一種由circINSIG1編碼的新蛋白通過促進(jìn)結(jié)直腸癌中INSIG1的泛素依賴性降解來編碼膽固醇代謝
缺氧是實(shí)體腫瘤的一個(gè)標(biāo)志，并導(dǎo)致癌細(xì)胞的代謝重編程。在結(jié)腸直腸癌（CRC）中，表觀遺傳調(diào)控在缺氧和異常膽固醇代謝之間的作用尚不清楚。采用高通量RNA測序方法，在常氧和低氧培養(yǎng)的結(jié)直腸癌細(xì)胞中鑒定低氧反應(yīng)環(huán)狀RNA （circRNAs）并通過多體分析和LC-MS鑒定了circINSIG1的蛋白編碼潛能。circINSIG1的功能在體外和體內(nèi)通過功能增益或喪失試驗(yàn)得到驗(yàn)證并通過免疫沉淀分析得出機(jī)制結(jié)果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了一種新的低氧應(yīng)答環(huán)狀RNA circINSIG1，該環(huán)狀RNA在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)上調(diào)，并與晚期臨床分期和低生存率相關(guān)。機(jī)制上，circINSIG1編碼一個(gè)121個(gè)氨基酸的蛋白circINSIG1-121，通過募集CUL5-ASB6復(fù)合物（一種泛素E3連接酶復(fù)合物），促進(jìn)賴氨酸156和158處關(guān)鍵膽固醇代謝調(diào)節(jié)因子INSIG1的k48連鎖泛素化，從而誘導(dǎo)膽固醇生物合成，促進(jìn)結(jié)直腸癌的增殖和轉(zhuǎn)移。原位異種移植腫瘤模型和患者來源的異種移植模型進(jìn)一步確定了circINSIG1在CRC進(jìn)展中的作用和CRC的潛在治療靶點(diǎn)。circINSIG1具有表觀遺傳機(jī)制，為研究缺氧與膽固醇代謝之間的串?dāng)_提供了新的思路，為CRC的治療提供了一個(gè)有前景的靶點(diǎn)。本文于2023年4月發(fā)表在《Molecular Cancer》IF：41.444期刊。
技術(shù)路線：
主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
1、CRC中缺氧誘導(dǎo)的circINSIG1的特征及臨床意義
為了鑒定CRC中與缺氧相關(guān)的環(huán)狀RNA，作者對HCT8、HCT116和DLD1細(xì)胞在常氧或缺氧（1% O2, 48 h）培養(yǎng)下進(jìn)行了環(huán)狀RNA測序，結(jié)果顯示，這三種細(xì)胞系中有18個(gè)環(huán)狀RNA失調(diào)（圖1A）。接著，選擇在缺氧條件下具有相同趨勢的四個(gè)circRNA （（circNPHP4, circINSIG1, circGART 和 circZDHHC5）進(jìn)一步鑒定（圖1B）。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR （qRT-PCR）分析這些circRNAs在CoCl2誘導(dǎo)的細(xì)胞假性缺氧模型和32對CRC樣本中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，circINSIG1（hsa_circ_0133744）在CoCl2處理的CRC細(xì)胞系和CRC組織樣本中顯著上調(diào)（圖1C, S1A和S1B），因此選擇circINSIG1進(jìn)行進(jìn)一步研究。進(jìn)一步分析了85個(gè)配對CRC樣本中circINSIG1的表達(dá)水平，證實(shí)了circINSIG1在CRC中表達(dá)上調(diào)（圖1D）。結(jié)果表明，circINSIG1在晚期T期或臨床分期患者中表達(dá)更高（圖1E - F）。
circINSIG1是胰島素誘導(dǎo)基因1 （INSIG1）的外顯子3和4與292nt反向剪接而形成的（圖1G）。Sanger測序與之吻合，驗(yàn)證了circINSIG1的反向剪接連接（圖1H）。作者采用發(fā)散引物和收斂引物分別檢測互補(bǔ)DNA （cDNA）和基因組DNA （gDNA）中的circINSIG1和INSIG1的線性轉(zhuǎn)錄本，結(jié)果表明，circINSIG1只能通過不同的引物在cDNA中擴(kuò)增（圖1I）。半衰期分析顯示circINSIG1比線性INSIG1 mRNA穩(wěn)定得多（圖1J）。此外，circINSIG1被觀察到抵抗RNase R的消化（圖1K）。核質(zhì)量分離實(shí)驗(yàn)和熒光原位雜交（FISH）實(shí)驗(yàn)表明，CRC細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中富集了circINSIG1（圖1L-M）。
