LINC00240通過(guò)USP10介導(dǎo)的DDX21穩(wěn)定促進(jìn)胃癌進(jìn)展

實(shí)驗(yàn)方法：RT?qPCR，細(xì)胞增殖和集落形成分析，異種移植研究，傷口愈合，transwell，RNA pulldown，RNA?IP，Western blot，泛素化分析。

       胃癌仍然是世界上癌癥死亡的主要原因。從全基因組關(guān)聯(lián)研究鑒定的胃癌風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄的lncRNAs是癌癥發(fā)生和疾病進(jìn)展的關(guān)鍵模式。然而，lncRNA在大多數(shù)癌癥風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)的生物學(xué)意義仍然知之甚少。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)了來(lái)自6p22.1胃癌風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)的LINC00240，它是一種新的致癌基因。胃癌標(biāo)本中LINC00240的表達(dá)明顯高于正常組織，其高表達(dá)水平與患者生存率差相關(guān)。LINC00240在體外和體內(nèi)均能促進(jìn)胃癌細(xì)胞的惡性增殖、遷移和轉(zhuǎn)移。重要的是，LINC00240可以通過(guò)其新型去泛素化酶USP10消除癌蛋白DDX21的泛素化，穩(wěn)定DDX21，從而促進(jìn)胃癌的進(jìn)展。綜上所述，我們的數(shù)據(jù)揭示了lncRNAs如何通過(guò)加強(qiáng)靶蛋白與其去泛素酶之間的相互作用來(lái)控制蛋白去泛素化的新范例。這些發(fā)現(xiàn)突出了lncRNA作為創(chuàng)新治療靶點(diǎn)的潛力，從而為臨床轉(zhuǎn)化奠定了基礎(chǔ)。本文于2023年4月發(fā)表于“Journal of Experimental & Clinical Cancer Research”（IF=12.658）上。

技術(shù)路線

結(jié)果：
1）胃癌組織中LINC00240表達(dá)升高與患者生存時(shí)間縮短相關(guān)
       為了檢驗(yàn)染色體6p22.1風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄的lncRNA是否促進(jìn)胃癌的發(fā)展，我們首先在Discovery隊(duì)列配對(duì)的胃癌標(biāo)本和正常組織中測(cè)定了三種候選lncRNA (LINC00240、LINC01012和ZNRD1AS1)的水平(圖1A)。我們發(fā)現(xiàn)只有LINC00240在惡性組織中較正常胃標(biāo)本表達(dá)明顯升高(圖1A)。我們發(fā)現(xiàn)驗(yàn)證隊(duì)列胃癌標(biāo)本中LINC00240水平顯著升高(圖1B)。為了支持這一觀點(diǎn)，與中國(guó)另一個(gè)胃癌隊(duì)列(GSE54129)的正常組織相比，癌標(biāo)本中LINC00240表達(dá)顯著升高。與早期疾病患者相比，晚期疾病患者中LINC00240的表達(dá)顯著升高(圖1D和E)。重要的是，LINC00240水平與無(wú)進(jìn)展生存期(PFS)和患者的總生存期(OS) 顯著相關(guān)(圖1F和G)。與LINC00240高表達(dá)的患者相比，LINC00240低表達(dá)的患者PFS或OS時(shí)間延長(zhǎng)(圖1F和G)，提示LINC00240可能作為一種新型癌基因參與了胃癌的進(jìn)展。

2）LINC00240在體外和體內(nèi)對(duì)胃癌細(xì)胞的惡性增殖有促進(jìn)作用
       接下來(lái)，我們?cè)隗w外和體內(nèi)研究了LINC00240在胃癌發(fā)展中的作用。在穩(wěn)定表達(dá)LINC00240 shRNAs的HGC-27和MGC80-3細(xì)胞中，lncRNA的表達(dá)顯著降低 (圖2A)。在穩(wěn)定表達(dá)LINC00240結(jié)構(gòu)的HGC-27和MGC80-3細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)LINC00240顯著過(guò)表達(dá) (圖2B)。如圖2C和2D所示，沉默LINC00240可顯著抑制HGC-27和MGC80-3細(xì)胞的增殖；而異位表達(dá)LINC00240可顯著提高胃癌細(xì)胞活力。同樣，下調(diào)LINC00240的表達(dá)抑制了HGC-27和MGC80-3細(xì)胞的克隆形成 (圖2E)。過(guò)表達(dá)LINC00240的胃癌細(xì)胞克隆原性增強(qiáng)(圖2F)。此外，沉默LINC00240可顯著促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡(圖2G)?？傊?，這些數(shù)據(jù)闡明了LINC00240在胃癌中的致癌功能。然后，我們通過(guò)胃癌異種移植評(píng)估了LINC00240在體內(nèi)的作用。與對(duì)照組相比，穩(wěn)定沉默LINC00240明顯抑制胃癌異種移植物的生長(zhǎng)(圖2H-J)。相反，穩(wěn)定過(guò)表達(dá)LINC00240的異種移植物生長(zhǎng)速度更快，腫瘤體積和腫瘤重量明顯高于對(duì)照異種移植物 (圖2K-M)。綜上所述，這些結(jié)果表明LINC00240在體內(nèi)能夠促進(jìn)胃癌的惡性增殖。

