單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)闡明了嗜堿性粒細(xì)胞分化軌跡， 并鑒定了成熟嗜堿性粒細(xì)胞上游的前嗜堿性粒細(xì)胞

     嗜堿性粒細(xì)胞是最稀有的粒細(xì)胞，被認(rèn)為是2型免疫反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞。然而，它們的分化路徑仍未完全闡明。在這項(xiàng)研究中，我們通過單細(xì)胞RNA測序分析來評估嗜堿性粒細(xì)胞的個(gè)體發(fā)育軌跡。結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)和功能分析，我們發(fā)現(xiàn)c-Kit^-CLEC12A^hi前嗜堿性粒細(xì)胞位于前嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞祖細(xì)胞(pre-BMPs)下游和CLEC12A^lo成熟嗜堿性粒細(xì)胞上游。轉(zhuǎn)錄分析預(yù)測，在基因表達(dá)譜方面，前嗜堿性粒細(xì)胞群體包括先前定義的嗜堿性粒細(xì)胞祖(BaP)-like 細(xì)胞。與成熟嗜堿性粒細(xì)胞相比，前嗜堿性粒細(xì)胞具有較高的增殖能力，對非IgE刺激的反應(yīng)較好，但對抗原加IgE刺激的反應(yīng)較弱。盡管前嗜堿性粒細(xì)胞通常停留在骨髓中，但它們會(huì)在蛔蟲感染的組織中出現(xiàn)，可能是通過IL-3介導(dǎo)抑制其在骨髓中的滯留。因此，本研究確定了在嗜堿性粒細(xì)胞個(gè)體發(fā)育過程中連接pre-BMPs和成熟嗜堿性粒細(xì)胞之間的前嗜堿性粒細(xì)胞。
     該研究于2023年5月發(fā)表發(fā)表在《Nature communications》，IF：17.694。

技術(shù)路線：

     實(shí)驗(yàn)方法：抗體、細(xì)胞培養(yǎng)、流式細(xì)胞儀分析與細(xì)胞分選、Giemsa染色、scRNA-seq、bulk RNA-seq分析、蠕蟲感染、嗜堿性粒細(xì)胞分類純化后的體外細(xì)胞培養(yǎng)、統(tǒng)計(jì)分析。

