牙髓干細(xì)胞來(lái)源的外泌體通過(guò)GPER介導(dǎo)的cAMP/PKA/CREB信號(hào)通路激活NOD小鼠的唾液腺上皮細(xì)胞功能

       干燥綜合征（SS）是一種以口干和眼干為特征的慢性、全身性自身免疫性疾病，好發(fā)于絕經(jīng)期女性。口干癥是一種臨床常見(jiàn)的由唾液分泌不足引起的疾病，可導(dǎo)致吞咽困難、齲齒、牙周病等。隨著疾病發(fā)展，約2/3的SS患者出現(xiàn)全身免疫功能紊亂。外泌體是一種直徑40~150nm的細(xì)胞外囊泡，攜帶多種生物分子，可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞。據(jù)報(bào)道，間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體（MSC-Exos）有助于細(xì)胞間通訊，已顯示出治療包括SS在內(nèi)的各種炎癥性疾病的潛力。牙髓干細(xì)胞（DPSCs）是從牙髓組織中分離得到的一種間充質(zhì)干細(xì)胞，具有高度增殖和較低的免疫原性。過(guò)去幾年中，研究人員主要利用DPSCs來(lái)源的外泌體（DPSC-Exos）來(lái)治療系統(tǒng)性疾病，因?yàn)樗鼈兙哂锌沟蛲觥⒖寡缀驮偕忍匦?。然而，DPSC-Exos在緩解SS患者口干和恢復(fù)涎腺功能方面的療效尚不明確。該研究發(fā)表在《Journal of Translational Medicine》，IF：7.4。
技術(shù)路線

示意圖

主要研究結(jié)果
1. 牙髓干細(xì)胞（DPSCs）的分離、培養(yǎng)和鑒定
       分離人DPSCs，并在倒置相差顯微鏡下觀察不同代次的培養(yǎng)和細(xì)胞膜片培養(yǎng)（圖1A）。DPSCs呈成纖維樣細(xì)胞形態(tài)。DPSCs高表達(dá)MSCs表面標(biāo)志物CD29（99.9%）、CD90（99.9%）、CD105（99.9%）和CD44（99.5%）。造血細(xì)胞標(biāo)志物CD34、CD45、CD19和HLA-DR表達(dá)<1%（圖1B），表明DPSCs具有低免疫原性。多譜系分化實(shí)驗(yàn)顯示了DPSCs的成骨（圖1C）、成脂（圖1D）和軟骨分化（圖1E）潛能。作者的結(jié)果證實(shí)了該研究中使用的DPSCs的MSC表型。

圖1 DPSCs的分離和鑒定

2. DPSC-Exos的分離和鑒定
       采用超速離心法從DPSCs細(xì)胞片層條件培養(yǎng)基中分離DPSCs-exos。透射電鏡顯示，DPSC-Exos呈現(xiàn)典型杯狀形態(tài)的雙層膜結(jié)構(gòu)（圖2A）。NTA顯示了DPSC-Exos在30-150nm的粒徑分布（圖2B）。DPSC-Exos表達(dá)典型的外泌體標(biāo)志物ALIX、TSG101和CD63（圖2C）。在共培養(yǎng)的4小時(shí)內(nèi)，DPSC-Exos很容易在SGEC中內(nèi)化（圖2D）?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明成功分離出了可內(nèi)化于SGEC中的DPSC-Exos。

圖2 DPSCs膜片釋放外泌體（DPSC-Exos）的分離和鑒定

3. DPSC-Exos部分恢復(fù)了IFN-γ誘導(dǎo)的SGEC死亡和AQP5的下調(diào)
       浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞分泌的IFN-γ可誘導(dǎo)SS相關(guān)的導(dǎo)管細(xì)胞凋亡，從而損害腺體分泌功能。因此，IFN-γ通常在體外用于模擬SS期間唾液腺的炎癥條件。在這項(xiàng)研究中，IFN-γ處理12 h顯著抑制了SGEC的增殖（圖3A）。為驗(yàn)證DPSC-Exos對(duì)IFN-γ誘導(dǎo)SEGC死亡的影響，在SGEC中分別加入不同濃度(5、20、80 g/ml）的DPSC-Exos處理24、48、72 h。與IFN-γ組相比，20、80μg/ml DPSC-Exos處理組在48、72 h增殖逐漸增加（圖3A）。這些結(jié)果表明，DPSC-Exos具有減輕SS期間炎癥抑制的SGEC增殖的潛力。
       RT-qPCR檢測(cè)不同濃度DPSC-Exos處理SGEC 48 h后內(nèi)源性AQP5轉(zhuǎn)錄水平的變化。IFN-γ組AQP5 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低。DPSC-Exos恢復(fù)了IFN-γ對(duì)AQP5表達(dá)的抑制作用（圖3B）。在蛋白質(zhì)印跡分析中，與IFN-γ處理組相比，DPSC-Exos（20 μg/ml）處理組AQP5表達(dá)較高（圖3C，D）。在免疫熒光分析中，與IFN-γ處理組相比，DPSC-Exos（20 μg/ml）組AQP5的熒光強(qiáng)度顯著增加（圖3E，F(xiàn)）。這些數(shù)據(jù)表明，在SS期間，DPSC-Exos具有上調(diào)SGEC中AQP5表達(dá)的潛力。

