蛋白精氨酸甲基化修飾調(diào)控病毒感染后的MAVS激活

       信號(hào)適配體MAVS在病毒感染后形成類似朊病毒的聚合體，以激活先天的抗病毒免疫反應(yīng)。然而，MAVS的自發(fā)聚集可導(dǎo)致自身免疫性疾病。防止MAVS在靜止細(xì)胞中自發(fā)聚集的分子機(jī)制一直是個(gè)謎。在此，本研究發(fā)現(xiàn)，蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶9（PRMT9）直接針對(duì)MAVS，并催化MAVS在Arg41和Arg43處的精氨酸甲基化。在靜止?fàn)顟B(tài)下，這種修飾抑制了MAVS的聚集和MAVS的自動(dòng)激活。病毒感染后，PRMT9與線粒體解離，導(dǎo)致MAVS的聚集和激活。本研究揭示了MAVS上的一種翻譯后修飾形式，它可以使MAVS在生理?xiàng)l件下保持不活躍，以維持先天免疫的平衡性。本文于2022年8月發(fā)表在《Nature Communications》IF:17.694。

技術(shù)路線：

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
1、PRMT9負(fù)調(diào)控RLRs誘導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生
       為確定PRMTs在先天性抗病毒免疫中的潛在功能，將GFP-PRMT1-9質(zhì)粒與DsRED2-Mito質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，然后進(jìn)行模擬感染或感染SeV 8小時(shí)，并測(cè)量線粒體的定位。共聚焦顯微鏡顯示，PRMT1、PRMT2、PRMT3、PRMT4、PRMT5、PRMT6和PRMT8未能與線粒體共聚焦，且其定位不受SeV感染的影響。而PRMT7在HEK293T細(xì)胞中與線粒體共定位，不受SeV感染的影響，只有PRMT9在HEK293T細(xì)胞中與線粒體共定位，并在SeV感染后與線粒體分離（附圖1）。因此，選擇PRMT9用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

附圖1 PRMT9定位于線粒體

       為進(jìn)一步確認(rèn)PRMT9的功能，通過(guò)CRISP/Cas9技術(shù)構(gòu)建了兩個(gè)PRMT9敲除的RAW264.7細(xì)胞系（圖1a）。與siRNA敲除結(jié)果一致，在SeV感染或5′-pppRNA轉(zhuǎn)染后，PRMT9敲除的RAW264.7細(xì)胞中Ifnb1、Ifnα4和Cxcl10的mRNA表達(dá)水平上調(diào)（圖1b，c）。同樣，在RAW264.7細(xì)胞中敲除Prmt9也增加了VSV誘導(dǎo)的Ifnb1的表達(dá)（圖1d）。同時(shí)，在PRMT9敲除的RAW264.7細(xì)胞中，VSV的復(fù)制也減弱了（圖1d，e）。
       在HEK293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Flag-PRMT9，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)Flag-PRMT9后，SeV或VSV感染后IFNB1 mRNA的表達(dá)明顯下降（圖1f，g）。同時(shí)，在過(guò)表達(dá)Flag-PRMT9的HEK293T細(xì)胞中，VSV的復(fù)制增加（圖1g）。熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀分析的結(jié)果表明，PRMT9在HEK293T細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)促進(jìn)了VSV-GFP的復(fù)制（圖1h）?？偟膩?lái)說(shuō)，這些數(shù)據(jù)表明，PRMT9負(fù)向調(diào)節(jié)RLRs誘導(dǎo)的IFN-β信號(hào)，促進(jìn)RNA病毒感染。

圖1 PRMT9負(fù)調(diào)控RLRs誘導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生

