靶向黑色素瘤相關(guān)抗原硫酸軟骨素蛋白多糖4的IgE抗體的抗癌促炎作用

       免疫組織化學(xué)，免疫熒光，流式細(xì)胞術(shù)，轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

       腫瘤相關(guān)抗原硫酸軟骨素蛋白多糖4（CSPG4）是一種高度糖基化的跨膜蛋白聚糖。盡管在一些正常組織中中報(bào)道了CSPG4表達(dá)，CSPG4在幾種實(shí)體瘤中過(guò)表達(dá)，包括惡性黑色素瘤、乳腺癌亞群、間皮瘤和神經(jīng)母細(xì)胞瘤。因此CSPG4被認(rèn)為是癌癥靶向免疫療法的有希望的靶標(biāo)。幾種CSPG4靶向療法已在臨床前和臨床研究中進(jìn)行了評(píng)估，顯示初步療效和良好的安全性。盡管檢查點(diǎn)抑制劑抗體免疫療法的批準(zhǔn)取得了實(shí)質(zhì)性進(jìn)展，但晚期疾病的 5 年生存率仍然很低（< 55%）。許多患者的腫瘤對(duì)現(xiàn)有的免疫和靶向治療沒(méi)有反應(yīng)，或者獲得性耐藥性迅速發(fā)展。因此，針對(duì)黑色素瘤相關(guān)抗原（如CSPG4）的免疫療法可以有效地引導(dǎo)免疫細(xì)胞對(duì)抗癌癥并解決重大未滿足的需求。靶向黑色素瘤相關(guān)抗原的 IgE 類抗體尚未得到評(píng)估。該研究發(fā)表于《Nature Communications》，IF：17.694。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：
1. CSPG4在惡性黑色素瘤組織中的過(guò)表達(dá)，以及CSPG4 IgE的工程和表征
       公開(kāi)數(shù)據(jù)集的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析證實(shí)，在幾種腫瘤細(xì)胞系（每種癌癥類型n = 4-8）和人類癌癥組織（每種癌癥類型n = 127-102）中，與其他腫瘤類型相比，黑色素瘤中CSPG1075基因表達(dá)水平顯著更高（圖1a，b），以及皮膚黑色素瘤（n = 461）與正常皮膚（n = 558）組織相比（圖1c）。此外，在原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性疾?。ㄆつw、內(nèi)臟和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）中測(cè)量CSPG4基因表達(dá)（圖1d，左，n = 36-208），以及黑色素瘤的所有階段（圖1d，右）。使用小鼠抗人CSPG4抗體（通過(guò)堿性磷酸酶（AP，粉紅色）檢測(cè)）在人黑色素瘤中的免疫組織化學(xué)（IHC）評(píng)估（n = 428，圖1e），和幾個(gè)正常組織（n = 389）表明在4%的惡性黑色素瘤中可檢測(cè)到CSPG63蛋白表達(dá)（n = 428，圖1l）。

圖1 CSPG4在惡性黑色素瘤和正常組織中的表達(dá)

       先前已經(jīng)報(bào)道了同類首創(chuàng)的MOv18 IgE的抗腫瘤功能，并指出IgE參與腫瘤微環(huán)境（TME）中表達(dá)Fcε受體的免疫效應(yīng)細(xì)胞（如單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞）的參與和重編程。作者從CSPG4特異性克隆中生成了具有人IgE恒定結(jié)構(gòu)域和小鼠可變區(qū)域的單克隆抗體（圖2a）。親和純化的CSPG4 IgE顯示出與MOv18（FRαIgE）相當(dāng)?shù)纳镂锢硖匦?。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），在還原和非還原條件下，以及體積排阻高效液相色譜（SEC-HPLC）證實(shí)了亞基組成和分子量與等效IgE一致的單分散產(chǎn)物，純度通常高于95%（圖2b）。
       流式細(xì)胞術(shù)和IHC分析（圖2c-f）證明了CSPG4 IgE與已知表達(dá)人CSPG4的人黑色素瘤細(xì)胞系的劑量依賴性結(jié)合（A2058，A375，WM1366）。正如預(yù)期的那樣，作者沒(méi)有檢測(cè)到與IGROV1卵巢或SKBR3乳腺癌細(xì)胞的結(jié)合（圖2c）。與FRα IgE相比，CSPG4 IgE與表達(dá)FcεRI的大鼠嗜堿性白血病細(xì)胞（RBL-SX38）結(jié)合（圖2c，右）。根據(jù)使用商業(yè)小鼠抗體克隆的IHC評(píng)估，CSPG4 IgE顯示所有惡性黑色素瘤的陽(yáng)性染色率為~70-75%（n = 468），當(dāng)分為皮膚病變，淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時(shí)（n = 302）。良性痣（n = 18）顯示CSPG4 IgE檢測(cè)到低/中等CSPG4表達(dá)（圖2d，e，左），CSPG4表達(dá)在黑色素瘤的所有階段都保持不變（圖2e，右）。與正常人體組織的結(jié)合（n = 297）為陰性或低，除了大腦、消化、內(nèi)分泌、眼睛和女性生殖組織，其中在一定比例的組織中觀察到低或中等CSPG4表達(dá)（圖2l）。
       因此，在惡性黑色素瘤中檢測(cè)到CSGP4表達(dá)，并且在正常組織中表現(xiàn)出低且有限的分布。嵌合CSPG4 IgE和小鼠抗人CSPG4克隆通過(guò)IHC顯示出與人體組織的相當(dāng)結(jié)合，并識(shí)別出表達(dá)CSPG4的黑色素瘤細(xì)胞。