作者通過原位雜交分析了大量CRC患者中circINSIG1的表達(dá)（n=227）。結(jié)果還證實(shí)，與配對的正常鄰近組織相比，CRC組織中circINSIG1的表達(dá)水平升高（圖1N）。隊(duì)列中circINSIG1的表達(dá)與CRC患者TNM分期、臨床分期等臨床病理特征顯著相關(guān)（p<0.05）。此外，Kaplan-Meier曲線顯示，高circINSIG1表達(dá)與CRC患者較差的生存率相關(guān)（圖1O）。綜上所述，這些結(jié)果表明了circINSIG1的循環(huán)性和臨床意義。
圖1 CRC中缺氧誘導(dǎo)的circINSIG1的特征及臨床意義
2、circINSIG1編碼121個(gè)氨基酸的與CRC的不良預(yù)后相關(guān)的新蛋白
為了確定circINSIG1的蛋白質(zhì)編碼潛力，作者首先分析了circRNADb數(shù)據(jù)庫中注釋的circINSIG1的開放閱讀框（ORF）和內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES）。結(jié)果顯示，circINSIG1序列中包含一個(gè)具有編碼121個(gè)氨基酸蛋白潛能的跨越連接ORF（以下簡稱circINSIG1-121）和一個(gè)位于207-292 nt的IRES（圖2A）。接著，作者進(jìn)行了基于蔗糖密度梯度離心的多體分析，細(xì)胞裂解液中的核糖體分為40和60 S核糖體亞基，以及單體（80 S）和多體（圖2B）。線性INSIG1 mRNA作為陽性對照，circCAMSAP1作為陰性對照，circCAMSAP1是作者在之前的研究中發(fā)現(xiàn)的不具有蛋白質(zhì)編碼能力的circRNA。、結(jié)果顯示circINSIG1可以在單體和多體中檢測到（圖2B）。此外，通過雙熒光素酶測定驗(yàn)證了IRES驅(qū)動(dòng)ORF翻譯的活性（圖S2A和S2B）。由于在第一輪讀取中缺少終止密碼子，circINSIG1-121在第二輪翻譯中由自然移碼形成的C端有一條獨(dú)特的20個(gè)氨基酸的尾巴（圖2A）。接著制備了一種針對尾20個(gè)氨基酸序列的單克隆抗體，用于檢測circINSIG1-121的表達(dá)。構(gòu)建circINSIG1-flag載體，轉(zhuǎn)染CRC細(xì)胞，結(jié)果顯示，F(xiàn)lag抗體在轉(zhuǎn)染circINSIG1-flag載體的細(xì)胞中檢測到14KD條帶，而在轉(zhuǎn)染對照載體的細(xì)胞中未檢測到（圖2C，左）。circINSIG1-121抗體證實(shí)了circINSIG1-121的內(nèi)源性存在（圖2C，右）。使用過表達(dá)circINSIG1的CRC細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)譜分析和SDS-PAGE進(jìn)一步驗(yàn)證了circINSIG1-121蛋白的特異性肽片段與預(yù)測的分子量（圖2D-E和S2C）。
接下來，分別通過免疫組化（IHC）和western blot分析20例和10例配對CRC樣本中circINSIG1-121和INSIG1的蛋白水平。結(jié)果顯示，circINSIG1-121在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)上調(diào)，而INSIG1蛋白水平在配對的正常鄰近組織和結(jié)直腸癌組織中無顯著差異（圖2F-G）。此外，通過免疫組化（IHC）在結(jié)直腸癌隊(duì)列中檢測了circINSIG1-121和INSIG1蛋白水平（n=227）。結(jié)果表明，高circINSIG1-121表達(dá)與CRC患者較差的生存率相關(guān)（圖2H）。而在本研究結(jié)果中或TCGA數(shù)據(jù)庫中，INSIG1的線性表達(dá)水平與CRC患者的生存率沒有相關(guān)性（圖2I-J）?？傊@些數(shù)據(jù)證實(shí)circINSIG1編碼一種121個(gè)氨基酸的新蛋白，該蛋白與CRC的不良預(yù)后相關(guān)。
圖2 circINSIG1編碼121個(gè)氨基酸的與CRC的不良預(yù)后相關(guān)的新蛋白
3、circINSIG1-121促進(jìn)結(jié)直腸癌的增殖和轉(zhuǎn)移