2、PRMT9缺陷增強(qiáng)RLRs觸發(fā)的IFN -β信號(hào)通路
       為進(jìn)一步研究PRMT9在調(diào)節(jié)病毒感染中的功能，將Prmt9^fl/fl小鼠與Lyz2-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，產(chǎn)生髓系特異性PRMT9敲除小鼠。從Prmt9^fl/fl Lyz2-Cre（以下簡(jiǎn)稱'Prmt9^CKO'）和Prmt9^fl/fl小鼠（以下簡(jiǎn)稱'Prmt9^WT'）制備初級(jí)腹膜巨噬細(xì)胞，然后用SeV、VSV和HSV-1感染或用5′-pppRNA刺激。與PRMT9的siRNA敲除或sgRNA敲除的觀察結(jié)果一致，用SeV感染Prmt9^CKO腹腔巨噬細(xì)胞或用5'PPP RNA刺激導(dǎo)致Ifnb1、Ifnα4和Cxcl10 mRNA的表達(dá)與Prmt9^WT巨噬細(xì)胞相比明顯增加（圖2a, b）。Prmt9^CKO巨噬細(xì)胞的IFN-β分泌也比Prmt9^WT巨噬細(xì)胞高（圖2a，b）。然而，Premt9^WT巨噬細(xì)胞和Premt9^CKO巨噬細(xì)胞在HSV-1感染誘導(dǎo)的I型IFNs和Cxcl10表達(dá)水平方面沒(méi)有觀察到差異（圖2c）。結(jié)果顯示，感染VSV后，Ifnb1 mRNA水平在Prmt9^CKO巨噬細(xì)胞中增加，而VSV mRNA、VSV滴度和VSV蛋白在Prmt9^CKO巨噬細(xì)胞中明顯下降（圖2d，e）?？傊梢缘贸鲆粋€(gè)結(jié)論：PRMT9對(duì)RLRs誘導(dǎo)的IFN-β信號(hào)傳導(dǎo)有負(fù)向調(diào)節(jié)作用。

圖2原代腹腔巨噬細(xì)胞PRMT9缺陷增強(qiáng)RLRs觸發(fā)的IFN -β信號(hào)通路

3、在體內(nèi)PRMT9抑制先天抗病毒響應(yīng)
       為確認(rèn)PRMT9在RNA病毒感染中的生理功能，通過(guò)尾靜脈注射的方式讓Prmt9^CKO小鼠感染VSV。如圖3a所示，感染VSV后，Ifnb1在Prmt9^CKO小鼠肺部、肝臟和脾臟的表達(dá)水平明顯高于Prmt9^WT小鼠的器官。此外，ELISA結(jié)果還顯示，VSV感染24小時(shí)后，Prmt9^CKO小鼠血清中IFN-β蛋白的水平比Prmt9^WT小鼠明顯增加（圖3b）。此外，VSV滴度的Plaque檢測(cè)和VSV mRNA的qRT-PCR分析證實(shí)，與Prmt9CKO小鼠相比，VSV在肺部、肝臟和脾臟的復(fù)制明顯減弱（圖3c, d）。此外，發(fā)現(xiàn)Prmt9^CKO小鼠對(duì)VSV感染的敏感性低于Prmt9^WT小鼠，但對(duì)HSV-1感染的敏感性不高（圖3e，f）。HE染色的結(jié)果顯示，Prmt9^WT和Premt9^CKO小鼠在沒(méi)有感染VSV的情況下，肺部沒(méi)有明顯的差異，與VSV感染后的Prmt9^WT小鼠相比，PRMT9的缺乏減輕了炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、組織水腫和肺部纖維化（圖3g）?？傊@些結(jié)果表明，PRMT9的缺失增強(qiáng)了體內(nèi)對(duì)RNA病毒的抗病毒先天免疫反應(yīng)。

圖3 在體內(nèi)PRMT9抑制先天抗病毒響應(yīng)

