單細胞轉錄組學闡明了嗜堿性粒細胞分化軌跡， 并鑒定了成熟嗜堿性粒細胞上游的前嗜堿性粒細胞

     嗜堿性粒細胞是最稀有的粒細胞，被認為是2型免疫反應的關鍵細胞。然而，它們的分化路徑仍未完全闡明。在這項研究中，我們通過單細胞RNA測序分析來評估嗜堿性粒細胞的個體發(fā)育軌跡。結合流式細胞術和功能分析，我們發(fā)現(xiàn)c-Kit^-CLEC12A^hi前嗜堿性粒細胞位于前嗜堿性粒細胞和肥大細胞祖細胞(pre-BMPs)下游和CLEC12A^lo成熟嗜堿性粒細胞上游。轉錄分析預測，在基因表達譜方面，前嗜堿性粒細胞群體包括先前定義的嗜堿性粒細胞祖(BaP)-like 細胞。與成熟嗜堿性粒細胞相比，前嗜堿性粒細胞具有較高的增殖能力，對非IgE刺激的反應較好，但對抗原加IgE刺激的反應較弱。盡管前嗜堿性粒細胞通常停留在骨髓中，但它們會在蛔蟲感染的組織中出現(xiàn)，可能是通過IL-3介導抑制其在骨髓中的滯留。因此，本研究確定了在嗜堿性粒細胞個體發(fā)育過程中連接pre-BMPs和成熟嗜堿性粒細胞之間的前嗜堿性粒細胞。
     該研究于2023年5月發(fā)表發(fā)表在《Nature communications》，IF：17.694。

技術路線：

     實驗方法：抗體、細胞培養(yǎng)、流式細胞儀分析與細胞分選、Giemsa染色、scRNA-seq、bulk RNA-seq分析、蠕蟲感染、嗜堿性粒細胞分類純化后的體外細胞培養(yǎng)、統(tǒng)計分析。

1、骨髓來源的嗜堿性粒細胞（BMBAs）包含兩個亞群

     嗜堿性粒細胞是數(shù)量最少、壽命較短的粒細胞，因此常常使用骨髓來源的嗜堿性粒細胞(BMBAs)作為新鮮動物嗜堿性粒細胞的替代物。為了確定BMBAs的最佳培養(yǎng)條件，我們將小鼠骨髓細胞與不同濃度的IL-3進行培養(yǎng)，濃度范圍從0到100 ng/mL，培養(yǎng)時間為7天。隨著IL-3濃度增加至0.3 ng/mL，培養(yǎng)物中CD200R3⁺ c-Kit^?嗜堿性粒細胞的比例增加到約60%。在較高濃度的IL-3下，嗜堿性粒細胞的比例反而下降，而CD200R3⁺ c-Kit⁺肥大細胞的比例增加。因此，0.3 ng/mL的IL-3被證明是制備高純度嗜堿性細胞的最佳選擇，雖然遠低于通常使用的濃度。
在上述實驗中，我們注意到CD200R3⁺ c-Kit^? BMBAs中存在兩個亞群：FcεRIα^hiCD49b^lo和FcεRIα^loCD49b^hi（圖1a）。不論使用C57BL/6還是BALB/c小鼠，前者亞群的頻率隨著IL-3濃度增加而下降，表明IL-3對這兩個亞群之間的平衡產生影響。值得注意的是，F(xiàn)cεRIα^loCD49b^hi BMBAs顯示出與外周血嗜堿性粒細胞相同的環(huán)狀細胞核，而FcεRIα^hiCD49b^lo BMBAs則顯示出非典型形態(tài)，呈腎形凹陷狀，胞體較大（圖1b）。FcεRIα^hiCD49b^lo BMBas由于細胞體較大，其前向散射強度高于FcεRIα^loCD49b^hi BMBas（圖1c）。
     為了進一步表征和比較這兩個BMBAs亞群，我們對骨髓細胞的IL-3培養(yǎng)物中的細胞進行了無偏向單細胞RNA測序（scRNA-seq）分析。通過Seurat聚類分析scRNA-seq數(shù)據(jù)集，確定了11個細胞簇，其中簇0、簇2和簇10是根據(jù)Cd200r3和Mcpt8的高表達以及Kit的低表達被判定為嗜堿性粒細胞。在這三個簇中（分別在圖1d中表示為BMBA1、BMBA2和BMBA3），BMBA2和BMBA3的Fcer1a（編碼FcεRIα）表達較低，而Itga2（編碼CD49b）表達較高，相比之下BMBA1則相反（圖1d、e）。因此，BMBA2和BMBA3似乎對應于FcεRIα^loCD49b^hi BMBAs，而BMBA1對應于FcεRIα^hiCD49b^lo BMBAs。在BMBA1和BMBA2/3之間，我們檢測到5382個差異表達基因（DEGs），其中4811個基因在BMBA1中上調，而571個基因在BMBA2/3中上調（圖1f）。其中，我們選擇了兩個編碼細胞表面蛋白的基因，Clec12a編碼CLEC12A和Cd9編碼CD9（圖1e、f），作為可能的代用標記物，用于在后續(xù)實驗中區(qū)分BMBAs的兩個亞群。使用特異性單克隆抗體進行的流式細胞術分析顯示，F(xiàn)cεRIα^hiCD49b^lo和FcεRIα^loCD49b^hi BMBAs幾乎對應于CLEC12A^hiCD9^lo和CLEC12A^loCD9^hi BMBAs（圖1g）。同樣，CLEC12A^hiCD9^lo和CLEC12A^loCD9^hi BMBAs幾乎對應于FcεRIα^hiCD49b^lo和FcεRIα^loCD49b^hi BMBAs（圖1h）。

