)胞浸潤Hdac3^+/?和Hdac3^?/? MCA205腫瘤與WT型MCA205腫瘤的比較(圖3B, C；補(bǔ)充圖S5A和S5B)。還采用ELISpot法評估WT和Hdac3^+/? MCA205穩(wěn)定表達(dá)的雞卵細(xì)胞中的OVA特異性IFNγ分泌T細(xì)胞的頻率。結(jié)果顯示，Hdac3^+/? MCA205腫瘤中IFNγ分泌T細(xì)胞比WT腫瘤中更多(圖3D和E)。這些結(jié)果表明，Hdac3缺陷腫瘤中浸潤T細(xì)胞的數(shù)量和特征明顯不同于WT腫瘤。

為了表征TME中浸潤性T細(xì)胞的特征，我們通過FACS從WT和Hdac3^+/? MCA205腫瘤中分離CD45⁺CD4⁺ and CD45⁺CD8⁺ T細(xì)胞，并進(jìn)行大量RNA測序檢測基因表達(dá)。與WT細(xì)胞相比，從Hdac3^+/?腫瘤分離的T細(xì)胞表達(dá)更高水平的轉(zhuǎn)錄因子，如Eomes和Tcf712；細(xì)胞表面受體如Sell、Vsir和Cd28；效應(yīng)分子如Gzmb、Ifng、Prf1、Tnf；和耐受性相關(guān)基因如Nr4a2和Egr2 (圖3F)。以上結(jié)果表明，腫瘤細(xì)胞特異性Hdac3缺失引發(fā)了免疫細(xì)胞的差異浸潤，在TME中比在WT腫瘤中更強(qiáng)的局部免疫反應(yīng)。

圖3：Hdac3缺陷腫瘤的局部免疫反應(yīng)增強(qiáng)

(4) Hdac3缺乏上調(diào)趨化因子信號通路和T細(xì)胞受體信號通路

大量RNA-seq結(jié)果(圖3F)顯示，HDAC3可能通過調(diào)節(jié)TME中免疫細(xì)胞(尤其是T細(xì)胞)的浸潤和特征來影響腫瘤生長。為了探索HDAC3調(diào)節(jié)T細(xì)胞浸潤和TME的機(jī)制，我們對WT和Hdac3^+/? MCA205腫瘤組織進(jìn)行RNA測序。KEGG注釋分類分析比較Hdac3^+/?和WT腫瘤顯示，Hdac3缺失顯著上調(diào)趨化因子信號通路、T細(xì)胞受體(TCR)信號通路和細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用過程中的基因(圖4A和B)。GSEA還顯示，趨化因子信號通路(圖4C)、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用(圖4D)和TCR信號通路(圖4E)在Hdac3缺失的MCA205腫瘤中顯著富集。這些結(jié)果表明，與T細(xì)胞募集相關(guān)的TCR信號通路和趨化因子信號通路可能有助于抑制Hdac3缺陷MCA205細(xì)胞的腫瘤生長。然后，我們選擇了與T細(xì)胞和T細(xì)胞募集相關(guān)的基因，并評估了它們在WT和Hdac3^+/? MCA205腫瘤中的相對表達(dá)。豐富的T細(xì)胞標(biāo)記物(Cd3d、Cd3e、Cd3g、Cd4、Cd8a、Ctla4、Zap70和Cxcr3)和T細(xì)胞募集相關(guān)基因(Cxcl9, 10, 11)在Hdac3缺陷腫瘤中顯著上調(diào)(圖4F)。為了驗證RNA測序的結(jié)果，通過qRT-PCR將Hdac3^?/? MCA205腫瘤與WT腫瘤中的基因表達(dá)進(jìn)行比較。我們證實，Hdac3缺陷導(dǎo)致T細(xì)胞標(biāo)記和T細(xì)胞招募相關(guān)基因上調(diào)(補(bǔ)充圖S5C)。這些結(jié)果使我們假設(shè)HDAC3可能通過降低趨化因子如Cxcl9, 10, 11的表達(dá)來抑制T細(xì)胞募集到TME。

