你還不知道怎么選關(guān)鍵基因嗎？生信?加簡單的實驗驗證輕松發(fā)高分

       潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是一種慢性非特異性炎癥性疾病，一般局限于結(jié)腸粘膜和粘膜下層。最近的研究表明，鐵死亡可能參與UC的過程。然而，UC中的鐵死亡機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。本研究基于生物信息學(xué)挖掘到UC中鐵死亡相關(guān)的關(guān)鍵基因LCN2，進(jìn)一步功能實驗證實LCN2是調(diào)節(jié)UC中鐵死亡形成的一個關(guān)鍵因素，為鐵死亡在UC中的重要作用提供了額外的證據(jù)。本研究于2023年3月發(fā)表在《Inflammatory Bowel Diseases》IF：7.29期刊上。

技術(shù)路線

主要實驗結(jié)果：
1、鑒定WGCNA模塊的關(guān)鍵基因和DEGs及其功能分析
       利用UC的GEO數(shù)據(jù)進(jìn)行WGCNA分析，獲得13個模塊，其中navajowhite、darkolivergreen模塊和臨床指標(biāo)高度相關(guān)（圖1A）。利用GSE87466數(shù)據(jù)集鑒定DEGs，共獲得910個DEGs，UC組有575個上調(diào)和335個下調(diào)（圖1B）。DEGs和上述兩個模塊的交集是878個基因（圖1C）。
       對上述獲得基因進(jìn)行功能分析。GO的生物過程富集分析表明，這些基因主要富集與免疫相關(guān)通路相關(guān)的功能，包括“對細(xì)菌源分子的反應(yīng)”、“體液免疫反應(yīng)”和“對LPS的反應(yīng)”（圖1D）。細(xì)胞成分分析主要富集于“質(zhì)膜外側(cè)”和“質(zhì)膜外側(cè)”（圖1E），MF分析主要富集于“趨化因子受體結(jié)合”和“趨化因子活性”（圖1F）。KEGG分析發(fā)現(xiàn)這些基因主要途徑是細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用”（圖1G）。最后，進(jìn)行了GSEA分析，結(jié)果主要富集在“IL?17信號通路”（圖1H）。
       在對浸潤進(jìn)行免疫學(xué)分析后，發(fā)現(xiàn)UC組與對照組在免疫細(xì)胞百分比上有顯著差異（圖1I）。UC的存在與具有記憶激活的T細(xì)胞CD4、濾泡輔助性T細(xì)胞、γ δ T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞M0、巨噬細(xì)胞M1、活化的樹突狀細(xì)胞、活化的肥大細(xì)胞和中性粒細(xì)胞水平顯著升高相關(guān)。相反，UC患者表現(xiàn)出明顯較低水平的T細(xì)胞CD8，T細(xì)胞CD4記憶靜息狀態(tài)，T細(xì)胞調(diào)節(jié)性(Tregs)， NK細(xì)胞活化，單核細(xì)胞，M2巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞靜息狀態(tài)。

圖1篩選潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)基因

2、選擇和驗證與臨床表型和免疫細(xì)胞高度相關(guān)的鐵死亡相關(guān)DEGs
       將上述878個基因與鐵死亡相關(guān)基因取交集，得到UC中9個鐵死亡相關(guān)DEGs。為進(jìn)一步探索其機(jī)制，從STRING數(shù)據(jù)庫中構(gòu)建一個PPI網(wǎng)絡(luò)，并在cytoscape中的MOODE插件上進(jìn)行了驗證，顏色越深，相關(guān)性越高（圖2A）。隨后分析了與鐵死亡相關(guān)的DEG與免疫基因的相關(guān)性（圖2B）。結(jié)果顯示，鐵死亡相關(guān)DEGs均與免疫基因存在不同程度的相關(guān)性，尤其是LCN2。最后，可視化鐵死亡相關(guān)的DEGs在UC組和正常組中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)除了BSG，它們在UC組中均高表達(dá)（圖2C-2K）。

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)與凋亡相關(guān)DEGs的表達(dá)

3、LCN2是隨機(jī)森林模型中最具決定性的基因
       由于一些基因已經(jīng)被證明與鐵死亡相關(guān)，最終選擇LCN2，BSG，ANXA5和MUC1進(jìn)行隨機(jī)森林模型構(gòu)建。GSE87466的內(nèi)部驗證驗證結(jié)果為陽性，表現(xiàn)為極高的置信水平(AUC = 1)和無可挑剔的分類性能（圖3A）。這些結(jié)果表明，GSE87466是一個可靠和有效的分類器?；跍y試集GSE47908的評估，有明顯的高水平置信（AUC = 0.94；圖3B）。同時，還可以看到測試集GSE47908中的4個基因在UC組和正常組中存在顯著差異表達(dá)（圖3C）。在測試集和訓(xùn)練集模型中，LCN2對模型的作用最大（圖3D-E）。ROC曲線分析LCN2在驗證集和測試集的診斷性能均顯示出較好的AUC值（圖3F-G）。以上表明LCN2是隨機(jī)森林模型中最具決定性的基因。因此，選擇LCN2用于后續(xù)分析。