圖2 CSPG4 IgE 的生成、生物物理表征和癌癥特異性

2. CSPG4 IgE可發(fā)揮體外抗腫瘤功能

       接下來(lái)，作者評(píng)估了CSPG4 IgE的潛在抗腫瘤功能。作者分析了CSPG4在人黑色素瘤細(xì)胞系（A375，A2058，WM1366，WM115，WM1361，G361和SKMEL28）中與未知表達(dá)CSPG4的細(xì)胞（IGROV1卵巢和SKBR3乳腺癌細(xì)胞以及原代非惡性黑色素細(xì)胞）中的相對(duì)表達(dá)（圖3a）。
       此前有報(bào)道稱，CSPG4及其下游信號(hào)通路在黑色素瘤細(xì)胞中的高表達(dá)可能有助于腫瘤進(jìn)展1,35.由于Fab介導(dǎo)和Fc介導(dǎo)的針對(duì)腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤IgE抗體的效應(yīng)功能可能會(huì)限制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，作者研究了CSPG4 IgE是否會(huì)在體外損害癌細(xì)胞功能。首先，作者研究了在沒(méi)有交聯(lián)或效應(yīng)細(xì)胞的情況下，作者的抗體對(duì)癌細(xì)胞功能的Fab介導(dǎo)的直接影響。與非特異性同種型對(duì)照相比，CSPG375 IgE部分抑制了A4細(xì)胞粘附，遷移和侵襲（圖3b）。此外，CSPG4 IgE通過(guò)其Fc結(jié)構(gòu)域與RBL-SX38細(xì)胞結(jié)合并通過(guò)多克隆抗IgE交聯(lián)可以觸發(fā)細(xì)胞脫顆粒（通過(guò)β-己糖胺酶釋放測(cè)量），類似于陽(yáng)性對(duì)照交聯(lián)半抗原特異性（NIP）IgE。在存在高CSPG4表達(dá)的A4和A375黑色素瘤細(xì)胞的情況下，CSPG2058 IgE比非特異性同種型對(duì)照NIP IgE引發(fā)的脫顆粒明顯更大（圖3c）。
       CSPG4 IgE 通過(guò)健康志愿者和黑色素瘤患者來(lái)源的外周血單核細(xì)胞 （PBMC） 觸發(fā)了高于同種型對(duì)照 IgE 的 A2058 和 A375 黑色素瘤細(xì)胞的顯著抗體依賴性細(xì)胞毒性 （ADCC）（圖3d，分別為左和右）和人單核細(xì)胞U937細(xì)胞（圖3e）。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)CSPG4與原代人單核細(xì)胞上未占用的Fc?受體I（Fc?RI）結(jié)合（圖3l，左）。CSPG4 IgE 介導(dǎo)的 A375 和 A2058 黑色素瘤細(xì)胞的 ADCC 由來(lái)自兩個(gè)健康參與者的單核細(xì)胞觸發(fā)（圖3l，右）和黑色素瘤患者（圖3g）?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)表明ADCC功能依賴于靶細(xì)胞的抗原表達(dá)。
       與非特異性IgE相比，CSGP4 IgE對(duì)黑色素瘤細(xì)胞具有直接影響，并利用人類健康志愿者和黑色素瘤患者來(lái)源的效應(yīng)細(xì)胞觸發(fā)體外效應(yīng)器功能，腫瘤細(xì)胞細(xì)胞毒性和脫顆粒。