圖4：Hdac3缺乏上調(diào)趨化因子信號通路和TCR信號通路

(5) HDAC3下調(diào)IFN誘導(dǎo)的趨化因子Cxcl9, 10, 11的表達(dá)

趨化因子Cxcl9, 10, 11是IFN誘導(dǎo)基因，IFN信號通路在抗腫瘤免疫應(yīng)答中起重要作用。因此，我們定量分析了在IFNα-，IFNβ-和IFNγ處理的WT和Hdac3^?/? MCA205細(xì)胞中Cxcl9, 10, 11的mRNA的表達(dá)。qRT-PCR結(jié)果顯示，與WT型細(xì)胞相比，IFN處理的Hdac3^?/?細(xì)胞中Cxcl9, 10, 11 mRNA表達(dá)水平明顯升高(圖5A)。接下來，我們通過ELISA檢測在IFNα-，IFNβ-和IFNγ處理的WT和Hdac3^?/? MCA205細(xì)胞培養(yǎng)上清中CXCL9, 10, 11的濃度。與mRNA表達(dá)相似，與WT細(xì)胞相比，在Hdac3^?/? MCA205細(xì)胞培養(yǎng)的上清中CXCL9, 10, 11蛋白濃度也更高(圖5B)。為了證實Cxcl9, 10, 11在體內(nèi)Hdac3^+/? MCA205腫瘤中表達(dá)上調(diào)，我們用ELISA法檢測了腫瘤組織中CXCL9, 10, 11的濃度，并發(fā)現(xiàn)CXCL9, 10, 11在Hdac3^+/? MCA205腫瘤的表達(dá)也高于WT MCA205腫瘤(圖5C)。這些結(jié)果表明，Hdac3缺失上調(diào)了腫瘤細(xì)胞中Cxcl9, 10, 11的表達(dá)。

為了進(jìn)一步證實HDAC3去乙?；富钚詫xcl9, 10, 11表達(dá)的作用，我們在IFN處理的MCA205細(xì)胞中加入I類HDAC抑制劑Entinostat和HDAC3特異性抑制劑RGF966，通過qRT-PCR檢測Cxcl9, 10, 11 mRNA的表達(dá)。HDAC抑制劑Entinostat和RGF966也誘導(dǎo)Cxcl9, 10, 11 mRNA表達(dá)上調(diào)(圖5D)。相應(yīng)地，我們也檢測到Cxcl9, 10, 11受體基因Cxcr3在Hdac3^+/? MCA205腫瘤中表達(dá)上調(diào)(圖5E)。這些結(jié)果表明，HDAC3調(diào)節(jié)Cxcl9, 10, 11 mRNA的表達(dá)，并依賴于其去乙?；傅幕钚?。

圖5：HDAC3下調(diào)IFN誘導(dǎo)的趨化因子Cxcl9, 10, 11的表達(dá)