圖1|骨髓源性嗜堿性粒細胞(BMBA)由兩個不同的亞群組成。

2、在骨髓中檢測到兩個嗜堿性粒細胞的亞群，而在外周血和脾臟中只檢測到其中的一個亞群

     接下來，我們檢查了是否可以在從小鼠中新鮮分離的嗜堿性粒細胞中檢測到在BMBAs中鑒定出的兩個嗜堿性粒細胞亞群。在c-Kit^-CD200R3⁺ CD49b⁺嗜堿性粒細胞中，F(xiàn)cεRIα^loCD49b^hi/CLEC12A^loCD9^hi亞群在外周血、脾臟和骨髓中都很容易被鑒定出來（圖2a）。相反，盡管骨髓中存在，但在外周血和脾臟中很少檢測到FcεRIα^hiCD49b^lo /CLEC12A^hiCD9^lo亞群（圖2a）。骨髓、脾臟和外周血中的CLEC12A^loCD9^hi嗜堿性粒細胞具有典型的環(huán)形或雙裂核，而骨髓中的CLEC12A^hiCD9^lo嗜堿性粒細胞則顯示出具有腎臟形狀的凹陷核和較大的細胞體，并在流式細胞術中顯示出較高的前向散射（FSC），這與BMBAs中觀察到的情況相符（圖2b、c）。值得注意的是，Lin^-cKit^-CD34⁺ CD200R3⁺ BaPs也顯示出CLEC12A^hiCD9^lo表型，而在cKit^-CD200R3⁺嗜堿性粒細胞譜系細胞中，約10%的CLEC12A^hi亞群CD34表達量較低（圖2d），這表明CLEC12A^hi嗜堿性粒細胞可能包含單能的類似BaP的群體。支持這一觀點的是，CD34⁺ BaPs和CD34^- CLEC12A^hi嗜堿性粒細胞顯示出類似的形態(tài)和表面表達特征也支持了這一觀點。