圖3 CSPG4 IgE體外的抗腫瘤和Fc介導(dǎo)的效應(yīng)功能

3. CSPG4 IgE 介導(dǎo)的人單核細(xì)胞上清液中免疫介質(zhì)的上調(diào)和單核細(xì)胞中促炎細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)顯著增加
       先前的研究表明，IgE刺激免疫效應(yīng)細(xì)胞（如卵巢癌患者單核細(xì)胞）可能會(huì)增強(qiáng)促炎信號(hào)。在這里，作者旨在評(píng)估CSPG4 IgE和黑色素瘤的這些功能。在健康的志愿者和黑色素瘤患者中，作者調(diào)查了血液；IgE 滴度（分別為 n = 38 和 n = 13）和 PBMC 內(nèi)單核細(xì)胞的總體比例（分別為 n = 25 和 n = 44）和表達(dá)高親和力 IgE Fc 受體 Fc?RI 的單核細(xì)胞的比例（分別為 n = 25 和 n = 46）。作者發(fā)現(xiàn)這些參數(shù)中的任何一個(gè)都沒(méi)有顯著差異（圖4a，左三張圖）。同樣，在評(píng)估健康志愿者和黑色素瘤患者血清中的趨化因子和細(xì)胞因子譜時(shí)，TNF，IL-10，IL-1β，IL-4，GM-CSF，IL-13，M-CSF，VEGF，PDGFA和TGFβ2中沒(méi)有顯著差異，而黑色素瘤隊(duì)列中的TGFβ1水平顯著更高（圖4a，右圖）。
Fc?RI結(jié)合的CSPG4 IgE與多克隆抗IgE交聯(lián)以模擬人單核細(xì)胞U937細(xì)胞表面的免疫復(fù)合物形成，導(dǎo)致TNF上調(diào)（圖4b），與先前的發(fā)現(xiàn)一致。隨后，在用CSPG4 IgE刺激的人單核細(xì)胞的上清液中（圖4c），與單獨(dú)給予IgE的細(xì)胞相比，當(dāng)CSPG1 IgE交聯(lián)時(shí)，作者檢測(cè)到分泌的TNF，IL-6β，IL-2和CCL-1 / MCP-4顯著增加，而IL-4和IL-23滴度沒(méi)有觀察到顯著差異。單核細(xì)胞表面標(biāo)志物的流式細(xì)胞術(shù)分析（圖4d）表明，與單獨(dú)給予IgE的細(xì)胞相比，IgE交聯(lián)導(dǎo)致共刺激和活化分子CD80，CD86，PD-L1，CD40和HLA-DR的表達(dá)顯著增加，并且清除受體CD163和CCR2的表達(dá)降低。與非特異性IgE對(duì)照共培養(yǎng)物相比，在與表達(dá)CSPG4的A4癌細(xì)胞共培養(yǎng)物中，以抗原特異性方式與原代單核細(xì)胞結(jié)合的CSPG2058 IgE的交聯(lián)也引發(fā)了TNF，CCL-2 / MCP-1，IL-10和IL-6的分泌顯著增加，但I(xiàn)L-4和IL-23的分泌沒(méi)有增加（圖4e）。
       人單核細(xì)胞表面CSPG4 IgE的交聯(lián)顯著增加了促炎細(xì)胞因子和共刺激細(xì)胞表面標(biāo)志物的產(chǎn)生和表達(dá)。

圖4 人單核細(xì)胞表面CSPG4 IgE的交聯(lián)促進(jìn)促炎細(xì)胞因子的分泌并增強(qiáng)共刺激細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)

4. CSPG4 IgE 限制體內(nèi)黑色素瘤腫瘤生長(zhǎng)
       作者研究了CSGP4 IgE是否可以限制免疫缺陷（NOD / scid / IL-2R γ-/?）小鼠體內(nèi)人類黑色素瘤的生長(zhǎng)。由于人IgE不與表達(dá)FcεR的小鼠免疫細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)，因此將小鼠移植健康志愿外周血免疫細(xì)胞，并用A375黑色素瘤細(xì)胞皮下攻擊（圖5a）。30天后切除的腫瘤保留CSPG4表達(dá)（圖5b）。與IgE同種型對(duì)照和相應(yīng)的CSPG4 IgG治療相比，每隔4天或7天給予CSPG14 IgE顯著限制了小鼠皮下人黑色素瘤異種移植物的生長(zhǎng)（圖5c）。
與先前抗FRα IgE的體內(nèi)評(píng)估一致11,13，切除腫瘤的免疫組織化學(xué)分析顯示，與給予同種型對(duì)照IgE或CSPG45 IgG的小鼠腫瘤相比，用CSPG68 IgE治療的小鼠腫瘤中人CD4白細(xì)胞浸潤(rùn)，CD4巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)顯著更高（圖5d）。