1、骨髓來源的嗜堿性粒細(xì)胞（BMBAs）包含兩個(gè)亞群

     嗜堿性粒細(xì)胞是數(shù)量最少、壽命較短的粒細(xì)胞，因此常常使用骨髓來源的嗜堿性粒細(xì)胞(BMBAs)作為新鮮動(dòng)物嗜堿性粒細(xì)胞的替代物。為了確定BMBAs的最佳培養(yǎng)條件，我們將小鼠骨髓細(xì)胞與不同濃度的IL-3進(jìn)行培養(yǎng)，濃度范圍從0到100 ng/mL，培養(yǎng)時(shí)間為7天。隨著IL-3濃度增加至0.3 ng/mL，培養(yǎng)物中CD200R3⁺ c-Kit^?嗜堿性粒細(xì)胞的比例增加到約60%。在較高濃度的IL-3下，嗜堿性粒細(xì)胞的比例反而下降，而CD200R3⁺ c-Kit⁺肥大細(xì)胞的比例增加。因此，0.3 ng/mL的IL-3被證明是制備高純度嗜堿性細(xì)胞的最佳選擇，雖然遠(yuǎn)低于通常使用的濃度。
在上述實(shí)驗(yàn)中，我們注意到CD200R3⁺ c-Kit^? BMBAs中存在兩個(gè)亞群：FcεRIα^hiCD49b^lo和FcεRIα^loCD49b^hi（圖1a）。不論使用C57BL/6還是BALB/c小鼠，前者亞群的頻率隨著IL-3濃度增加而下降，表明IL-3對這兩個(gè)亞群之間的平衡產(chǎn)生影響。值得注意的是，F(xiàn)cεRIα^loCD49b^hi BMBAs顯示出與外周血嗜堿性粒細(xì)胞相同的環(huán)狀細(xì)胞核，而FcεRIα^hiCD49b^lo BMBAs則顯示出非典型形態(tài)，呈腎形凹陷狀，胞體較大（圖1b）。FcεRIα^hiCD49b^lo BMBas由于細(xì)胞體較大，其前向散射強(qiáng)度高于FcεRIα^loCD49b^hi BMBas（圖1c）。
     為了進(jìn)一步表征和比較這兩個(gè)BMBAs亞群，我們對骨髓細(xì)胞的IL-3培養(yǎng)物中的細(xì)胞進(jìn)行了無偏向單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）分析。通過Seurat聚類分析scRNA-seq數(shù)據(jù)集，確定了11個(gè)細(xì)胞簇，其中簇0、簇2和簇10是根據(jù)Cd200r3和Mcpt8的高表達(dá)以及Kit的低表達(dá)被判定為嗜堿性粒細(xì)胞。在這三個(gè)簇中（分別在圖1d中表示為BMBA1、BMBA2和BMBA3），BMBA2和BMBA3的Fcer1a（編碼FcεRIα）表達(dá)較低，而Itga2（編碼CD49b）表達(dá)較高，相比之下BMBA1則相反（圖1d、e）。因此，BMBA2和BMBA3似乎對應(yīng)于FcεRIα^loCD49b^hi BMBAs，而BMBA1對應(yīng)于FcεRIα^hiCD49b^lo BMBAs。在BMBA1和BMBA2/3之間，我們檢測到5382個(gè)差異表達(dá)基因（DEGs），其中4811個(gè)基因在BMBA1中上調(diào)，而571個(gè)基因在BMBA2/3中上調(diào)（圖1f）。其中，我們選擇了兩個(gè)編碼細(xì)胞表面蛋白的基因，Clec12a編碼CLEC12A和Cd9編碼CD9（圖1e、f），作為可能的代用標(biāo)記物，用于在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中區(qū)分BMBAs的兩個(gè)亞群。使用特異性單克隆抗體進(jìn)行的流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，F(xiàn)cεRIα^hiCD49b^lo和FcεRIα^loCD49b^hi BMBAs幾乎對應(yīng)于CLEC12A^hiCD9^lo和CLEC12A^loCD9^hi BMBAs（圖1g）。同樣，CLEC12A^hiCD9^lo和CLEC12A^loCD9^hi BMBAs幾乎對應(yīng)于FcεRIα^hiCD49b^lo和FcεRIα^loCD49b^hi BMBAs（圖1h）。

圖1|骨髓源性嗜堿性粒細(xì)胞(BMBA)由兩個(gè)不同的亞群組成。

2、在骨髓中檢測到兩個(gè)嗜堿性粒細(xì)胞的亞群，而在外周血和脾臟中只檢測到其中的一個(gè)亞群

     接下來，我們檢查了是否可以在從小鼠中新鮮分離的嗜堿性粒細(xì)胞中檢測到在BMBAs中鑒定出的兩個(gè)嗜堿性粒細(xì)胞亞群。在c-Kit^-CD200R3⁺ CD49b⁺嗜堿性粒細(xì)胞中，F(xiàn)cεRIα^loCD49b^hi/CLEC12A^loCD9^hi亞群在外周血、脾臟和骨髓中都很容易被鑒定出來（圖2a）。相反，盡管骨髓中存在，但在外周血和脾臟中很少檢測到FcεRIα^hiCD49b^lo /CLEC12A^hiCD9^lo亞群（圖2a）。骨髓、脾臟和外周血中的CLEC12A^loCD9^hi嗜堿性粒細(xì)胞具有典型的環(huán)形或雙裂核，而骨髓中的CLEC12A^hiCD9^lo嗜堿性粒細(xì)胞則顯示出具有腎臟形狀的凹陷核和較大的細(xì)胞體，并在流式細(xì)胞術(shù)中顯示出較高的前向散射（FSC），這與BMBAs中觀察到的情況相符（圖2b、c）。值得注意的是，Lin^-cKit^-CD34⁺ CD200R3⁺ BaPs也顯示出CLEC12A^hiCD9^lo表型，而在cKit^-CD200R3⁺嗜堿性粒細(xì)胞譜系細(xì)胞中，約10%的CLEC12A^hi亞群CD34表達(dá)量較低（圖2d），這表明CLEC12A^hi嗜堿性粒細(xì)胞可能包含單能的類似BaP的群體。支持這一觀點(diǎn)的是，CD34⁺ BaPs和CD34^- CLEC12A^hi嗜堿性粒細(xì)胞顯示出類似的形態(tài)和表面表達(dá)特征也支持了這一觀點(diǎn)。