4、病毒感染期間PRMT9負(fù)調(diào)控MAVS介導(dǎo)的信號(hào)通路
       為研究PRMT9在調(diào)節(jié)MAVS介導(dǎo)的信號(hào)通路中的作用，將Flag-PRMT9質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞，然后用SeV感染。免疫印跡分析結(jié)果顯示，與空載體相比，轉(zhuǎn)染PRMT9表達(dá)質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞中SeV誘導(dǎo)的TBK1、IRF3和IκBα的磷酸化水平下降（圖4a，b）。來(lái)自Prmt9^WT和Premt9^CKO小鼠的腹膜巨噬細(xì)胞，然后用SeV和HSV-1感染或用5'pp RNA刺激。發(fā)現(xiàn)，感染SeV或用5'pp-RNA刺激后，Prmt9^CKO巨噬細(xì)胞中TBK1、IRF3和IκBα的磷酸化水平高于Prmt9^WT巨噬細(xì)胞（圖4c, d）。相比之下，感染HSV-1后，TBK1、IRF3和IκBα的磷酸化在Prmt9^CKO巨噬細(xì)胞中沒(méi)有表現(xiàn)出差異（圖4e，f）。據(jù)報(bào)道，在磷酸化后，IRF3將二聚體化并轉(zhuǎn)入細(xì)胞核。因此，從SeV感染的巨噬細(xì)胞中分離出細(xì)胞質(zhì)和核的部分，測(cè)量IRF3的核轉(zhuǎn)位。發(fā)現(xiàn)在感染SeV后，Prmt9^CKO巨噬細(xì)胞中IRF3向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)移比Prmt9^WT巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)移要大（圖4g，h）。此外，共聚焦顯微鏡的結(jié)果顯示，PRMT9在HEK293T細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)削弱了IRF3向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)位（圖4i）?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，PRMT9通過(guò)抑制MAVS介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)抑制IFN-β的產(chǎn)生和先天抗病毒免疫。

圖4 PRMT9負(fù)調(diào)控MAVS介導(dǎo)的信號(hào)通路

5、PRMT9靶向MAVS
       為確定受PRMT9調(diào)控的目標(biāo)，將與先天抗病毒免疫有關(guān)的主要信號(hào)蛋白的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒與PRMT9表達(dá)的質(zhì)粒和IFN-β啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告一起轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)由RIG-I、MDA5或MAVS介導(dǎo)的IFN-β啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告的激活被PRMT9過(guò)表達(dá)所抑制（圖5a）。同時(shí)，由TBK1介導(dǎo)的IFN-β啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告的激活不受PRMT9過(guò)表達(dá)的影響（圖5a）。cGAS/STING誘導(dǎo)的IFN-β啟動(dòng)子的激活不受PRMT9過(guò)表達(dá)的影響（圖5a），這與數(shù)據(jù)顯示PRMT9不能調(diào)節(jié)對(duì)DNA病毒感染的抗病毒免疫反應(yīng)相一致。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，HEK293T細(xì)胞中由RIG-I、MDA5或MAVS介導(dǎo)的IFNB1表達(dá)水平也受到PRMT9表達(dá)的抑制，而，由TBK1或IRF3介導(dǎo)的IFNB1表達(dá)水平在PRMT9過(guò)表達(dá)后沒(méi)有受到影響（圖5b）。這些數(shù)據(jù)表明，PRMT9可能以MAVS為目標(biāo)，調(diào)節(jié)IFN-β信號(hào)和抗病毒反應(yīng)。
       為進(jìn)一步驗(yàn)證，將HA-cGAS、HA-RIG-I、HA-MAVS、HA-TBKI、Myc-MDA5和Myc-IRF3與GFP-PRMT9一起轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中，研究其相互作用。共同免疫沉淀和Western印跡分析的結(jié)果表明，PRMT9與MAVS相互作用，但與cGAS、RIG-I、MDA5、TBKI和IRF3沒(méi)有相互作用（圖5c）。用重組蛋白體外pull down的結(jié)果顯示PRMT9和MAVS之間有直接的相互作用（圖5d）。免疫熒光結(jié)果也顯示PRMT9和MAVS之間存在明顯的共定位（圖5e）。此外，發(fā)現(xiàn)病毒感染后，內(nèi)源性PRMT9和MAVS之間的相互作用減弱了（圖5f）?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，PRMT9通過(guò)靶向線粒體上的MAVS抑制了抗病毒的先天免疫。