圖3 UC的4個基因的隨機(jī)森林預(yù)測模型

4、UC中發(fā)生鐵死亡和LCN2高表達(dá)
       通過構(gòu)建LPS/IFN-γ誘導(dǎo)iBMDM呈M1樣巨噬細(xì)胞的炎癥模型模擬結(jié)腸炎的炎癥過程，探討LCN2基因在UC中的作用。如圖4A所示，LPS/IFN-γ刺激引起的脂質(zhì)過氧化水平增加，這一趨勢可以被Fer-1預(yù)處理逆轉(zhuǎn)。為進(jìn)一步驗證UC病理過程中鐵死亡的存在，使用FerroOrange探針檢測Fe²⁺含量的變化，LPS/IFN-γ刺激可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鐵含量的積累，而Fer-1處理可恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)Fe²⁺水平（圖4B）。此外，觀察到LPS/IFN-γ刺激后ACSL4、COX2和LCN2蛋白水平顯著上調(diào)，而GPX4和FTH1表達(dá)下降（圖4C）。這些結(jié)果表明LPS/IFN-γ可以誘導(dǎo)iBMDM模擬的腸炎模型中鐵死亡的進(jìn)展并增加LCN2的表達(dá)。

圖4 LPS/IFN-γ刺激iBMDM極化并模擬結(jié)腸炎的炎癥過程

5、LCN2沉默抑制UC鐵死亡
       為探究LCN2在UC鐵死亡中的作用，在iBMDM和Caco-2細(xì)胞中敲低LCNE2的表達(dá)（圖5A）。結(jié)果顯示敲低LCN2可降低LPS/IFN-γ刺激iBMDM細(xì)胞和LPS刺激Caco-2細(xì)胞誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化水平（圖5B）。采用共聚焦顯微鏡或多功能微孔檢測系統(tǒng)檢測Fe²⁺含量。如圖5E所示，與對照組相比，LCN2敲低降低LPS/IFN-γ處理的iBMDM細(xì)胞和LPS刺激的Caco-2細(xì)胞中亞鐵含量的增加。此外，在炎癥模型中，LCN2敲低降低ACSL4和COX-2蛋白水平，而SLC7A11、GPX4和FTH1蛋白水平升高（圖5C-D）。同樣，UC模型中ACSL4和FTH1的表達(dá)被LCN2敲低逆轉(zhuǎn)（圖5C-D）。綜上所述，敲低LCN2可以抑制UC中的鐵死亡，從而延緩UC的進(jìn)展。

圖5 敲低LCN2抑制UC細(xì)胞的鐵死亡

6、LCN2介導(dǎo)的鐵死亡導(dǎo)致DSS誘導(dǎo)的UC
       為進(jìn)一步驗證LCN2作為UC的鐵死亡相關(guān)因子的存在，用Fer-1預(yù)處理小鼠，并讓小鼠自由飲用含有3%DSS的飲用水，誘導(dǎo)UC模型。結(jié)果如圖6A-C所示；DSS組表現(xiàn)出明顯的UC癥狀，包括體重明顯下降，DAI評分明顯增加，結(jié)腸長度明顯縮短。然而，使用Fer-1后，明顯扭轉(zhuǎn)了這些變化。H&E染色結(jié)果顯示，DSS組表現(xiàn)出明顯的炎癥細(xì)胞浸潤、粘膜損傷和其他病理癥狀，F(xiàn)er-1可以緩解這些癥狀（圖6D）。免疫組化結(jié)果顯示，F(xiàn)er-1緩解了DSS誘導(dǎo)的UC中緊密連接蛋白（Occludin、ZO-1、Claudin-1）的表達(dá)減少（圖6E）。這表明靶向鐵死亡形成是治療UC的一個很有前途的途徑。
       此外，結(jié)果顯示，在DSS誘導(dǎo)的UC中，GPX4的表達(dá)被下調(diào)，而ACSL4和LCN2的表達(dá)被上調(diào)，這些變化可以被Fer-1抵消（圖6F）。總之，LCN2與UC中的鐵死亡密切相關(guān)，抑制鐵死亡可以減少LCN2的表達(dá)，改善UC小鼠。

圖6 LCN2介導(dǎo)的鐵死亡參與DSS誘導(dǎo)的UC

       總之，在這項研究中，作者發(fā)現(xiàn)在LPS/IFN-γ誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞極化的炎癥模型和DSS誘導(dǎo)的UC小鼠模型中，LCN2高度表達(dá)，并與UC鐵死亡的發(fā)生密切相關(guān)。更重要的是，沉默LCN2抑制了巨噬細(xì)胞極化的炎癥模型和LPS刺激的Caco-2細(xì)胞UC模型中的鐵變性事件。研究表明，LCN2是調(diào)節(jié)UC中鐵死亡形成的一個關(guān)鍵因素，而抑制LCN2會抑制UC中的鐵死亡形成。
實驗方法：
GEO數(shù)據(jù)下載，WGCNA分析，GSEA分析，DEG鑒定和功能富集，CIBERSORT分析，PPI分析，構(gòu)建隨機(jī)森林模型，細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染，脂質(zhì)過氧化實驗，WB，鐵離子濃度檢測，UC動物建模，HE染色，IHC
參考文獻(xiàn)：
Deng L, He S, Li Y, Ding R, Li X, Guo N, Luo L. Identification of Lipocalin 2 as a Potential Ferroptosis-related Gene in Ulcerative Colitis. Inflamm Bowel Dis. 2023 Mar 31:izad050. doi: 10.1093/ibd/izad050. Epub ahead of print. PMID: 37000707.