圖2|在骨髓中也檢測到兩個(gè)亞群的嗜堿性粒細(xì)胞，而在外周血和脾中只檢測到一個(gè)亞群
   

3、單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）分析鑒定出骨髓嗜堿性粒細(xì)胞中的4個(gè)簇

     我們使用Mcpt8^GFP轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行分析，該轉(zhuǎn)基因小鼠在Mcpt8啟動(dòng)子/增強(qiáng)子下表達(dá)GFP編碼基因，以有效富集和分離稀有的嗜堿性粒細(xì)胞，以分析骨髓嗜堿性粒細(xì)胞的分化軌跡。我們確認(rèn)，CLEC12A^hi和CLEC12A^lo嗜堿性粒細(xì)胞亞群中的大多數(shù)細(xì)胞都表達(dá)GFP。從骨髓和脾臟中分離的Lineage（Lin）^- GFP⁺細(xì)胞分別進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測序分析。單細(xì)胞RNA測序數(shù)據(jù)的聚類分析鑒定出12個(gè)簇，其中0、1和4號簇對應(yīng)于KitCd200r3⁺ Mcpt8⁺嗜堿性粒細(xì)胞。對這三個(gè)簇進(jìn)行重新聚類，鑒定出1個(gè)Fcer1a⁺ Kit⁺Cd34⁺類似于pre-BMPs細(xì)胞的簇，1個(gè)Clec12a^hi嗜堿性粒細(xì)胞簇（Baso1）和2個(gè)Clec12a^lo嗜堿性粒細(xì)胞簇（Baso2和Baso3）（圖2e、f）。與流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果一致，Clec12a^hi嗜堿性粒細(xì)胞（Baso1）在骨髓中豐富，而在脾臟中較少（圖2e、f）。與流式細(xì)胞術(shù)分析一致，21%的Clec12a^hi Baso1細(xì)胞的Cd34表達(dá)水平較低（圖2f）。
     為了驗(yàn)證我們的發(fā)現(xiàn)，我們重新分析了由Weinreb等人報(bào)道的公開可用的scRNA-seq數(shù)據(jù)集（GEO登錄號：GSE140802），鑒定出1個(gè)Fcer1a⁺Kit⁺Cd34⁺類似于preBMPs細(xì)胞的簇，2個(gè)Clec12a^hi嗜堿性粒細(xì)胞簇（Baso1和Baso2），以及3個(gè)Clec12a^lo嗜堿性粒細(xì)胞簇（Baso3、Baso4和Baso5）。根據(jù)我們的scRNAseq數(shù)據(jù)分析，僅有小部分（11.4%）的Clec12a^hi嗜堿性粒細(xì)胞顯示Cd34表達(dá)水平較低，這表明Clec12a^hi嗜堿性粒細(xì)胞中的這一小部分可能對應(yīng)于Cd34^lo類似于BaP的細(xì)胞。