圖5 PRMT9靶向MAVS

6、PRMT9催化MAVS的R41和R43位點(diǎn)的精氨酸甲基化
       接下來(lái)研究PRMT9是否能催化MAVS的精氨酸甲基化。首先將GFP-PRMT9表達(dá)質(zhì)粒與HA-MAVS一起轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞。Co-IP和WB結(jié)果顯示，PRMT9增強(qiáng)MAVS的SDMA水平（圖6a，左）。據(jù)報(bào)道，PRMT9能催化SAP14527的SDMA，因此，用HA-SAP145質(zhì)粒做陽(yáng)性對(duì)照（圖6a，右）。由于有三種類型的精氨酸甲基化是由精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶催化的，所以對(duì)MAVS的甲基化類型進(jìn)行了研究。從小鼠中分離原發(fā)性腹膜巨噬細(xì)胞，用SeV感染。Co-IP和WB的結(jié)果顯示，在沒(méi)有SeV感染的MAVS中形成了MMA和SDMA，但沒(méi)有形成ADMA（圖6b）。值得注意的是，SeV感染后MMA和SDMA的形成逐漸減少（圖6b）。為進(jìn)一步確定PRMT9的甲基化精氨酸功能，通過(guò)Co-IP和WB檢查內(nèi)源性MAVS的SDMA。與PRMT9過(guò)表達(dá)的結(jié)果一致，在Prmt9^CKO和Prmt9^WT小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞中敲除PRMT9大大減少了MAVS的甲基化（圖6c）?？偟膩?lái)說(shuō)，這些數(shù)據(jù)表明PRMT9在RLRs途徑中調(diào)節(jié)MAVS的甲基化。
       據(jù)報(bào)道，Gly260突變使PRMT9變成一種無(wú)催化活性的形式。為驗(yàn)證PRMT9介導(dǎo)的MAVS甲基化是否取決于其甲基轉(zhuǎn)移酶的活性，將WT PRMT9或PRMT9突變體G260E與MAVS一起轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞。結(jié)果表明，WT PRMT9可以增加MAVS的甲基化水平，而PRMT9的酶突變體G260E則失去了誘導(dǎo)MAVS甲基化的能力（圖6d）。SeV感染減少了PRMT9介導(dǎo)的MAVS甲基化（圖6d）。將WT PRMT9和PRMT9突變體G260E重新引入Prmt9^CKO巨噬細(xì)胞并測(cè)量MAVS甲基化，發(fā)現(xiàn)在Prmt9^CKO巨噬細(xì)胞中表達(dá)mPRMT9可以恢復(fù)MAVS甲基化，而表達(dá)mPRMT9突變體G260E則沒(méi)有這種效果（圖6e）。這些數(shù)據(jù)表明，PRMT9通過(guò)其甲基轉(zhuǎn)移酶活性催化了MAVS的甲基化。
       為直接研究PRMT9催化MAVS的精氨酸甲基化，制備His-MAVS和GST-PRMT9的重組蛋白，并進(jìn)行體外蛋白精氨酸甲基化試驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)在體外甲基化系統(tǒng)中，當(dāng)PRMT9存在時(shí)，MAVS的甲基化程度增加（圖6f）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)證明PRMT9促進(jìn)了MAVS的精氨酸甲基化。
       為確定MAVS中被PRMT9調(diào)節(jié)的潛在精氨酸殘基，用重組的MAVS和PRMT9蛋白進(jìn)行體外甲基化試驗(yàn)，然后用液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）分析來(lái)識(shí)別被甲基化的精氨酸殘基。在檢測(cè)中，MAVS的R41和R43殘基被確定為潛在的甲基化部位（圖6g）。接下來(lái)，R41和R43精氨酸殘基被突變?yōu)橘嚢彼?，并檢查MAVS在MAVS KO HEK293T細(xì)胞（MAVS^-/-）中的甲基化狀態(tài)。發(fā)現(xiàn)PRMT9可以促進(jìn)MAVS（WT）的甲基化，而，MAVS（R41K）、MAVS（R43K）和MAVS（R41K，R43K）突變導(dǎo)致MAVS甲基化在PRMT9的存在下明顯減少（圖6h）。WB結(jié)果顯示，PRMT9可以促進(jìn)MAVS（WT）的甲基化，而PRMT9介導(dǎo)的MAVS甲基化在MAVS（R41K）、MAVS（R43K）和MAVS（R41K, R43K）中大大降低（圖6i）。進(jìn)一步，用S-[3H-Met]腺苷蛋氨酸作為甲基供體進(jìn)行體外甲基化試驗(yàn)。結(jié)果顯示，在重組PRMT9蛋白的存在下，His-MAVS的放射性大大增加（圖6j），而MAVS（R41K）、MAVS（R43K）和MAVS（R41K，R43K）的放射性水平與MAVS（WT）相比明顯下降（圖6j）。總之，這些數(shù)據(jù)表明，PRMT9催化了MAVS在R41和R43殘基上的精氨酸甲基化。