為了闡明circINSIG1在糖尿病中的生物學(xué)功能，作者首先利用qRT-PCR分析了circINSIG1在正常人腸上皮細(xì)胞系和CRC細(xì)胞系中的表達(dá)。與此一致，circINSIG1在CRC細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)上調(diào)（圖S3A）。由于circINSIG1表達(dá)適中，作者選擇HCT8和DLD1 CRC細(xì)胞系進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)（圖S3A），生成穩(wěn)定過表達(dá)circINSIG1或circINSIG1-121的CRC細(xì)胞系（圖3A、B和S3B）。球體形成實(shí)驗(yàn)證實(shí)circINSIG1或circINSIG1-121增強(qiáng)CRC細(xì)胞增殖（圖3C）。接著在CRC患者源性類器官（PDOs）中過表達(dá)circINSIG1或circINSIG1-121，結(jié)果也表明circINSIG1或circINSIG1-121促進(jìn)了PDOs的生長（圖3D）。同樣，circINSIG1或circINSIG1-121的過表達(dá)促進(jìn)了CRC細(xì)胞的遷移和侵襲（圖3E和S3C）。作者用兩個(gè)短發(fā)夾RNA敲低了circINSIG1特異性靶向HCT8和DLD1細(xì)胞中circINSIG1的后剪接連接的shRNAs（圖S3D和S3E）。正如預(yù)期的那樣，敲低circINSIG1或circINSIG1-121顯著抑制CRC細(xì)胞的生長、遷移和侵襲（圖3F-H和S3F）。此外，構(gòu)建一個(gè)帶有起始密碼子的突變circINSIG1載體（circINSIG1-ATGmut）。過表達(dá)circINSIG1- atgmut不能增強(qiáng)CRC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲（圖S3G-S3I），提示circINSIG1通過編碼circINSIG1-121而不是circINSIG1的環(huán)狀RNA形式促進(jìn)CRC細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。
接下來，使用原位異種移植腫瘤模型確定circINSIG1-121在CRC進(jìn)展中的體內(nèi)功能。結(jié)果證實(shí)過表達(dá)circINSIG1或circINSIG1-121可顯著促進(jìn)腫瘤生長（圖3I-J）。對人的分析小鼠肝臟中HPRT mRNA的表達(dá)證實(shí)了circINSIG1或circINSIG1-121可導(dǎo)致肝轉(zhuǎn)移的腫瘤負(fù)荷顯著增加（圖3 K）。這些結(jié)果證明了circINSIG1-121在促進(jìn)結(jié)直腸癌增殖和轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵作用。
圖3 circINSIG1-121促進(jìn)結(jié)直腸癌的增殖和轉(zhuǎn)移
4、circINSIG1-121通過與INSIG1相互作用促進(jìn)INSIG1不依賴于泛素的降解并誘導(dǎo)膽固醇的生物合成
為了確定circINSIG1-121促進(jìn)CRC進(jìn)展的分子機(jī)制，作者分析了circINSIG1或circINSIG1-121過表達(dá)的HCT8和DLD1細(xì)胞中INSIG1的RNA和蛋白水平。有趣的是，INSIG1的RNA水平隨著circINSIG1或circINSIG1-121的過表達(dá)而升高，而INSIG1的蛋白水平則降低（圖4A、B和S4A）。隨即通過免疫熒光觀察到circINSIG1-121和INSIG1在CRC細(xì)胞中的共定位（圖4C）。免疫沉淀（IP）實(shí)驗(yàn)證實(shí)circINSIG1-121與INSIG1相互作用（圖4D）。有報(bào)道稱，INSIG1的磷酸化促進(jìn)了INSIG1蛋白的降解。因此，作者首先分析了并發(fā)現(xiàn)INSIG1的表達(dá)磷酸化INSIG1 （p-INSIG1）不因circINSIG1或circINSIG1-121過表達(dá)而升高（圖S4B）。這些結(jié)果表明circINSIG1或circINSIG1-121可能不會(huì)通過影響其磷酸化水平來調(diào)節(jié)INSIG1的降解。