4、CLEC12A^hi嗜堿性粒細(xì)胞在體外和體內(nèi)分化為CLEC12A^lo嗜堿性粒細(xì)胞

     對我們的scRNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行的偽時(shí)間軌跡分析和RNA速度分析推斷嗜堿性粒細(xì)胞的分化軌跡，從前BMPs-like細(xì)胞到Clec12a^hi嗜堿性粒細(xì)胞，然后到Clec12alo嗜堿性粒細(xì)胞 (圖2g，h)。
     為了驗(yàn)證假設(shè)，我們追蹤了從骨髓中分離出，并在體外培養(yǎng)2天的c-Kit^-嗜堿性粒細(xì)胞的FcεRIα^hiCD49b^lo和FcεRIα^loCD49b^hi組分的表面CLEC12A和CD9表達(dá)的變化。在培養(yǎng)過程中，大多數(shù)的FcεRIα^hiCD49b^lo嗜堿性粒細(xì)胞的表面表型從CLEC12A^hiCD9^lo轉(zhuǎn)變?yōu)镃LEC12A^loCD9^hi（圖3a，左圖）。相反，F(xiàn)cεRIα^loCD49b^hi嗜堿性粒細(xì)胞即使在培養(yǎng)2天后仍然保持CLEC12A^loCD9^hi表型（圖3a，右圖）。值得注意的是，F(xiàn)cεRIα^loCD49b^hi 嗜堿性粒細(xì)胞在2天的培養(yǎng)過程中細(xì)胞總數(shù)減少了約90％，而FcεRIα^hiCD49b^lo 嗜堿性粒細(xì)胞的減少僅約為40％（圖3b，c），這表明前者的壽命較短。當(dāng)我們分別培養(yǎng)骨髓嗜堿性粒細(xì)胞的CLEC12A^hiCD9^lo和CLEC12A^loCD9^hi亞群，并追蹤FcεRIα和CD49b表面表達(dá)的變化時(shí)，也獲得了相符的結(jié)果。這些結(jié)果強(qiáng)烈表明，CLEC12A^hiCD9^lo/FcεRIα^hiCD49b^lo 嗜堿性粒細(xì)胞相對不成熟，并且可以分化為CLEC12A^loCD9^hi/FcεRIα^loCD49b^hi成熟型嗜堿性粒細(xì)胞，盡管后者的Fcer1a、Mcpt8和Prss34表達(dá)水平低于前者（圖2i）。
     接下來，我們檢查了體外實(shí)驗(yàn)的體內(nèi)相關(guān)性。FcεRIα^hiCD49b^lo和FcεRIα^loCD49b^hi組分分別從CD45.2⁺小鼠的骨髓細(xì)胞中分類純化并過繼轉(zhuǎn)移到亞致死劑量照射的CD45.1⁺小鼠（圖3d）。與體外實(shí)驗(yàn)觀察到的結(jié)果一致，大多數(shù)的FcεRIα^hiCD49b^lo 嗜堿性粒細(xì)胞在骨髓中將它們的表面表型從CLEC12A^hiCD9^lo轉(zhuǎn)變?yōu)镃LEC12A^loCD9^hi，而大多數(shù)的FcεRIα^loCD49b^hi 嗜堿性粒細(xì)胞仍保持CLEC12A^loCD9^hi（圖3d）。
     綜上所述，我們得出結(jié)論，骨髓中的CLEC12A^hiCD9^lo/ FcεRIα^hiCD49b^lo 嗜堿性粒細(xì)胞在表面標(biāo)記物的表達(dá)、細(xì)胞大小和核形狀上顯示出前體like的表型，并在骨髓內(nèi)分化為CLEC12A^loCD9^hi/ FcεRIα^loCD49b^hi成熟嗜堿性粒細(xì)胞，這些嗜堿性粒細(xì)胞也存在于外周血和脾臟中。因此，在接下來的實(shí)驗(yàn)中，我們將CLEC12A^hiCD9^lo/ FcεRIα^hiCD49b^lo和CLEC12A^loCD9^hi/FcεRIα^loCD49b^hi 嗜堿性粒細(xì)胞分別稱為前體嗜堿性粒細(xì)胞和成熟嗜堿性粒細(xì)胞。