圖2|在骨髓中也檢測到兩個亞群的嗜堿性粒細胞，而在外周血和脾中只檢測到一個亞群
   

3、單細胞RNA測序（scRNA-seq）分析鑒定出骨髓嗜堿性粒細胞中的4個簇

     我們使用Mcpt8^GFP轉基因小鼠進行分析，該轉基因小鼠在Mcpt8啟動子/增強子下表達GFP編碼基因，以有效富集和分離稀有的嗜堿性粒細胞，以分析骨髓嗜堿性粒細胞的分化軌跡。我們確認，CLEC12A^hi和CLEC12A^lo嗜堿性粒細胞亞群中的大多數(shù)細胞都表達GFP。從骨髓和脾臟中分離的Lineage（Lin）^- GFP⁺細胞分別進行了單細胞RNA測序分析。單細胞RNA測序數(shù)據(jù)的聚類分析鑒定出12個簇，其中0、1和4號簇對應于KitCd200r3⁺ Mcpt8⁺嗜堿性粒細胞。對這三個簇進行重新聚類，鑒定出1個Fcer1a⁺ Kit⁺Cd34⁺類似于pre-BMPs細胞的簇，1個Clec12a^hi嗜堿性粒細胞簇（Baso1）和2個Clec12a^lo嗜堿性粒細胞簇（Baso2和Baso3）（圖2e、f）。與流式細胞術分析結果一致，Clec12a^hi嗜堿性粒細胞（Baso1）在骨髓中豐富，而在脾臟中較少（圖2e、f）。與流式細胞術分析一致，21%的Clec12a^hi Baso1細胞的Cd34表達水平較低（圖2f）。
     為了驗證我們的發(fā)現(xiàn)，我們重新分析了由Weinreb等人報道的公開可用的scRNA-seq數(shù)據(jù)集（GEO登錄號：GSE140802），鑒定出1個Fcer1a⁺Kit⁺Cd34⁺類似于preBMPs細胞的簇，2個Clec12a^hi嗜堿性粒細胞簇（Baso1和Baso2），以及3個Clec12a^lo嗜堿性粒細胞簇（Baso3、Baso4和Baso5）。根據(jù)我們的scRNAseq數(shù)據(jù)分析，僅有小部分（11.4%）的Clec12a^hi嗜堿性粒細胞顯示Cd34表達水平較低，這表明Clec12a^hi嗜堿性粒細胞中的這一小部分可能對應于Cd34^lo類似于BaP的細胞。

4、CLEC12A^hi嗜堿性粒細胞在體外和體內分化為CLEC12A^lo嗜堿性粒細胞

     對我們的scRNA-seq數(shù)據(jù)進行的偽時間軌跡分析和RNA速度分析推斷嗜堿性粒細胞的分化軌跡，從前BMPs-like細胞到Clec12a^hi嗜堿性粒細胞，然后到Clec12alo嗜堿性粒細胞 (圖2g，h)。
     為了驗證假設，我們追蹤了從骨髓中分離出，并在體外培養(yǎng)2天的c-Kit^-嗜堿性粒細胞的FcεRIα^hiCD49b^lo和FcεRIα^loCD49b^hi組分的表面CLEC12A和CD9表達的變化。在培養(yǎng)過程中，大多數(shù)的FcεRIα^hiCD49b^lo嗜堿性粒細胞的表面表型從CLEC12A^hiCD9^lo轉變?yōu)镃LEC12A^loCD9^hi（圖3a，左圖）。相反，F(xiàn)cεRIα^loCD49b^hi嗜堿性粒細胞即使在培養(yǎng)2天后仍然保持CLEC12A^loCD9^hi表型（圖3a，右圖）。值得注意的是，F(xiàn)cεRIα^loCD49b^hi 嗜堿性粒細胞在2天的培養(yǎng)過程中細胞總數(shù)減少了約90％，而FcεRIα^hiCD49b^lo 嗜堿性粒細胞的減少僅約為40％（圖3b，c），這表明前者的壽命較短。當我們分別培養(yǎng)骨髓嗜堿性粒細胞的CLEC12A^hiCD9^lo和CLEC12A^loCD9^hi亞群，并追蹤FcεRIα和CD49b表面表達的變化時，也獲得了相符的結果。這些結果強烈表明，CLEC12A^hiCD9^lo/FcεRIα^hiCD49b^lo 嗜堿性粒細胞相對不成熟，并且可以分化為CLEC12A^loCD9^hi/FcεRIα^loCD49b^hi成熟型嗜堿性粒細胞，盡管后者的Fcer1a、Mcpt8和Prss34表達水平低于前者（圖2i）。
     接下來，我們檢查了體外實驗的體內相關性。FcεRIα^hiCD49b^lo和FcεRIα^loCD49b^hi組分分別從CD45.2⁺小鼠的骨髓細胞中分類純化并過繼轉移到亞致死劑量照射的CD45.1⁺小鼠（圖3d）。與體外實驗觀察到的結果一致，大多數(shù)的FcεRIα^hiCD49b^lo 嗜堿性粒細胞在骨髓中將它們的表面表型從CLEC12A^hiCD9^lo轉變?yōu)镃LEC12A^loCD9^hi，而大多數(shù)的FcεRIα^loCD49b^hi 嗜堿性粒細胞仍保持CLEC12A^loCD9^hi（圖3d）。
     綜上所述，我們得出結論，骨髓中的CLEC12A^hiCD9^lo/ FcεRIα^hiCD49b^lo 嗜堿性粒細胞在表面標記物的表達、細胞大小和核形狀上顯示出前體like的表型，并在骨髓內分化為CLEC12A^loCD9^hi/ FcεRIα^loCD49b^hi成熟嗜堿性粒細胞，這些嗜堿性粒細胞也存在于外周血和脾臟中。因此，在接下來的實驗中，我們將CLEC12A^hiCD9^lo/ FcεRIα^hiCD49b^lo和CLEC12A^loCD9^hi/FcεRIα^loCD49b^hi 嗜堿性粒細胞分別稱為前體嗜堿性粒細胞和成熟嗜堿性粒細胞。