由于泛素-蛋白酶體和自噬-溶酶體途徑是真核細(xì)胞中蛋白質(zhì)清除的兩個(gè)主要系統(tǒng)，作者用蛋白酶體抑制劑MG132或自噬-隔離抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA）處理CRC細(xì)胞，以進(jìn)一步研究circINSIG1-121介導(dǎo)的INSIG1降解的分子機(jī)制。我們觀察到MG132而不是3-MA提高了INSIG1的蛋白水平，并且在circINSIG1或circINSIG1-121過表達(dá)的CRC細(xì)胞中，INSIG1的泛素化水平升高，表明circINSIG1-121通過泛素-蛋白酶體途徑促進(jìn)了INSIG1的降解（圖4E-F）。
固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（SREBPs）在哺乳動(dòng)物膽固醇和脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用。INSIG蛋白與與SREBP和SREBP裂解激活蛋白（SCAP）復(fù)合物結(jié)合，將該復(fù)合物錨定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）中，以調(diào)節(jié)脂肪生成。此外，SREBP1負(fù)責(zé)脂肪酸合成和能量儲(chǔ)存，SREBP2負(fù)責(zé)膽固醇調(diào)節(jié)。因此，作者首先分析了全長SREBPs （fSREBPs）和活性核SREBPs （nSREBPs）的蛋白水平。Western blot分析顯示，在過表達(dá)circINSIG1或circINSIG1-121的CRC細(xì)胞中，nSREBP2顯著增加，但nSREBP1無顯著變化，提示circINSIG1-121可能促進(jìn)SREBP2激活，從而增強(qiáng)膽固醇的生物合成（圖4G）。此外，對SREBP1和SREBP2靶基因進(jìn)行分析，結(jié)果表明SREBP2靶基因表達(dá)水平升高，而SREBP1靶基因的表達(dá)無明顯變化。（圖4H和S4C）。與膽固醇生物合成基因的表達(dá)增強(qiáng)一致，與對照組相比，circINSIG1-121過表達(dá)增加了游離膽固醇含量（圖4I）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明circINSIG1-121促進(jìn)了INSIG1的泛素依賴性降解，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放SREBP2-SCAP復(fù)合物，隨后誘導(dǎo)膽固醇的生物合成。
為了確認(rèn)circINSIG1是否以INSIG1依賴的方式重編程膽固醇，進(jìn)行了體外拯救試驗(yàn)。如圖S4D-F所示，過表達(dá)circINSIG1可促進(jìn)CRC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，而過表達(dá)INSIG1可顯著拮抗這一作用。過表達(dá)circINSIG1增加了CRC細(xì)胞中SREBP2靶基因的表達(dá)水平和游離膽固醇的含量，但可以通過過表達(dá)INSIG1來下調(diào)（圖S4G和H）。這些數(shù)據(jù)表明，circINSIG1通過調(diào)節(jié)INSIG1的水平，至少在一定程度上重編程膽固醇代謝，促進(jìn)CRC的惡性進(jìn)展。
圖4 circINSIG1-121促進(jìn)INSIG1不依賴于泛素的降解并誘導(dǎo)膽固醇的生物合成
5、circINSIG1-121通過招募CUL5-ASB6復(fù)合體促進(jìn)與k48相關(guān)的INSIG1泛素化
泛素鏈?zhǔn)侵饕慕到庑盘?hào)，負(fù)責(zé)靶向不同類型的底物，不同種類的泛素鏈具有不同的生物學(xué)功能。為了確定導(dǎo)致INSIG1降解的泛素鏈類型，我們用不同的HA標(biāo)記的泛素鏈載體轉(zhuǎn)染CRC細(xì)胞。