圖3| CLEC12A^hi嗜堿性粒細(xì)胞在體外和體內(nèi)分化為CLEC12A^lo嗜堿性粒細(xì)胞

5、前嗜堿性粒細(xì)胞和成熟嗜堿性粒細(xì)胞表現(xiàn)出不同的細(xì)胞增殖和激活特性

     為了進(jìn)一步鑒定前嗜堿性粒細(xì)胞（pre-嗜堿性粒細(xì)胞）和成熟嗜堿性粒細(xì)胞（mature 嗜堿性粒細(xì)胞），我們分別從骨髓中分離了CLEC12A^hiCD9^loCD34^-的前嗜堿性粒細(xì)胞以及從骨髓和脾臟分離的CLEC12A^loCD9^hi的成熟嗜堿性粒細(xì)胞，并利用批量RNA測序分析比較它們的基因表達(dá)譜（圖4a）。作為參考，我們還包括了純化的CD34⁺ BaPs，它們被定義為單功能嗜堿性粒細(xì)胞前體細(xì)胞。DEGS的系統(tǒng)聚類分析表明，從骨髓和脾臟分離的成熟嗜堿性粒細(xì)胞的基因表達(dá)譜彼此相似，而CD34^-的前嗜堿性粒細(xì)胞和成熟嗜堿性粒細(xì)胞的基因表達(dá)譜顯示出明顯差異（圖4a）。值得注意的是，CD34^-的前嗜堿性粒細(xì)胞的基因表達(dá)譜與CD34⁺BaPs的基因表達(dá)譜相似（圖4a），加強(qiáng)了我們之前關(guān)于CD34⁺BaPs被包括在CLEC12A^hi前嗜堿性粒細(xì)胞群體中的推測。
     GO富集分析顯示，與細(xì)胞增殖相關(guān)的GO術(shù)語，如“核分裂”、“染色體分離”和“DNA復(fù)制”，在CLEC12A^hi前嗜堿性粒細(xì)胞中富集，與CLEC12A^lo成熟嗜堿性粒細(xì)胞相比（圖4b），單細(xì)胞RNA測序分析結(jié)果顯示，與CLEC12A^lo Baso2/3群體相比CLEC12A^hi Baso1群體顯示出較高的S期得分。實(shí)際上，在前嗜堿性粒細(xì)胞中明顯檢測到EdU核苷類似物的攝取，而成熟嗜堿性粒細(xì)胞中未檢測到（圖4d），這表明前嗜堿性粒細(xì)胞的增殖能力。前嗜堿性粒細(xì)胞和成熟嗜堿性粒細(xì)胞在增殖能力上的差異似乎可以解釋在2天培養(yǎng)過程中觀察到的細(xì)胞總數(shù)減少的差異（圖3c）
     與前嗜堿性粒細(xì)胞相比，成熟嗜堿性粒細(xì)胞富集了與免疫效應(yīng)功能相關(guān)的GO術(shù)語，如“調(diào)節(jié)免疫效應(yīng)過程”和“正調(diào)節(jié)細(xì)胞因子產(chǎn)生”（圖4c）。當(dāng)受到IgE加抗原的刺激時(shí)，CLEC12A^lo成熟嗜堿性粒細(xì)胞顯示出比CLEC12A^hi前嗜堿性粒細(xì)胞更高水平的CD63表達(dá)（代表顆粒脫顆粒的指標(biāo)）和IL-4產(chǎn)生（圖4e，f），盡管成熟嗜堿性粒細(xì)胞表面FcεRI表達(dá)水平較低（圖2a）。有趣的是，當(dāng)受到IL-3、IL-33和LPS等先天型刺激時(shí)，前嗜堿性粒細(xì)胞產(chǎn)生比成熟嗜堿性粒細(xì)胞更高水平的IL-4（圖4g）。此外，批量RNA測序分析發(fā)現(xiàn)，在IL-3刺激的前嗜堿性粒細(xì)胞中，其基因表達(dá)譜與IL-3或抗原/IgE刺激的成熟嗜堿性粒細(xì)胞有所不同，包括前者中Il10和Il13的上調(diào)表達(dá)。因此，前嗜堿性粒細(xì)胞似乎對非IgE刺激更具反應(yīng)性，而成熟嗜堿性粒細(xì)胞對IgE/變應(yīng)原刺激更具反應(yīng)性。
     根據(jù)細(xì)胞因子環(huán)境的不同即在嗜堿性細(xì)胞產(chǎn)生過程中是否存在IL-3或TSLP ，兩種具有不同表型和功能特性的嗜堿性粒細(xì)胞群體被報(bào)道。當(dāng)受到IL-3和IL-33的刺激時(shí)，TSLP誘導(dǎo)的嗜堿性粒細(xì)胞比IL-3誘導(dǎo)的嗜堿性粒細(xì)胞產(chǎn)生更多的IL-4和IL-6。相反，在脫顆粒方面，TSLP誘導(dǎo)的嗜堿性粒細(xì)胞對IgE交聯(lián)的反應(yīng)較差。這種TSLP誘導(dǎo)的嗜堿性粒細(xì)胞的反應(yīng)性似乎與本研究中鑒定的前嗜堿性粒細(xì)胞相似。然而，TSLP誘導(dǎo)的嗜堿性粒細(xì)胞在大小上相對較小，并具有成熟型嗜堿性粒細(xì)胞特有的環(huán)狀核。據(jù)此，我們發(fā)現(xiàn)大多數(shù)TSLP誘導(dǎo)的嗜堿性粒細(xì)胞表現(xiàn)為成熟嗜堿性粒細(xì)胞（FcεRIα^loCD49b^hi/CLEC12A^loCD9^hi表型），而不是前嗜堿性粒細(xì)胞。此外，TSLP誘導(dǎo)的成熟嗜堿性粒細(xì)胞顯示出類似于IL-3誘導(dǎo)的成熟嗜堿性粒細(xì)胞的基因表達(dá)譜，而不是前嗜堿性粒細(xì)胞。
     綜上所述，TSLP誘導(dǎo)的嗜堿性粒細(xì)胞似乎不對應(yīng)于前嗜堿性粒細(xì)胞，可被歸類為成熟嗜堿性粒細(xì)胞的一個(gè)亞群。