圖6 PRMT9催化MAVS的R41和R43位點(diǎn)的精氨酸甲基化

7、PRMT9介導(dǎo)的MAVS甲基化抑制MAVS聚集和激活
       RNA病毒感染誘導(dǎo)MAVS迅速形成類似朊病毒的聚集物，導(dǎo)致I型IFN和其他炎癥細(xì)胞因子的強(qiáng)烈誘導(dǎo)。在本研究中，對(duì)PRMT9介導(dǎo)的MAVS甲基化是否抑制MAVS的聚集進(jìn)行了調(diào)查。首先將GFP-PRMT9表達(dá)質(zhì)?；騁FP-PRMT9（G260E）和HA-MAVS轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中，并通過(guò)半變性洗滌劑瓊脂糖電泳（SDD-AGE）測(cè)量MAVS的聚集。如圖7a，過(guò)表達(dá)MAVS可以促進(jìn)MAVS聚集的形成。與PRMT9的抑制作用相一致，發(fā)現(xiàn)PRMT9過(guò)表達(dá)的HEK293T細(xì)胞中MAVS的聚集比轉(zhuǎn)染對(duì)照載體的細(xì)胞要少（圖7a）。值得注意的是，PRMT9（G260E）的過(guò)表達(dá)不能減少M(fèi)AVS的聚集（圖7a）。進(jìn)一步測(cè)量SeV感染誘導(dǎo)的MAVS聚集，該感染由Premt9^CKO和Premt9^WT小鼠的腹膜巨噬細(xì)胞制備。發(fā)現(xiàn)SeV感染可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中的MAVS聚集（圖7b），而PRMT9的缺乏大大增加了感染后Prmt9^CKO巨噬細(xì)胞中MAVS聚集的形成（圖7b）。值得注意的是，即使沒(méi)有SeV感染，在Prmt9^CKO巨噬細(xì)胞中也可以檢測(cè)到低水平的MAVS聚集（圖7b），表明PRMT9介導(dǎo)的MAVS甲基化可以阻止MAVS在正常條件下自主激活。

圖7 PRMT9介導(dǎo)的MAVS甲基化抑制MAVS聚集和激活

實(shí)驗(yàn)方法：
CRISPR–Cas9構(gòu)建PRMT9敲低小鼠，細(xì)胞和病毒培養(yǎng)，PRMT9和MAVS敲低細(xì)胞構(gòu)建，質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染，RNA提取和質(zhì)控，ELISA，熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，Co-IP，IF，病毒感染和滴度實(shí)驗(yàn)，蛋白表達(dá)和純化，組織病理染色，體外甲基化試驗(yàn)，體外放射性實(shí)驗(yàn)，體外MAVS的擴(kuò)大和激活
參考文獻(xiàn)：
Bai X, Sui C, Liu F, Chen T, Zhang L, Zheng Y, Liu B, Gao C. The protein arginine methyltransferase PRMT9 attenuates MAVS activation through arginine methylation. Nat Commun. 2022 Aug 26;13(1):5016. doi: 10.1038/s41467-022-32628-y. PMID: 36028484