圖3 DPSC-Exos挽救了IFN-γ引起的唾液腺上皮細(xì)胞（SGEC）死亡和AQP5下調(diào)

4. IFN-γ預(yù)處理的SGEC和DPSC-Exos的轉(zhuǎn)錄組分析
       在IFN-γ預(yù)處理的SGEC中加入或不加入DPSC-Exos（20 μg/ml）進(jìn)行RNA測(cè)序，以鑒定差異表達(dá)基因（DEGs）。首先，主成分分析（PCA）顯示了組間數(shù)據(jù)的獨(dú)立性，說(shuō)明數(shù)據(jù)具有可比性（圖4A）。與IFN-γ組相比，DPSC-Exos組共發(fā)現(xiàn)304個(gè)DEGs，其中142個(gè)上調(diào)，162個(gè)下調(diào)。GPER是DPSC-Exos組中上調(diào)的DEGs之一（圖4B）。根據(jù)基因本體（GO）富集分析，GPER在SGEC中的雌激素16-α-羥化酶活性中起作用（圖4C）。根據(jù)京都基因與基因組百科全書（KEGG）分析，GPER在cAMP信號(hào)通路、唾液分泌和雌激素信號(hào)通路中起作用（圖4D）。DEGs與STRING數(shù)據(jù)庫(kù)的交互關(guān)系分析顯示，唾液分泌、cAMP信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路之間存在相互作用（圖4E）。此外，重疊分析顯示GPER是參與這3條信號(hào)通路相互作用的關(guān)鍵DEG（圖4F）。這些數(shù)據(jù)表明，DPSC-Exos組過(guò)表達(dá)的GPER可能在改善SGEC活性中發(fā)揮作用。

圖4 經(jīng)或不經(jīng)DPSC-Exos處理的唾液腺上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組分析

5. DPSC-Exos組GPER表達(dá)量較高
       熱圖顯示DPSC-Exos處理的SGEC中GPER上調(diào)（圖5A）。相關(guān)熱圖顯示GPER與唾液分泌相關(guān)的DEGs密切相關(guān)（圖5B）。免疫熒光分析顯示，IFN-γ組中GPER表達(dá)下調(diào)，DPSC-Exos恢復(fù)了IFN-γ抑制的SGEC中GPER表達(dá)（圖5C，D）。蛋白質(zhì)印跡分析分析證實(shí)，與IFN-γ組相比，DPSC-Exos組中GPER表達(dá)較高（圖5E，F(xiàn)）。這些數(shù)據(jù)表明，DPSC-Exos具有上調(diào)IFN-γ處理的SGEC中GPER表達(dá)的潛力。

圖5 DPSC-Exos誘導(dǎo)唾液腺上皮細(xì)胞GPER表達(dá)