圖4|前嗜堿性粒細(xì)胞和成熟嗜堿性粒細(xì)胞表現(xiàn)出不同的細(xì)胞增殖和激活特性

6、在蠕蟲感染期間，周圍組織中不僅出現(xiàn)成熟的嗜堿性粒細(xì)胞，而且還出現(xiàn)前嗜堿性粒細(xì)胞

     在寄生蟲感染期間，嗜堿性粒細(xì)胞常常浸潤到外周組織中。巴西尼普斯壯線蟲（Nb）是一種在人類鉤蟲感染的小鼠模型中被廣泛研究的蠕蟲。它們通過皮膚進(jìn)入宿主動(dòng)物，遷移到肺部，最終到達(dá)腸道。寄生蟲通過肺部后，嗜堿性粒細(xì)胞在肺部積累，并且對抑制過度肺部炎癥和修復(fù)受損肺組織至關(guān)重要。在Nb感染后的第7天，我們在脾臟、血液甚至肺部除了CLEC12A^lo成熟嗜堿性粒細(xì)胞外，還檢測到CLEC12A^hi前嗜堿性粒細(xì)胞（圖5a），這與未感染或PBS注射對照小鼠中前嗜堿性粒細(xì)胞主要存在于骨髓中的觀察結(jié)果相反（圖2a）。從Nb感染的肺部分離的前嗜堿性粒細(xì)胞顯示出比成熟嗜堿性粒細(xì)胞更高的體外EdU摻入（圖5b），這表明前嗜堿性粒細(xì)胞即使在骨髓之外仍保持著較高的增殖能力。此外，在感染的肺部積累的前嗜堿性粒細(xì)胞與成熟嗜堿性粒細(xì)胞的IL-4表達(dá)相當(dāng)，這暗示它們可能對Nb感染的Th2免疫起到貢獻(xiàn)作用（圖5c）。
     我們以前曾證明在二次Nb感染中，嗜堿性粒細(xì)胞滲入受感染的皮膚，并將蠕蟲困在皮膚內(nèi)，以防止感染進(jìn)一步傳播到肺部和腸道。在第二次NB感染的皮損中，除了CLEC12A^lo成熟的嗜堿性粒細(xì)胞外，還檢測到了前嗜堿性粒細(xì)胞（圖5d）。從骨髓和第二次感染的皮膚中分離的CD200R3⁺ cKit^-細(xì)胞的單細(xì)胞RNA測序分析鑒定了9個(gè)聚類，其中聚類0、1和2對應(yīng)于Cd200r3⁺ Mcpt8⁺嗜堿性粒細(xì)胞。在這三個(gè)嗜堿性粒細(xì)胞聚類中，我們在兩個(gè)器官中都檢測到一個(gè)Clec12a^hi前嗜堿性粒細(xì)胞聚類和兩個(gè)Clec12a^lo成熟嗜堿性粒細(xì)胞聚類（圖5e，f）。對來自Nb感染和未感染小鼠的嗜堿性粒細(xì)胞的單細(xì)胞RNA測序數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析發(fā)現(xiàn)，在Nb感染小鼠的皮膚中檢測到的前嗜堿性粒細(xì)胞的基因表達(dá)譜與未感染小鼠骨髓中的前嗜堿性粒細(xì)胞非常接近，包括Fcer1a，Clec12a，Mcpt8和Prss34的上調(diào)表達(dá)（圖5f）。此外，基因集富集分析（GSEA）和GO富集分析發(fā)現(xiàn)，在Nb感染的皮膚中，前嗜堿性粒細(xì)胞富集了與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因，包括“染色體分離”（圖5g），這表明前嗜堿性粒細(xì)胞在感染的皮膚中保持著其高增殖能力，在感染的肺部觀察到的結(jié)果也一樣。