圖3| CLEC12A^hi嗜堿性粒細胞在體外和體內分化為CLEC12A^lo嗜堿性粒細胞

5、前嗜堿性粒細胞和成熟嗜堿性粒細胞表現(xiàn)出不同的細胞增殖和激活特性

     為了進一步鑒定前嗜堿性粒細胞（pre-嗜堿性粒細胞）和成熟嗜堿性粒細胞（mature 嗜堿性粒細胞），我們分別從骨髓中分離了CLEC12A^hiCD9^loCD34^-的前嗜堿性粒細胞以及從骨髓和脾臟分離的CLEC12A^loCD9^hi的成熟嗜堿性粒細胞，并利用批量RNA測序分析比較它們的基因表達譜（圖4a）。作為參考，我們還包括了純化的CD34⁺ BaPs，它們被定義為單功能嗜堿性粒細胞前體細胞。DEGS的系統(tǒng)聚類分析表明，從骨髓和脾臟分離的成熟嗜堿性粒細胞的基因表達譜彼此相似，而CD34^-的前嗜堿性粒細胞和成熟嗜堿性粒細胞的基因表達譜顯示出明顯差異（圖4a）。值得注意的是，CD34^-的前嗜堿性粒細胞的基因表達譜與CD34⁺BaPs的基因表達譜相似（圖4a），加強了我們之前關于CD34⁺BaPs被包括在CLEC12A^hi前嗜堿性粒細胞群體中的推測。
     GO富集分析顯示，與細胞增殖相關的GO術語，如“核分裂”、“染色體分離”和“DNA復制”，在CLEC12A^hi前嗜堿性粒細胞中富集，與CLEC12A^lo成熟嗜堿性粒細胞相比（圖4b），單細胞RNA測序分析結果顯示，與CLEC12A^lo Baso2/3群體相比CLEC12A^hi Baso1群體顯示出較高的S期得分。實際上，在前嗜堿性粒細胞中明顯檢測到EdU核苷類似物的攝取，而成熟嗜堿性粒細胞中未檢測到（圖4d），這表明前嗜堿性粒細胞的增殖能力。前嗜堿性粒細胞和成熟嗜堿性粒細胞在增殖能力上的差異似乎可以解釋在2天培養(yǎng)過程中觀察到的細胞總數(shù)減少的差異（圖3c）
     與前嗜堿性粒細胞相比，成熟嗜堿性粒細胞富集了與免疫效應功能相關的GO術語，如“調節(jié)免疫效應過程”和“正調節(jié)細胞因子產生”（圖4c）。當受到IgE加抗原的刺激時，CLEC12A^lo成熟嗜堿性粒細胞顯示出比CLEC12A^hi前嗜堿性粒細胞更高水平的CD63表達（代表顆粒脫顆粒的指標）和IL-4產生（圖4e，f），盡管成熟嗜堿性粒細胞表面FcεRI表達水平較低（圖2a）。有趣的是，當受到IL-3、IL-33和LPS等先天型刺激時，前嗜堿性粒細胞產生比成熟嗜堿性粒細胞更高水平的IL-4（圖4g）。此外，批量RNA測序分析發(fā)現(xiàn)，在IL-3刺激的前嗜堿性粒細胞中，其基因表達譜與IL-3或抗原/IgE刺激的成熟嗜堿性粒細胞有所不同，包括前者中Il10和Il13的上調表達。因此，前嗜堿性粒細胞似乎對非IgE刺激更具反應性，而成熟嗜堿性粒細胞對IgE/變應原刺激更具反應性。
     根據(jù)細胞因子環(huán)境的不同即在嗜堿性細胞產生過程中是否存在IL-3或TSLP ，兩種具有不同表型和功能特性的嗜堿性粒細胞群體被報道。當受到IL-3和IL-33的刺激時，TSLP誘導的嗜堿性粒細胞比IL-3誘導的嗜堿性粒細胞產生更多的IL-4和IL-6。相反，在脫顆粒方面，TSLP誘導的嗜堿性粒細胞對IgE交聯(lián)的反應較差。這種TSLP誘導的嗜堿性粒細胞的反應性似乎與本研究中鑒定的前嗜堿性粒細胞相似。然而，TSLP誘導的嗜堿性粒細胞在大小上相對較小，并具有成熟型嗜堿性粒細胞特有的環(huán)狀核。據(jù)此，我們發(fā)現(xiàn)大多數(shù)TSLP誘導的嗜堿性粒細胞表現(xiàn)為成熟嗜堿性粒細胞（FcεRIα^loCD49b^hi/CLEC12A^loCD9^hi表型），而不是前嗜堿性粒細胞。此外，TSLP誘導的成熟嗜堿性粒細胞顯示出類似于IL-3誘導的成熟嗜堿性粒細胞的基因表達譜，而不是前嗜堿性粒細胞。
     綜上所述，TSLP誘導的嗜堿性粒細胞似乎不對應于前嗜堿性粒細胞，可被歸類為成熟嗜堿性粒細胞的一個亞群。