研究結(jié)果顯示，INSIG1主要通過K48連鎖泛素化，而不與其他類型的泛素鏈泛素化（圖5A）。在circINSIG1-121過表達(dá)的細(xì)胞中，k48關(guān)聯(lián)的多泛素化作用增強(qiáng)（圖5B）。這些發(fā)現(xiàn)表明circINSIG1-121通過k48連鎖泛素化介導(dǎo)了INSIG1的降解。然后，作者試圖確定INSIG1的哪些賴氨酸殘基是導(dǎo)致INSIG1降解的主要泛素化位點(diǎn)，因此，在INSIG1蛋白中鑒定出5個(gè)保守賴氨酸（K）點(diǎn)（圖S5A），將5個(gè)相應(yīng)賴氨酸殘基分別突變?yōu)榫彼幔≧）的INSIG1突變體分別用于轉(zhuǎn)染的CRC細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生型組相比，轉(zhuǎn)染INSIG1 K156R和K158R組的INSIG1蛋白水平略有下降（圖5C-D）。為了進(jìn)一步證實(shí)INSIG1的這兩個(gè)泛素化位點(diǎn)，構(gòu)建了具有兩個(gè)賴氨酸點(diǎn)突變的INSIG1突變體。隨后的Western blot和免疫沉淀實(shí)驗(yàn)表明，該突變體顯著減弱了circINSIG1-121介導(dǎo)的INSIG1降解，且INSIG1的k48連鎖泛素化水平顯著低于野生型組（圖5E-G）。這些結(jié)果表明，circINSIG1-121促進(jìn)了INSIG1在K156和K158殘基上的k48連鎖泛素化。
由于circINSIG1-121不是E3連接酶，作者推斷circINSIG1-121可能作為適配器招募某些E3連接酶使INSIG1泛素化。因此用circINSIG1-121抗體進(jìn)行免疫沉淀試驗(yàn)，質(zhì)譜分析鑒定出ASB6的存在（圖S5B）。ASB6是一種底物識(shí)別適配器，可與Cullin5 （CUL5）相互作用形成CUL5-ASB6復(fù)合物，其功能為泛素E3連接酶復(fù)合物。進(jìn)一步的免疫沉淀實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了circINSIG1-121和CUL5-ASB6復(fù)合物之間的相互作用（圖5H-I）。作者發(fā)現(xiàn)蛋白酶體抑制劑MG132和Cullin-Ring E3連接酶活性抑制劑MLN4924導(dǎo)致內(nèi)源性INSIG1蛋白水平明顯升高（圖5J）。ASB6過表達(dá)增強(qiáng)了與k48相關(guān)的INSIG1泛素化，降低了INSIG1蛋白的豐度（圖5K）。相反，ASB6敲低增加了INSIG1蛋白的豐度，抑制了與k48相關(guān)的INSIG1泛素化（圖5K）。此外，ASB6的過表達(dá)促進(jìn)膽固醇的生物合成，反之亦然（圖5L）。因此，circINSIG1-121招募CUL5-ASB6復(fù)合物，促進(jìn)k48相關(guān)的INSIG1在K156和K158的泛素化。
圖5 circINSIG1-121促進(jìn)與k48相關(guān)的INSIG1泛素化分析
6、缺氧誘導(dǎo)的EIF4A3促進(jìn)circINSIG1的表達(dá)
作者接著探討了circINSIG1在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的上調(diào)機(jī)制。研究表明，RNA結(jié)合蛋白（RBP）通過結(jié)合環(huán)狀RNA的側(cè)翼內(nèi)含子區(qū)域參與環(huán)狀RNA的生物發(fā)生。在這里，CircInteractome（探索circRNA及其相互作用蛋白的工具）被用來尋找負(fù)責(zé)circINSIG1循環(huán)化的潛在RBP。在circINSIG1反剪接位點(diǎn)的上游和下游分別鑒定出4個(gè)和6個(gè)EIF4A3結(jié)合位點(diǎn)（圖6A和S6A）。EIF4A3是外顯子連接復(fù)合體的核心組分，在pre-mRNA剪接中發(fā)揮重要作用。然后，作者分析了TCGA數(shù)據(jù)庫中EIF4A3的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)EIF4A3在CRC中表達(dá)上調(diào)（圖S6B）。此外，EIF4A3的表達(dá)與缺氧標(biāo)志物HIF-1α的表達(dá)呈正相關(guān)（圖S6C）。Western blot和qRT-PCR檢測顯示，缺氧條件下EIF4A3蛋白表達(dá)上調(diào)，circINSIG1表達(dá)與EIF4A3表達(dá)呈正相關(guān)（圖6B-C）。為了驗(yàn)證EIF4A3與circINSIG1側(cè)翼序列結(jié)合的能力，進(jìn)行了RNA下拉試驗(yàn)。結(jié)果表明，EIF4A3可以與circINSIG1的下游側(cè)翼序列結(jié)合，但不是上游序列（圖6D和S6D）。然后，我們構(gòu)建了circINSIG1小基因，并進(jìn)行了RNA免疫沉淀（RIP）檢測。