CircZBTB44通過(guò)穩(wěn)定HK3 mRNA結(jié)構(gòu)促進(jìn)腎癌進(jìn)展

       CircZBTB44 （hsa_circ_0002484）已被確定在腎細(xì)胞癌（RCC）組織中表達(dá)上調(diào)，但其在RCC中的作用和貢獻(xiàn)尚不明確。作者證實(shí)了RCC細(xì)胞中circZBTB44的過(guò)度表達(dá)。在異種移植小鼠模型中，敲低CircZBTB44抑制了RCC細(xì)胞的活力、增殖和遷移，并抑制了腫瘤的發(fā)生。異質(zhì)核糖核蛋白C （HNRNPC）和胰島素樣生長(zhǎng)因子2 mRNA結(jié)合蛋白3 （IGF2BP3）是circZBTB44的兩種RNA結(jié)合蛋白。HNRNPC通過(guò)m6A修飾促進(jìn)circZBTB44從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)的易位，促進(jìn)了RCC細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中IGF2BP3和circZBTB44的相互作用。此外，circZBTB44通過(guò)與IGF2BP3結(jié)合，在RCC細(xì)胞中上調(diào)己糖激酶3 （HK3）的表達(dá)。HK3對(duì)RCC細(xì)胞的惡性行為和腫瘤生長(zhǎng)具有致瘤作用。在RCC細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)中，circZBTB44通過(guò)上調(diào)HK3促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2極化。綜上所述，HNRNPC介導(dǎo)circZBTB44與IGF2BP3相互作用上調(diào)HK3，在體外促進(jìn)RCC細(xì)胞的增殖和遷移，在體內(nèi)促進(jìn)腫瘤發(fā)生。本研究結(jié)果為RCC的靶向治療提供了新的思路。本文于2023年4月發(fā)表在《Molecular Cancer》IF：41.444期刊。

技術(shù)路線：

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
1、circZBTB44在RCC組織和細(xì)胞中的表達(dá)
       作者對(duì)GSE100186、GSE108735和GSE137836數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，CircZBTB44 （hsa_circ_0002484）在RCC腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)（圖1A）。隨后證實(shí)了circZBTB44在RCC細(xì)胞中的表達(dá)高于人腎近端小管上皮細(xì)胞（HK-2），特別是在A498和769-P細(xì)胞中（圖1B）。CircZBTB44 （chr11:130130750 - 130131824）位于第11號(hào)染色體上，與宿主基因ZBTB44外顯子2反向剪接（圖1C）。從PCR和電泳分析結(jié)果來(lái)看，circZBTB44僅在cDNA中擴(kuò)增，在gDNA中未觀察到擴(kuò)增產(chǎn)物（圖1D）。此外，作者還發(fā)現(xiàn)，與ZBTB44 mRNA相比，circZBTB44對(duì)RNase R處理具有抗性，這表明由于其圓形結(jié)構(gòu)，circZBTB44比其線性mRNA更穩(wěn)定（圖1E）。FISH和亞細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)顯示，circZBTB44在RCC細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有分布，細(xì)胞質(zhì)中circZBTB44較多（圖1F-G）。

圖1 circZBTB44在RCC組織和細(xì)胞中的表達(dá)