(6) HDAC3直接結(jié)合并使Cxcl10基因啟動子去乙?；?/strong>

我們試圖探索HDAC3調(diào)控Cxcl9, 10, 11表達(dá)的機(jī)制。首先，我們比較了IFNα-、IFNβ-和IFNγ處理與未處理的MCA205細(xì)胞中Cxcl9, 10, 11 mRNA的相對表達(dá)。在MCA205細(xì)胞中，Cxcl10的表達(dá)高于Cxcl9和Cxcl11 (補(bǔ)充圖S6A和S6B)，表明Cxcl10是MCA205腫瘤中負(fù)責(zé)CXCR3⁺ T細(xì)胞募集的主要趨化因子。HDAC3是一種表觀遺傳調(diào)節(jié)劑，可以介導(dǎo)組蛋白的去乙?；揎?。接下來，我們通過ChIP-seq和ChIP-qPCR檢測了HDAC3和H3K27乙酰化(H3K27ac)在Cxcl10啟動子上的富集。在未處理和IFNβ刺激的WT MCA205細(xì)胞中，HDAC3在Cxcl10啟動子區(qū)域富集，H3K27ac水平較低。然而HDAC3^+/?和HDAC3^?/? MCA205細(xì)胞中Cxcl10啟動子上的HDAC3富集減少，IFNβ刺激后H3K27ac水平升高(圖6A-D)。這些結(jié)果表明HDAC3可以結(jié)合并抑制Cxcl10啟動子的H3K27ac。為了進(jìn)一步確定HDAC3去乙酰化酶活性對Cxcl10轉(zhuǎn)錄的影響，我們用野生型HDAC3和去乙酰化失活突變體HDAC3^?/? MCA205細(xì)胞(H134/135Q;補(bǔ)充圖S7A和S7B)。CCK-8 (補(bǔ)充圖S7C)、Ki67染色(補(bǔ)充圖S7D)和單克隆形成實驗(補(bǔ)充圖S7E和S7F)顯示，Hdac3過表達(dá)對MCA205細(xì)胞的活力和增殖沒有影響。此外，ChIP-qPCR和ChIP-seq結(jié)果顯示，WT HDAC3而不是HDAC3 H134/135Q突變體可以結(jié)合并抑制Cxcl10啟動子的乙酰化(圖6E-H)。進(jìn)一步分析野生型和突變型HDAC3重組的HDAC3^?/? MCA205細(xì)胞中Cxcl10 mRNA的表達(dá)，野生型HDAC3抑制Cxcl10 mRNA的表達(dá)，而H134/135Q-突變型HDAC3對Cxcl10 mRNA的表達(dá)無影響(圖6I)。此外，我們隨后將HDAC3^?/? MCA205細(xì)胞接種到C57BL/6和裸鼠中，這些細(xì)胞由載體、野生型或H134/135Q突變型HDAC3重組。腫瘤生長監(jiān)測顯示，在H134/135Q突變體中，而不是在H134/135Q突變體中，HDAC3挽救了腫瘤的生長(圖6J和K)。這些結(jié)果表明，HDAC3通過結(jié)合Cxcl10啟動子和去乙?；浇慕M蛋白來抑制Cxcl10基因的表達(dá)。

圖6：HDAC3直接結(jié)合并脫乙?；?em>Cxcl10基因啟動子

(7) CXCR3抗體阻斷以免疫依賴的方式拯救Hdac3缺陷的MCA205腫瘤生長

為了進(jìn)一步驗證Hdac3缺乏促進(jìn)CXCR3⁺ T細(xì)胞募集來介導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答的假設(shè)，我們使用CXCR3抗體在WT和HDAC3^+/? MCA205腫瘤中阻斷CXCL9, 10, 11/CXCR3趨化因子信號通路。雖然TNFα抗體和IgG對HDAC3^+/? MCA205腫瘤的緩慢生長無影響，但CXCR3抗體使HDAC3^+/? MCA205腫瘤的生長恢復(fù)到與WT MCA205腫瘤相似的速度(圖7A)。通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步分析WT，IgG治療或CXCR3抗體治療的HDAC3^+/? MCA205腫瘤的TILs，結(jié)果顯示，給予CXCR3抗體后，HDAC3^+/? MCA205腫瘤中CD4⁺、CD8⁺、CXCR3⁺、CD4⁺CXCR3⁺和CD8⁺CXCR3⁺浸潤免疫細(xì)胞減少(圖7B)。免疫熒光染色結(jié)果顯示，與IgG組相比，CXCR3抗體組HDAC3^+/? MCA205腫瘤中CD4⁺、CD8⁺和IFNγ⁺細(xì)胞數(shù)量減少(圖7C和D)。在Cxcr3抗體處理的HDAC3^+/? MCA205腫瘤中，Cxcr3 mRNA也降低，這可能是由于表達(dá)Cxcr3的T細(xì)胞浸潤減少(圖7E)。這些結(jié)果表明，Hdac3缺陷腫瘤的生長降低可能是由于CXCR3⁺ T細(xì)胞浸潤到TME介導(dǎo)的抗腫瘤活性增強(qiáng)。總之，我們的研究表明，在TME中，HDAC3通過調(diào)節(jié)Cxcl9, 10, 11基因的表達(dá)和Cxcl9, 10, 11-CXCR3軸介導(dǎo)的T細(xì)胞募集參與抗腫瘤免疫，為HDAC3的抑制提供了重要的抗腫瘤機(jī)制(圖7F)。