如圖6E所示，抗EIF4A3組中6個(gè)推測的EIF4A3結(jié)合位點(diǎn)的富集程度高于抗IgG組，而轉(zhuǎn)染circINSIG1 miniigene進(jìn)一步提高了富集程度，表明EIF4A3可以結(jié)合到側(cè)翼區(qū)域上這些推測的結(jié)合位點(diǎn)。我們進(jìn)一步構(gòu)建了穩(wěn)定過表達(dá)EIF4A3和一系列具有EIF4A3結(jié)合位點(diǎn)突變的circINSIG1小基因的CRC細(xì)胞系（圖S6E和6F）。值得注意的是，單個(gè)推定結(jié)合位點(diǎn)的突變對circINSIG1的表達(dá)幾乎沒有影響，而所有六個(gè)EIF4A3結(jié)合位點(diǎn)的突變大大減少了circINSIG1的形成（圖6G）。這些結(jié)果表明，這六個(gè)位于circINSIG1下游側(cè)翼區(qū)域的EIF4A3結(jié)合位點(diǎn)是EIF4A3介導(dǎo)的circINSIG1環(huán)狀化所必需的。此外，我們觀察到circINSIG1水平隨著EIF4A3過表達(dá)而升高，而通過敲低EIF4A3而降低（圖6H、I和S6F）。EIF4A3的過表達(dá)促進(jìn)了SREBP2靶基因的激活和膽固醇的生物合成，這可以通過沉默circINSIG1來部分減弱（圖6J-L）?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明缺氧誘導(dǎo)的EIF4A3促進(jìn)了circINSIG1的生物發(fā)生。
圖6缺氧誘導(dǎo)的EIF4A3促進(jìn)circINSIG1的表達(dá)
7、circINSIG1是CRC患者的潛在治療靶點(diǎn)
為了驗(yàn)證circINSIG1是否可以作為CRC的潛在治療靶點(diǎn)，我們分析了circINSIG1和circINSIG1-121在6種患者來源的異種移植（PDX）模型中的表達(dá)。作者選擇circINSIG1上調(diào)的PDX3和PDX6靶向circINSIG1檢測其治療效果（圖S7A和S7B）。結(jié)果顯示，shcircINSIG1慢病毒治療導(dǎo)致腫瘤生長明顯低于對照組（圖7A-B）。免疫組化分析顯示，shcircINSIG1慢病毒治療組的Ki67陽性細(xì)胞百分比明顯低于對照組（圖7C）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證circINSIG1在體內(nèi)的作用機(jī)制，作者評估了circINSIG1下游靶點(diǎn)的表達(dá)并檢測了這些腫瘤中的膽固醇含量。結(jié)果表明，敲低circINSIG1可降低circINSIG1-121的蛋白水平，抑制INSIG1介導(dǎo)的SREBP1信號(hào)傳導(dǎo)（圖7D-F）。此外，敲低circINSIG1的PDX腫瘤中游離膽固醇含量降低（圖7G）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明circINSIG1是CRC患者的一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。
圖7 circINSIG1作為CRC患者的潛在治療靶點(diǎn)分析
實(shí)驗(yàn)方法：
高通量RNA測序，RNase R消化實(shí)驗(yàn)，qRT-PCR，Western blot，RNA 干擾，過表達(dá)，C62H86N12O16測定實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)，熒光原位雜交（FISH），原位雜交（ISH），免疫組化（IHC），RNA pull-down，RNA免疫沉淀（RIP）。
參考文獻(xiàn)：
Xiong ZL, Liu HS, Zhou C, Yang X, Huang L , Jie HQ, Zeng ZW, Zheng XB, Li WX, Liu ZZ, Kang L, Liang ZX. A novel protein encoded by circINSIG1 reprograms cholesterol metabolism by promoting the ubiquitin-dependent degradation of INSIG1 in colorectal cancer. Molecular Cancer, 2023, April, 22(1):72.
https://doi.org/10.1186/s12943-023-01773-3.