2、CircZBTB44促進(jìn)體外RCC細(xì)胞發(fā)育和體內(nèi)小鼠腫瘤發(fā)生
       通過(guò)一系列功能實(shí)驗(yàn)研究circZBTB44對(duì)RCC細(xì)胞惡性行為的影響。轉(zhuǎn)染si-circZBTB44-1/-2/-3后，RCC細(xì)胞中circZBTB44的表達(dá)顯著降低，ZBTB44 mRNA的表達(dá)不受si-circZBTB44的影響。si-circZBTB44-1和sicircZBTB44-2質(zhì)粒表現(xiàn)出較好的沉默效果，并應(yīng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)（圖2A）。然后作者評(píng)估了RCC細(xì)胞的活力和增殖潛力，發(fā)現(xiàn)circZBTB44-2沉默對(duì)RCC細(xì)胞的體外生長(zhǎng)有明顯的抑制作用（圖2B-C）。此外，相對(duì)于對(duì)照組，si-circZBTB44-1/-2組中遷移的RCC細(xì)胞數(shù)量顯著減少（圖2D）。敲低circZBTB44可減少RCC細(xì)胞的創(chuàng)面愈合距離（圖2E），表明沉默circZBTB44可顯著抑制RCC細(xì)胞的遷移能力。研究表明，CircZBTB44在RCC細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移中起癌癥啟動(dòng)子的作用。然后作者在體內(nèi)檢測(cè)了circZBTB44基因敲低對(duì)小鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響。與對(duì)照組相比，si-circZBTB44組小鼠腫瘤組織樣本中的circZBTB44水平顯著降低（圖2F）。si-circZBTB44組與對(duì)照組相比，腫瘤大小和重量明顯減?。▓D2G-H）。同樣地，沉默circZBTB44后，腫瘤生長(zhǎng)速度降低（圖2I）。此外，免疫組化染色結(jié)果顯示，circZBTB44沉默導(dǎo)致Ki-67蛋白表達(dá)明顯降低，表明circZBTB44在體內(nèi)刺激腫瘤生長(zhǎng)（圖2J）。
 

  
圖2 CircZBTB44在體外促進(jìn)RCC細(xì)胞惡性

3、CircZBTB44在RCC細(xì)胞中與HNRNPC和IGF2BP3相互作用
       作者基于RBPsuite網(wǎng)站的預(yù)測(cè)和RNA pull-down-ms的結(jié)果，進(jìn)一步探討circZBTB44在RCC中的調(diào)控機(jī)制。結(jié)果顯示HNRNPC和IGF2BP3可能與circZBTB44相互作用（圖3A）。接著作者檢測(cè)了circZBTB44沉默對(duì)HNRNPC和IGF2BP3表達(dá)的影響，qRT-PCR結(jié)果表明，RCC細(xì)胞中circZBTB44沉默對(duì)HNRNPC和IGF2BP3的表達(dá)沒(méi)有顯著影響（圖3B）。RNA pull-down實(shí)驗(yàn)顯示，HNRNPC和IGF2BP3在bio-circZBTB44復(fù)合物中大量富集，這表明circZBTB44在RCC細(xì)胞中與HNRNPC和IGF2BP3相互作用（圖3C）。同樣，作者觀察到circZBTB44在抗HNRNPC和抗IGF2BP3的沉淀中豐富富集，這證實(shí)了circZBTB44與HNRNPC或IGF2BP3之間的相互作用（圖3D）。人類蛋白質(zhì)圖譜預(yù)測(cè)HNRNPC主要分布在細(xì)胞核中，IGF2BP3主要位于細(xì)胞質(zhì)中（圖3E），免疫熒光實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)（圖3F）。最后作者評(píng)估了HNRNPC和IGF2BP3之間的相互作用，結(jié)果顯示HNRNPC和IGF2BP3之間沒(méi)有直接的相互作用（圖3G）。