圖4|前嗜堿性粒細胞和成熟嗜堿性粒細胞表現(xiàn)出不同的細胞增殖和激活特性

6、在蠕蟲感染期間，周圍組織中不僅出現(xiàn)成熟的嗜堿性粒細胞，而且還出現(xiàn)前嗜堿性粒細胞

     在寄生蟲感染期間，嗜堿性粒細胞常常浸潤到外周組織中。巴西尼普斯壯線蟲（Nb）是一種在人類鉤蟲感染的小鼠模型中被廣泛研究的蠕蟲。它們通過皮膚進入宿主動物，遷移到肺部，最終到達腸道。寄生蟲通過肺部后，嗜堿性粒細胞在肺部積累，并且對抑制過度肺部炎癥和修復受損肺組織至關重要。在Nb感染后的第7天，我們在脾臟、血液甚至肺部除了CLEC12A^lo成熟嗜堿性粒細胞外，還檢測到CLEC12A^hi前嗜堿性粒細胞（圖5a），這與未感染或PBS注射對照小鼠中前嗜堿性粒細胞主要存在于骨髓中的觀察結果相反（圖2a）。從Nb感染的肺部分離的前嗜堿性粒細胞顯示出比成熟嗜堿性粒細胞更高的體外EdU摻入（圖5b），這表明前嗜堿性粒細胞即使在骨髓之外仍保持著較高的增殖能力。此外，在感染的肺部積累的前嗜堿性粒細胞與成熟嗜堿性粒細胞的IL-4表達相當，這暗示它們可能對Nb感染的Th2免疫起到貢獻作用（圖5c）。
     我們以前曾證明在二次Nb感染中，嗜堿性粒細胞滲入受感染的皮膚，并將蠕蟲困在皮膚內，以防止感染進一步傳播到肺部和腸道。在第二次NB感染的皮損中，除了CLEC12A^lo成熟的嗜堿性粒細胞外，還檢測到了前嗜堿性粒細胞（圖5d）。從骨髓和第二次感染的皮膚中分離的CD200R3⁺ cKit^-細胞的單細胞RNA測序分析鑒定了9個聚類，其中聚類0、1和2對應于Cd200r3⁺ Mcpt8⁺嗜堿性粒細胞。在這三個嗜堿性粒細胞聚類中，我們在兩個器官中都檢測到一個Clec12a^hi前嗜堿性粒細胞聚類和兩個Clec12a^lo成熟嗜堿性粒細胞聚類（圖5e，f）。對來自Nb感染和未感染小鼠的嗜堿性粒細胞的單細胞RNA測序數(shù)據(jù)進行整合分析發(fā)現(xiàn)，在Nb感染小鼠的皮膚中檢測到的前嗜堿性粒細胞的基因表達譜與未感染小鼠骨髓中的前嗜堿性粒細胞非常接近，包括Fcer1a，Clec12a，Mcpt8和Prss34的上調表達（圖5f）。此外，基因集富集分析（GSEA）和GO富集分析發(fā)現(xiàn)，在Nb感染的皮膚中，前嗜堿性粒細胞富集了與細胞增殖相關的基因，包括“染色體分離”（圖5g），這表明前嗜堿性粒細胞在感染的皮膚中保持著其高增殖能力，在感染的肺部觀察到的結果也一樣。