3）LINC00240提高胃癌細(xì)胞侵襲活性
       接下來(lái)，我們研究了LINC00240是否會(huì)影響胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲。我們進(jìn)行了傷口愈合實(shí)驗(yàn)，以確定LINC00240對(duì)胃癌細(xì)胞遷移的影響。穩(wěn)定的LINC00240-KD顯著損害胃癌HGC-27細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力，而穩(wěn)定的LINC00240-OE則加速胃癌HGC-27細(xì)胞的遷移能力。與此觀察結(jié)果一致，沉默LINC00240明顯減弱了胃癌MGC80-3細(xì)胞的遷移，強(qiáng)制表達(dá)的LINC00240促進(jìn)了MGC80-3細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力(圖3A)。侵襲實(shí)驗(yàn)表明，穩(wěn)定沉默的LINC00240可以減少胃癌細(xì)胞的侵襲。相反，異位表達(dá)LINC00240后，胃癌細(xì)胞的侵襲能力增強(qiáng)(圖3B)。然后，我們?cè)隗w內(nèi)研究了LINC00240是否可以調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。我們發(fā)現(xiàn)，LINC00240缺失抑制胃癌細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移；而穩(wěn)定過(guò)表達(dá)的LINC00240明顯促進(jìn)了胃癌肺轉(zhuǎn)移(圖3C)。HE染色和vimentin免疫組化進(jìn)一步證實(shí)了LINC00240在體內(nèi)對(duì)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響(圖3D和E)，這些結(jié)果表明LINC00240增強(qiáng)了胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

4）LINC00240在胃癌細(xì)胞中與癌蛋白DDX21相互作用
       為了探究LINC00240在胃腫瘤發(fā)生中的作用，我們首先檢測(cè)了LINC00240在胃癌細(xì)胞中的細(xì)胞定位。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)LINC00240主要位于胃癌細(xì)胞的細(xì)胞核中(圖4A)。為了測(cè)試LINC00240是否與胃癌中的某些蛋白質(zhì)相互作用，我們對(duì)由LINC00240拉下的MGC80-3細(xì)胞提取物進(jìn)行了RNA拉下試驗(yàn)和質(zhì)譜蛋白質(zhì)組學(xué)。在LINC00240下拉的蛋白中，我們通過(guò)獨(dú)立的RNA下拉和WB成功驗(yàn)證了DDX21是lncRNA的結(jié)合蛋白(圖4B)。RIP實(shí)驗(yàn)表明，與IgG對(duì)照相比，兩種胃癌細(xì)胞系中抗DDX21抗體沉淀的RNA-蛋白復(fù)合物中LINC00240明顯富集 (圖4C)。為了探索LINC00240與DDX21相互作用所需的特定區(qū)域或結(jié)構(gòu)域，我們構(gòu)建了各種截?cái)嗟腄DX21構(gòu)建體和截?cái)嗟腖INC00240質(zhì)粒(圖4D和E)。結(jié)果表明，DDX21蛋白的GUCT基序(aa 617-709)和LINC00240 RNA的中間區(qū)域(核苷酸357-674)是LINC00240與蛋白質(zhì)相互作用需要的(圖4D和E)。與正常組織相比，胃癌組織中DDX21的表達(dá)也顯著升高 (圖4F)。DDX21的異常高表達(dá)與胃癌患者的OS或PFS差相關(guān) (圖4G和H)。沉默DDX21可顯著抑制HGC-27或MGC80-3細(xì)胞的活力(圖4I-K)，表明DDX21在胃癌中的致癌性質(zhì)。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明，在胃癌細(xì)胞中，LINC00240可以通過(guò)GUCT基序與癌蛋白DDX21相互作用。