圖3 CircZBTB44在RCC細(xì)胞中與HNRNPC和IGF2BP3相互作用。

4、HNRNPC增強(qiáng)了circZBTB44和IGF2BP3的相互作用并通過(guò)m6A修飾介導(dǎo)circZBTB44向細(xì)胞質(zhì)的易位
       HNRNPC是一種N6 -甲基腺苷（m6A）解讀器，調(diào)控RNA剪接、3’端加工和翻譯等RNA加工。假設(shè)HNRNPC參與了circZBTB44的調(diào)控。qRT-PCR結(jié)果驗(yàn)證了siHNRNPC和siIGF2BP3在RCC細(xì)胞中轉(zhuǎn)染后， HNRNPC和IGF2BP3在RCC細(xì)胞中的表達(dá)顯著降低（圖4A）。MeRIP檢測(cè)結(jié)果顯示，circZBTB44在抗m6 A沉淀中顯著富集，沉默HNRNPC后抗m6A減少，而在RCC細(xì)胞中敲除IGF2BP3后無(wú)明顯變化，提示HNRNPC影響了circZBTB44的m6 A修飾（圖4B）。此外，作者使用SRAMP數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)circZBTB44的m6A修飾位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)了4個(gè)具有高置信度的m6A位點(diǎn)（圖4C）。然后對(duì)4個(gè)m6A位點(diǎn)進(jìn)行突變，RNA pull- down實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HNRNPC在Bio-circZBTB44-s3Mut拉下的復(fù)合物中不富集（圖4D）。然后檢測(cè)circZBTB44在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的表達(dá)，qRT-PCR結(jié)果顯示，HNRNPC敲低顯著降低了circZBTB44的細(xì)胞質(zhì)分布，提高了circZBTB44在RCC細(xì)胞細(xì)胞核中的表達(dá)（圖4E）。作者進(jìn)一步探討了HNRNPC對(duì)circZBTB44和IGF2BP3相互作用的影響，HNRNPC缺失明顯降低了Bio-circZBTB44復(fù)合物中IGF2BP3的富集，提示HNRNPC沉默抑制了RCC細(xì)胞中circZBTB44和IGF2BP3的相互作用（圖4F）。同樣，RIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，circZBTB44富集后，抗IGF2BP3的沉淀顯著減少（圖4G）?？傮w而言，HNRNPC通過(guò)m6A修飾促進(jìn)circZBTB44向細(xì)胞質(zhì)易位，增強(qiáng)了circZBTB44與IGF2BP3的相互作用。

圖4 HNRNPC增強(qiáng)了circZBTB44和IGF2BP3的相互作用并通過(guò)m6 A修飾介導(dǎo)circZBTB44向細(xì)胞質(zhì)的易位

5、CircZBTB44與IGF2BP3結(jié)合調(diào)節(jié)HK3 mRNA穩(wěn)定性
       IGF2BP3與mRNA結(jié)合，調(diào)控靶基因表達(dá)。因此，作者對(duì)circZBTB44/IGF2BP3的下游靶點(diǎn)進(jìn)行了研究。根據(jù)catRAPID數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)的結(jié)果和之前的研究，發(fā)現(xiàn)HK3很可能與IGF2BP3結(jié)合，并且在RCC中也上調(diào)（圖5A）。作者檢測(cè)了circZBTB44敲低對(duì)HK3表達(dá)的影響，在circZBTB44沉默的RCC細(xì)胞中，HK3顯著下調(diào)（圖5B）。在HK3 3'UTR復(fù)合物中觀察到IGF2BP3的富集，這表明在RCC細(xì)胞中IGF2BP3與HK3 3'UTR結(jié)合（圖5C）。RIP實(shí)驗(yàn)顯示，HK3 3'UTR復(fù)合物在抗IGF2BP3的沉淀中富集（圖5D）。α-amanitin處理并在RCC細(xì)胞中沉默IGF2BP3后，HK3 mRNA的穩(wěn)定性顯著降低（圖5E）。FISH檢測(cè)結(jié)果顯示，circZBTB44、IGF2BP3和HK3在RCC細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中共定位（圖5F）。RIP實(shí)驗(yàn)顯示，在circ ZBTB44沉默的RCC細(xì)胞中，抗IGF2BP3沉淀中HK3 3'UTR的富集顯著減少（圖5G）。qRT-PCR分析證實(shí)了circZBTB44的過(guò)表達(dá)效率（圖5H）。作者還觀察到，在RCC細(xì)胞中，IGF2BP3敲除后，HK3的表達(dá)下調(diào)，并通過(guò)過(guò)表達(dá)circZBTB44而被逆轉(zhuǎn)（圖5I）。

圖5 CircZBTB44與IGF2BP3相互作用調(diào)節(jié)HK3 mRNA的穩(wěn)定性。

6、HK3在體外和體內(nèi)均促進(jìn)RCC的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移
       作者研究了HK3對(duì)RCC細(xì)胞發(fā)生的影響。qRT-PCR和western blot分析顯示，轉(zhuǎn)染si-HK3-1/-2/-3后，RCC細(xì)胞中HK3的表達(dá)顯著降低（圖6A）。研究表明，HK3敲低可顯著抑制RCC細(xì)胞的生存能力和增殖能力（圖6B-C）。此外，相對(duì)于對(duì)照組，si-HK3-1和si-HK3-2組的RCC細(xì)胞遷移能力顯著降低（圖6D-E）。利用荷瘤小鼠模型評(píng)估HK3缺乏對(duì)RCC腫瘤發(fā)生的影響，qRT-PCR和western blot分析顯示，sh-HK3組小鼠腫瘤組織中HK3的表達(dá)明顯下調(diào)（圖6F-G）。與對(duì)照組相比，缺乏HK3導(dǎo)致小鼠腫瘤重量和體積顯著減少（圖6H-I）。此外，小鼠腫瘤組織中的Ki67蛋白因HK3缺乏而減少，這表明HK3敲低抑制了體內(nèi)RCC的腫瘤發(fā)生（圖6J）。