圖5|蠕蟲感染期間外周組織中可檢測到前嗜堿性粒細胞

7、前嗜堿性粒細胞中IL-3介導的CXCR4下調促進其從骨髓中排出

     接下來，我們試圖闡明在Nb感染期間前嗜堿性粒細胞在外周組織中可能出現(xiàn)的機制。
     先前已經證明Nb感染能夠引起全身性的IL-3上調，因此我們研究了IL-3對骨髓外出現(xiàn)的前嗜堿性粒細胞的可能貢獻。在小鼠體內腹腔注射IL-3復合物（重組IL-3與單克隆抗IL-3抗體混合）后，外周血中出現(xiàn)CLEC12A^hi的前嗜堿性粒細胞（圖. 6a）。我們推測IL-3誘導了前嗜堿性粒細胞從骨髓中外流。為了驗證這一可能性，我們對IL-3和PBS對照處理的BMBAs進行了批量RNA測序分析，并鑒定了兩者之間的差異表達基因（DEGs）。我們特別注意到Cxcr4基因的表達在IL-3刺激下顯著降低（圖. 6b），因為CXCR4已被證明是一種重要的趨化因子受體，對免疫細胞在骨髓中的滯留起作用。骨髓細胞的單細胞RNA測序和流式細胞分析顯示，在轉錄和蛋白水平上，CXCR4在前嗜堿性粒細胞中的表達高于成熟嗜堿性粒細胞（圖. 6c），而IL-3刺激能夠降低CLEC12A^lo成熟嗜堿性粒細胞和CLEC12A^hi前嗜堿性粒細胞表面CXCR4的表達（圖. 6d）。這些結果表明，由于CXCR4的高表達，前嗜堿性粒細胞留在骨髓中，而IL-3介導的CXCR4下調可能促進前嗜堿性粒細胞從骨髓中外出。根據(jù)這一假設，給小鼠腹腔注射一種CXCR4抑制劑AMD3100，可導致外周血和脾中出現(xiàn)CLEC12A^hi前嗜堿性粒細胞（圖. 6e）。因此，因此，在骨髓的前嗜堿性粒細胞中，IL-3介導的CXCR4的下調至少部分地解釋了前嗜堿性粒細胞從骨髓中流出，并在Nb感染期間它們出現(xiàn)在肺和皮膚中。

圖6|前嗜堿性粒細胞中IL-3介導的CXCR4下調促進其從骨髓中排出

參考文獻：
Miyake, K., Ito, J., Nakabayashi, J. et al. Single cell transcriptomics clarifies the basophil differentiation trajectory and identifies pre-嗜堿性粒細胞 upstream of mature 嗜堿性粒細胞. Nat Commun 14, 2694 (2023).https://doi.org/10.1038/s41467-023-38356-1