6. DPSC-Exos治療減輕了NOD/ltj小鼠的口干癥并恢復(fù)了唾液腺功能
       作者使用NOD/ltj小鼠作為初級(jí)SS模型，該模型獨(dú)特地表現(xiàn)出唾液腺功能障礙，伴有外分泌腺中白細(xì)胞浸潤(rùn)的出現(xiàn)和許多已知遺傳差異的同源品系。按照?qǐng)D6A中所示進(jìn)行動(dòng)物研究。16周齡NOD/ltj小鼠的唾液流率較6周齡NOD/ltj小鼠降低。10周的DPSC-Exos治療穩(wěn)健地促進(jìn)了NOD/ltj小鼠的唾液流率（圖6B）。DPSC-Exos治療對(duì)唾液流率的影響甚至比羥氯喹治療（陽(yáng)性對(duì)照組）更明顯。HE染色顯示，NOD/ltj小鼠腺管周圍腺泡空泡化明顯，腺體嚴(yán)重萎縮。與PBS處理的NOD/ltj小鼠相比，在HCQ和DPSC-Exos處理的NOD/ltj小鼠中，唾液腺中淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)灶的數(shù)量和面積顯著減少（圖6C）?；贒PSC-Exos改善了NOD/ltj小鼠的唾液分泌障礙，作者接下來(lái)研究了參與唾液分泌的關(guān)鍵蛋白AQP5和GPER在下頜下腺中的表達(dá)。免疫組織化學(xué)（圖6D，E）顯示，與PBS組相比，DPSC-Exos組腺泡細(xì)胞膜上的AQP5免疫染色，特別是頂端膜上的AQP5免疫染色強(qiáng)增強(qiáng)。與PBS組相比，DPSC-Exos組的GPER表達(dá)也上調(diào)（圖6F，G）。相反，GPER常在基底膜中著色，這與AQP5免疫染色不同?？筍SA/Ro和抗SSB/La抗體與SS患者較高的發(fā)病率相關(guān)。因此，對(duì)SS的臨床診斷具有重要價(jià)值。DPSC-Exos和HCQ處理可下調(diào)NOD/ltj小鼠的抗SSA/Ro和抗SSB/La血清水平（圖6H）。作者進(jìn)行了蛋白質(zhì)印跡測(cè)定（圖6I，J）和RT-qPCR實(shí)驗(yàn)（圖6K）來(lái)檢測(cè)AQP5在小鼠下頜下腺中的表達(dá)水平。與PBS組相比，DPSC-Exos組和HCQ組AQP5的mRNA和蛋白表達(dá)水平均上調(diào)。這些數(shù)據(jù)表明，DPSC-Exos可上調(diào)下頜下腺中AQP5和GPER的表達(dá)。

圖6 DPSC-Exos治療減輕了NOD/ltj小鼠的SS樣癥狀

7. DPSC-Exos通過(guò)GPER介導(dǎo)的cAMP/PKA/CREB信號(hào)通路上調(diào)SGEC中AQP5的表達(dá)
       GPER的激活刺激cAMP的產(chǎn)生和細(xì)胞內(nèi)鈣動(dòng)員。作者分析了不同處理?xiàng)l件下SGEC中cAMP/PKA/CREB信號(hào)通路中AQP5、GPER、PKA（p-PKA）和CREB（p-CREB）4種顯著蛋白的表達(dá)。與IFN-γ組相比，DPSC-Exos組AQP5、GPER、PKA和CREB表達(dá)量較高（圖7A-E）。這一作用可被G15（GPER抑制劑）消除。不同處理?xiàng)l件下SGEC中cAMP水平的結(jié)果與蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果一致（圖7F）。AQP5在非刺激條件下存在于脂筏中，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高時(shí)，AQP5可以移動(dòng)到頂端質(zhì)膜。因此，鈣信號(hào)是AQP5短期調(diào)控的核心信號(hào)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，DPSC-Exos組的細(xì)胞內(nèi)Ca²⁺水平比IFN-γ組高約4倍，而G15處理消除了DPSC-Exos對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca²⁺水平的影響（圖7G）。這些結(jié)果表明，DPSC-Exos通過(guò)GPER介導(dǎo)的cAMP/PKA/CREB信號(hào)通路恢復(fù)了IFN-γ對(duì)SGEC的抑制功能。

圖7 DPSC-Exos通過(guò)GPER介導(dǎo)的cAMP-PKA-CREB通路減輕了IFN-γ引起的唾液腺上皮細(xì)胞（SGEC）中AQP5的表達(dá)下調(diào)

結(jié)論
       DPSC-Exos部分挽救了SS相關(guān)的炎癥誘導(dǎo)的SGEC死亡。SS相關(guān)炎癥降低了SGEC中唾液分泌標(biāo)志物AQP5的表達(dá)，而DPSC-Exos逆轉(zhuǎn)了這一作用。DPSC-Exos治療減輕了NOD/ltj小鼠的腺體炎癥并增加了唾液流率。DPSC-Exos處理上調(diào)SGEC中的GPER，進(jìn)一步激活cAMP-PKA-CREB信號(hào)通路，促進(jìn)唾液分泌。該研究結(jié)果表明DPSC-Exos可能用于SS治療。

實(shí)驗(yàn)方法
動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，免疫組織化學(xué)，CCK-8檢測(cè)，實(shí)時(shí)定量PCR（RT-qPCR），蛋白質(zhì)印跡，免疫熒光，mRNA測(cè)序，生物信息學(xué)分析，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）
參考文獻(xiàn)
Hu S, Chen B, Zhou J, Liu F, Mao T, Pathak JL, et al. Dental pulp stem cell-derived exosomes revitalize salivary gland epithelial cell function in NOD mice via the GPER-mediated cAMP/PKA/CREB signaling pathway. J Transl Med. 2023 Jun 3;21(1):361.