圖6 HK3在體外和體內(nèi)均促進(jìn)RCC的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移

7、CircZBTB44通過(guò)上調(diào)HK3促進(jìn)RCC生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移
       作者進(jìn)行了救援試驗(yàn)，以檢驗(yàn)HK3是否在circZBTB44對(duì)RCC進(jìn)展的調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。利用pcDNA3.1/ HK3載體過(guò)表達(dá)HK3，通過(guò)qRT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率（圖7A）。作者發(fā)現(xiàn)circZBTB44誘導(dǎo)RCC細(xì)胞活力下降，并且HK3過(guò)表達(dá)后EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯恢復(fù)（圖7B-C）。沉默circZBTB44后，遷移的RCC細(xì)胞數(shù)量和RCC細(xì)胞的傷口愈合距離減少，發(fā)現(xiàn)這與HK3上調(diào)相抵消（圖7D-E）。此外，circZBTB44缺失誘導(dǎo)的異種移植物腫瘤重量、體積和生長(zhǎng)速度的下降被HK3過(guò)表達(dá)顯著逆轉(zhuǎn)（圖7F-G）。與sh-circ+oe-NC組相比，circZBTB44敲低組小鼠腫瘤組織中Ki67蛋白表達(dá)降低，HK3過(guò)表達(dá)升高（圖7H）。

圖7 CircZBTB44通過(guò)上調(diào)HK3促進(jìn)RCC生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移

8、CircZBTB44通過(guò)上調(diào)HK3促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2極化
       前人研究表明，HK3通過(guò)刺激浸潤(rùn)的單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物的豐度，促進(jìn)RCC細(xì)胞的免疫逃逸。因此，作者探索circZBTB44是否通過(guò)調(diào)節(jié)HK3來(lái)調(diào)節(jié)單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的M2極化。M0巨噬細(xì)胞與RCC細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)TAMs （圖8A）。流式細(xì)胞術(shù)顯示，circZBTB44沉默顯著降低了CD86⁺CD206^?巨噬細(xì)胞的比例，升高了CD206+CD86?巨噬細(xì)胞的比例，這一現(xiàn)象被HK3過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)（圖8B）。在與RCC共培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞中檢測(cè)M1相關(guān)基因（CD86、TNF-α）和M2相關(guān)基因（CD206、ARG-1）的表達(dá)。結(jié)果顯示，circZBTB44沉默降低了CD206和ARG-1的表達(dá)，增加了CD86和TNF-α的水平，而HK3過(guò)表達(dá)可顯著拯救CD206和ARG-1的表達(dá)（圖8C-D）。

圖8 CircZBTB44通過(guò)上調(diào)HK3促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2極化

實(shí)驗(yàn)方法
       生物信息學(xué)分析，RNase R消化實(shí)驗(yàn)，qRT-PCR，Western blot，Rescue assays，RNA干擾，過(guò)表達(dá)，細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，EdU化驗(yàn)，細(xì)胞活力測(cè)定，免疫熒光染色，熒光原位雜交（FISH），甲基化RNA免疫沉淀（MeRIP），免疫組化（IHC），RNA pull-down，GST pull-down，RNA免疫沉淀（RIP），異種移植小鼠模型，RCC細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，流式細(xì)胞術(shù)。
參考文獻(xiàn)：
Li TS, Gu Y, Xu BC, Kuca K, Zhang J, Wu WD. CircZBTB44 promotes renal carcinoma progression by stabilizing HK3 mRNA structure. 2023, April, 22（1）: 77. https://doi.org/10.1186/s12943-023-01771-5.