5）LINC00240通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑抑制DDX21的降解
       有趣的是，沉默LINC00240明顯抑制了DDX21蛋白在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)(圖5A)。相反，過(guò)表達(dá)的LINC00240在HGC27或MGC80-3細(xì)胞中顯著上調(diào)DDX21蛋白水平(圖5B)。與對(duì)照組相比，用MG132處理穩(wěn)定的LINC00240-KD胃癌細(xì)胞增加了內(nèi)源性DDX21蛋白的表達(dá)(圖5C和D)。MG132消除了LINC00240誘導(dǎo)的HGC-27或MGC80-3細(xì)胞中DDX21蛋白的上調(diào)(圖5E和F)，表明lncRNA可能參與調(diào)節(jié)DDX21的蛋白酶體降解。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，我們接下來(lái)用蛋白質(zhì)合成抑制劑CHX處理了HGC-27或MGC80-3細(xì)胞，檢測(cè)了DDX21的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定的LINC00240-KD細(xì)胞中DDX21蛋白水平的下降速度遠(yuǎn)快于對(duì)照細(xì)胞(圖5G)。相反，用CHX處理穩(wěn)定的LINC00240-OE胃癌細(xì)胞導(dǎo)致DDX21蛋白的半衰期明顯長(zhǎng)于對(duì)照細(xì)胞(圖5H)。我們隨后探索了依賴LINC00240的DDX21的降解是否通過(guò)其泛素化介導(dǎo)。與對(duì)照細(xì)胞相比，在穩(wěn)定的LINC00240-KD細(xì)胞中檢測(cè)到DDX21蛋白的泛素信號(hào)顯著增加(圖5I)。與對(duì)照細(xì)胞相比，穩(wěn)定的LINC00240-OE細(xì)胞中DDX21的泛素化明顯降低(圖5I)。拯救實(shí)驗(yàn)表明，沉默DDX21可顯著抑制穩(wěn)定過(guò)表達(dá)LINC00240的胃癌細(xì)胞的增殖(圖5J)。相反，過(guò)表達(dá)DDX21可增強(qiáng)穩(wěn)定敲低LINC00240的胃癌細(xì)胞的增殖(圖5K)。這些結(jié)果表明LINC00240通過(guò)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)穩(wěn)定DDX21蛋白。

6）LINC00240阻斷DDX21與其新型去泛素酶USP10的結(jié)合
       為了揭示LINC00240如何延緩DDX21的泛素蛋白酶體降解，我們分析了MGC80-3細(xì)胞中LINC00240下拉的蛋白。質(zhì)譜分析結(jié)果表明，該樣品中只有一種去泛素酶USP10。為了確認(rèn)USP10是否是DDX21的一種新型去泛素酶，我們首先檢測(cè)了USP10沉默表達(dá)的HGC-27或MGC80-3細(xì)胞中DDX21的水平(圖A)。在敲除USP10表達(dá)后，與對(duì)照細(xì)胞相比，胃癌細(xì)胞中DDX21蛋白水平明顯降低(圖6A)。Co-IP實(shí)驗(yàn)顯示，內(nèi)源性USP10可以在HGC-27或MGC80-3細(xì)胞中被DDX21沉淀(圖6B)。在兩種胃癌細(xì)胞系中，內(nèi)源性DDX21也可以被USP10沉淀(圖6C)。接下來(lái)，我們研究了LINC00240是否影響細(xì)胞中DDX21和USP10之間的相互作用。與對(duì)照細(xì)胞相比，穩(wěn)定的LINC00240-KD細(xì)胞中DDX21沉淀的USP10蛋白較少(圖6D和E)，而穩(wěn)定的LINC00240-OE細(xì)胞中DDX21沉淀的USP10蛋白較多(圖6D和G)。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明，LINC00240通過(guò)增強(qiáng)DDX21與其新型去泛素酶USP10的相互作用來(lái)促進(jìn)DDX21的穩(wěn)定(圖6H)。

結(jié)論：我們揭示了從6p22.1位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄的LINC00240在胃癌中的重要性，并發(fā)現(xiàn)了LINC00240和USP10之間在控制致癌蛋白DDX21泛素化中的一種新的調(diào)控伙伴關(guān)系。LINC00240-USP10-DDX21軸可能成為臨床上胃癌的潛在治療靶點(diǎn)。
參考文獻(xiàn)：Zhang N, Wang B, Ma C, Zeng J, Wang T, Han L, Yang M. LINC00240 in the 6p22.1 risk locus promotes gastric cancer progression through USP10-mediated DDX21 stabilization. J Exp Clin Cancer Res. 2023 Apr 18;42(1):89. doi: 10.1186/s13046-023-02654-9.