圖5 CSPG4 IgE治療可以限制腫瘤生長(zhǎng)，并在移植有健康志愿免疫細(xì)胞的皮下A375體內(nèi)模型中誘導(dǎo)人免疫細(xì)胞浸潤(rùn)

       為了深入了解與IgE抗體治療效果相關(guān)的免疫途徑，對(duì)這些體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)檢索到的黑色素瘤樣品進(jìn)行了基因表達(dá)分析。與對(duì)照組相比，在CSPG4 IgE處理動(dòng)物的表達(dá)CSPG4的異種移植物中觀察到單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞基因特征的表達(dá)增強(qiáng)（圖6a）。根據(jù)倍數(shù)變化對(duì)Reactome內(nèi)基因集的富集進(jìn)行排名（圖6b）。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析揭示了IgE治療組中富集的幾種免疫信號(hào)通路，包括Fc?RI，TNF受體，干擾素，白細(xì)胞介素-1和-12，抗原呈遞相關(guān)通路和MHC I / II類呈遞（圖6c）。這些發(fā)現(xiàn)與單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的潛在活性以及促炎信號(hào)一致，包括TNF產(chǎn)生升高，這也與CSPG4 IgE刺激人單核細(xì)胞離體觀察到（圖4c，e），并在用CSPG4 IgE靜脈內(nèi)治療的小鼠的黑色素瘤異種移植物中浸潤(rùn)人免疫細(xì)胞（圖5d）。

圖6單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞特征，以及 Fc? 受體和促炎免疫途徑的激活，在體內(nèi)進(jìn)行 CSPG4 IgE 治療

       為了進(jìn)一步評(píng)估CSPG4 IgE在限制黑色素瘤傳播方面的作用，通過(guò)尾靜脈用A375黑色素瘤細(xì)胞攻擊移植了健康志愿者外周血免疫細(xì)胞的小鼠，導(dǎo)致肺部病變的形成。與對(duì)照組IgE相比，28天后切除的肺顯示每肺黑色素瘤病變數(shù)量顯著降低，并且CSPG4 IgE的肺部腫瘤占用百分比呈降低趨勢(shì)（圖7a）。為了評(píng)估CSPG4 IgE是否可以限制患者免疫細(xì)胞背景下黑色素瘤的生長(zhǎng)，移植黑色素瘤患者來(lái)源免疫細(xì)胞的小鼠接受了皮下A375人黑色素瘤的挑戰(zhàn)。與無(wú)抗體或非特異性同種型IgE對(duì)照組相比，靜脈注射CSPG29 IgE治療的小鼠黑色素瘤異種移植重量（腫瘤激發(fā)后4天）顯著降低（圖7b，左）。同樣，與PBS和同種型對(duì)照IgE組相比，用CSPG4 IgE治療的小鼠的腫瘤生長(zhǎng)受到顯著限制（圖7b，右）。在PBS和同種型對(duì)照IgE處理的動(dòng)物之間測(cè)量腫瘤重量或腫瘤體積沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異（圖7b）。此外，為了研究CSPG4 IgE限制患者來(lái)源黑色素瘤生長(zhǎng)的潛力，小鼠移植了來(lái)自兩個(gè)III期和IV期皮膚黑色素瘤轉(zhuǎn)移個(gè)體的患者來(lái)源的皮膚黑色素瘤腫瘤異種移植物（PDX），并移植了來(lái)自同一患者的自體外周血淋巴細(xì)胞（PBL）。與對(duì)照組相比，每周靜脈注射CSPG4 IgE治療與顯著延長(zhǎng)的生存期相關(guān)（圖7c）。
       因此，在移植有健康志愿者或黑色素瘤患者免疫細(xì)胞的免疫缺陷小鼠和用自體患者免疫細(xì)胞重組的PDX小鼠中，不同的體內(nèi)黑色素瘤模型與對(duì)照組相比，CSPG4 IgE與顯著的腫瘤生長(zhǎng)限制或生存率提高有關(guān)。CSPG4 IgE在體內(nèi)的療效與腫瘤中CD68巨噬細(xì)胞的顯著浸潤(rùn)以及轉(zhuǎn)錄組水平上Fc?受體和幾種促炎免疫途徑的顯著激活有關(guān)。