圖5|蠕蟲感染期間外周組織中可檢測到前嗜堿性粒細(xì)胞

7、前嗜堿性粒細(xì)胞中IL-3介導(dǎo)的CXCR4下調(diào)促進(jìn)其從骨髓中排出

     接下來，我們試圖闡明在Nb感染期間前嗜堿性粒細(xì)胞在外周組織中可能出現(xiàn)的機(jī)制。
     先前已經(jīng)證明Nb感染能夠引起全身性的IL-3上調(diào)，因此我們研究了IL-3對骨髓外出現(xiàn)的前嗜堿性粒細(xì)胞的可能貢獻(xiàn)。在小鼠體內(nèi)腹腔注射IL-3復(fù)合物（重組IL-3與單克隆抗IL-3抗體混合）后，外周血中出現(xiàn)CLEC12A^hi的前嗜堿性粒細(xì)胞（圖. 6a）。我們推測IL-3誘導(dǎo)了前嗜堿性粒細(xì)胞從骨髓中外流。為了驗(yàn)證這一可能性，我們對IL-3和PBS對照處理的BMBAs進(jìn)行了批量RNA測序分析，并鑒定了兩者之間的差異表達(dá)基因（DEGs）。我們特別注意到Cxcr4基因的表達(dá)在IL-3刺激下顯著降低（圖. 6b），因?yàn)镃XCR4已被證明是一種重要的趨化因子受體，對免疫細(xì)胞在骨髓中的滯留起作用。骨髓細(xì)胞的單細(xì)胞RNA測序和流式細(xì)胞分析顯示，在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平上，CXCR4在前嗜堿性粒細(xì)胞中的表達(dá)高于成熟嗜堿性粒細(xì)胞（圖. 6c），而IL-3刺激能夠降低CLEC12A^lo成熟嗜堿性粒細(xì)胞和CLEC12A^hi前嗜堿性粒細(xì)胞表面CXCR4的表達(dá)（圖. 6d）。這些結(jié)果表明，由于CXCR4的高表達(dá)，前嗜堿性粒細(xì)胞留在骨髓中，而IL-3介導(dǎo)的CXCR4下調(diào)可能促進(jìn)前嗜堿性粒細(xì)胞從骨髓中外出。根據(jù)這一假設(shè)，給小鼠腹腔注射一種CXCR4抑制劑AMD3100，可導(dǎo)致外周血和脾中出現(xiàn)CLEC12A^hi前嗜堿性粒細(xì)胞（圖. 6e）。因此，因此，在骨髓的前嗜堿性粒細(xì)胞中，IL-3介導(dǎo)的CXCR4的下調(diào)至少部分地解釋了前嗜堿性粒細(xì)胞從骨髓中流出，并在Nb感染期間它們出現(xiàn)在肺和皮膚中。

圖6|前嗜堿性粒細(xì)胞中IL-3介導(dǎo)的CXCR4下調(diào)促進(jìn)其從骨髓中排出

參考文獻(xiàn)：
Miyake, K., Ito, J., Nakabayashi, J. et al. Single cell transcriptomics clarifies the basophil differentiation trajectory and identifies pre-嗜堿性粒細(xì)胞 upstream of mature 嗜堿性粒細(xì)胞. Nat Commun 14, 2694 (2023).https://doi.org/10.1038/s41467-023-38356-1