我們還將MTX處理的WT、HDAC3^+/?或HDAC3^?/? MCA205細(xì)胞接種到左側(cè)攜帶WT MCA205腫瘤的小鼠右側(cè)，持續(xù)7天。我們發(fā)現(xiàn)，一側(cè)MTX處理的HDAC3^+/?和HDAC3^?/? MCA205細(xì)胞連接抑制了另一側(cè)WT MCA205腫瘤的腫瘤生長(補(bǔ)充圖S8A和S8B)，這表明HDAC3缺陷的MCA205細(xì)胞在體內(nèi)具有遠(yuǎn)端抗腫瘤活性。為了確定CXCL10/CXCR3軸在HDAC3缺陷的MCA205細(xì)胞抗腫瘤活性中的作用，我們將WT, HDAC3^+/?或HDAC3^?/? MCA205纖維肉瘤細(xì)胞接種到左側(cè)WT MCA205腫瘤小鼠的右側(cè)，連續(xù)7天，然后靜脈注射CXCR3抗體或IgG對照。CXCR3抗體恢復(fù)了MCA205的腫瘤生長(補(bǔ)充圖S8C)，提示Hdac3缺陷細(xì)胞的體內(nèi)抗腫瘤活性依賴于CXCL10和CXCR3通路。

圖7：CXCR3抗體阻斷以免疫依賴的方式拯救Hdac3缺陷的MCA205腫瘤生長

(8) HDAC3與CXCL10在人HCC TME中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)

為了驗證HDAC3和CXCL10在人體樣本中的調(diào)節(jié)關(guān)系，我們收集HCC患者的惡性(n=86)和良性(n=41)組織，并進(jìn)行TMAIHC評估HDAC3、CD8a、CXCL10和CXCR3的蛋白表達(dá)(補(bǔ)充表S1和S2)。癌組織中HDAC3的表達(dá)高于良性組織，而CXCL10的表達(dá)低于良性組織(補(bǔ)充圖S9A和S9B)。此外，通過Kaplan-Meier分析根據(jù)HDAC3和CXCL10水平分類的不同亞組的臨床結(jié)局，結(jié)果表明，HDAC3高表達(dá)或CXCL10低表達(dá)的HCC患者(cutoff=50%)的預(yù)后比HDAC3低表達(dá)或CXCL10高表達(dá)的HCC患者更差(補(bǔ)充圖S9C)。為了觀察HCC樣本中HDAC3、CXCL10、CD8a和CXCR3之間的關(guān)系，我們進(jìn)一步分析了HDAC3、CD8a、CXCL10和CXCR3水平之間的相關(guān)性。HDAC3蛋白水平不高，但與CD8a和CXCL10的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，CD8a的表達(dá)與CXCR3蛋白水平呈正相關(guān)(補(bǔ)充圖S9D)。這些臨床樣本的結(jié)果表明，HDAC3可能調(diào)節(jié)CXCL10的表達(dá)，進(jìn)而影響CD8⁺ T細(xì)胞在HCC TME中的浸潤。

結(jié)論：我們證明了抑制HDAC3通過促進(jìn)Cxcl9, 10, 11的表達(dá)來募集T細(xì)胞浸潤到TME中，從而抑制腫瘤生長。這項工作可能有助于指導(dǎo)未來的癌癥治療，通過在腫瘤細(xì)胞中使用HDAC3-特異性抑制劑來治療腫瘤細(xì)胞。

參考文獻(xiàn)：Li, L., Hao, S., Gao, M., Liu, J., Xu, X., Huang, J., Cheng, G., & Yang, H. (2023). HDAC3 Inhibition Promotes Antitumor Immunity by Enhancing CXCL10-Mediated Chemotaxis and Recruiting of Immune Cells. Cancer immunology research, 11(5), 657–673. https://doi.org/10.1158/2326-6066.CIR-22-0317.