圖7 CSPG4 IgE在A375和PDX腫瘤模型中的療效

5. 對(duì)CSPG4 IgE的潛在I型超敏反應(yīng)的體外和離體評(píng)估
       為了初步了解與IgE相關(guān)的I型超敏反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)，作者詢問(wèn)了CSPG4 IgE是否可以增強(qiáng)患者來(lái)源的循環(huán)嗜堿性粒細(xì)胞的脫顆粒作用。首先，在RBL-SX4脫顆粒模型中測(cè)試了CSPG38 IgE在存在健康和患者血清的情況下觸發(fā)脫顆粒的潛力。雖然NIP IgE（陽(yáng)性對(duì)照）通過(guò)其特異性多聚體抗原（NIP-BSA）的交聯(lián)引發(fā)了顯著的脫顆粒，但與來(lái)自健康志愿者（n = 4）和黑色素瘤患者（n = 16）的血清一起與CSPG15 IgE孵育時(shí)，背景以上沒(méi)有引發(fā)脫顆粒（圖8a）。此外，使用嗜堿性粒細(xì)胞活化試驗(yàn)（BAT）在黑色素瘤患者的全普通血液中研究了IgE離體對(duì)原代人嗜堿性粒細(xì)胞的潛在活化（圖8b-d）。該測(cè)定用于測(cè)試對(duì)藥物和過(guò)敏原過(guò)敏的可能性。用已知的嗜堿性粒細(xì)胞活化刺激孵育患者血液;非IgE介導(dǎo)的fMLP，IgE介導(dǎo)的抗FcεRI和抗IgE，以及NIP IgE與NIP-BSA一起觸發(fā)SSC的激活低CCR3高嗜堿性粒細(xì)胞（通過(guò)增加CD63細(xì)胞表面表達(dá)來(lái)測(cè)量）（圖8c）。CSGP4 IgE和非CSPG4對(duì)照IgE在黑色素瘤患者的全血樣本中離體孵育時(shí)都不會(huì)觸發(fā)嗜堿性粒細(xì)胞活化（n = 15）（圖8d）。
       CSPG4 IgE在存在患者血清的情況下未誘導(dǎo)RBL-SX38細(xì)胞脫顆粒，并且未激活黑色素瘤患者全血中的嗜堿性粒細(xì)胞。這些發(fā)現(xiàn)為患者血清和血液中缺乏CSPG4 IgE離體嗜堿性粒細(xì)胞活化的早期信號(hào)提供了初步指示。

圖8 CSPG4 IgE 在患者或健康參與者存在人血清的情況下不介導(dǎo) RBL-SX38 細(xì)胞脫顆粒，也不會(huì)觸發(fā)癌癥患者離體血液中的嗜堿性粒細(xì)胞活化

結(jié)論：
       總之，該研究表明，CSPG4 IgE介導(dǎo)的抗腫瘤活性來(lái)自健康志愿者和黑色素瘤患者的免疫細(xì)胞對(duì)表達(dá)CSPG4的人黑色素瘤細(xì)胞。CSPG4 IgE治療限制了不同體內(nèi)模型中的腫瘤生長(zhǎng)或生存率的提高，無(wú)論腫瘤部位如何，并且植入健康志愿者或患者的免疫細(xì)胞。作者還證明CSPG4 IgE增加了巨噬細(xì)胞腫瘤浸潤(rùn)，并與幾種促炎免疫途徑的激活有關(guān)。這些細(xì)胞和促炎信號(hào)傳導(dǎo)先前已在臨床前被描述為對(duì)IgE療法的穩(wěn)健抗腫瘤活性很重要。最后，離體BAT提供了對(duì)CSPG4 IgE不存在I型超敏反應(yīng)的初步證據(jù)，盡管其在臨床環(huán)境中的應(yīng)用尚未確定。這些有希望的發(fā)現(xiàn)可能對(duì)治療不同的實(shí)體瘤具有深遠(yuǎn)的益處，特別是那些缺乏批準(zhǔn)的癌癥靶向抗體療法的實(shí)體瘤。

示意圖：

參考文獻(xiàn)：
Chauhan J, Grandits M, Palhares LCGF, et al. Anti-cancer pro-inflammatory effects of an IgE antibody targeting the melanoma-associated antigen chondroitin sulfate proteoglycan 4. Nat Commun. 2023 Apr 25;14(1):2192.