單細胞和空間轉(zhuǎn)錄組分析揭示了肝轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的細胞異質(zhì)性

       在這項研究中，作者使用單細胞和空間轉(zhuǎn)錄組RNA測序，全面描繪了結(jié)直腸癌(CRC)和配對良好的肝轉(zhuǎn)移的細胞格局。作者從6例結(jié)直腸癌患者的27份標本中產(chǎn)生了41,892個CD45^-非免疫細胞和196,473個CD45⁺免疫細胞，發(fā)現(xiàn)CD8_CXCL13和CD4_CXCL13亞群在肝轉(zhuǎn)移樣本中顯著增加，表現(xiàn)出高增殖能力和腫瘤激活特性，有助于改善患者的預后。在原發(fā)瘤和肝轉(zhuǎn)移瘤中觀察到不同的成纖維細胞特征。原發(fā)腫瘤中富含F(xiàn)3⁺的成纖維細胞通過表達促腫瘤因子而導致總體生存率下降。而肝轉(zhuǎn)移瘤中MCAM⁺成纖維細胞可能通過Notch信號途徑促進CD8_CXCL13細胞的產(chǎn)生。綜上所述，作者通過單細胞和空間轉(zhuǎn)錄組RNA測序，廣泛分析了原發(fā)和肝轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌細胞圖譜的轉(zhuǎn)錄差異，提供了結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移發(fā)生發(fā)展的不同維度。
       該研究于2023年6月發(fā)表發(fā)表在《Science advances》，IF：14.957。

技術(shù)路線

1、CRC原發(fā)腫瘤和CRC來源的肝轉(zhuǎn)移腫瘤的總體單細胞轉(zhuǎn)錄組圖譜
       為了闡明CRC原發(fā)腫瘤和CRC來源的肝轉(zhuǎn)移腫瘤的細胞異質(zhì)性，作者從六名CRC患者的原發(fā)結(jié)直腸癌（CC）、相鄰正常結(jié)直腸粘膜（CN）、肝轉(zhuǎn)移（LM）、相鄰正常肝組織（LN）以及外周血（PB）中收集了CD45^?非免疫細胞和CD45⁺免疫細胞進行單細胞轉(zhuǎn)錄組分析（圖1A）。經(jīng)過質(zhì)量控制和過濾，作者從27個樣本中獲得了41,892個CD45^?非免疫細胞和196,473個CD45⁺免疫細胞，并鑒定出了23個非免疫細胞簇和41個免疫細胞簇。通過基于標記物的注釋，作者從非免疫細胞中鑒定出了腫瘤細胞（EPCAM和SOX9）、成纖維細胞（COL1A1和COL1A2）和內(nèi)皮細胞（PECAM1和CD34），而從免疫細胞中鑒定出了T細胞（CD3、pAbO）、自然殺傷細胞（NK細胞）（CD56、pAbO）、B細胞/漿細胞（CD19、pAbO）、單核細胞/巨噬細胞（CD14、pAbO）、樹突狀細胞（DCs）（HLA.DRA）和肥大細胞（TPSAB1）。
       進一步對非免疫細胞主要群體進行無監(jiān)督聚類分析，得到了11個腫瘤細胞簇、8個成纖維細胞簇和6個內(nèi)皮細胞簇（圖1B）。CA2和F2_MCAM在LM中富集。F4_F3和F5_CCL11在CC中顯著富集（圖1C）。基于已知標記物的表達情況，將免疫細胞分為41個亞群（圖1D）。在原發(fā)腫瘤微環(huán)境（TME）中，調(diào)節(jié)性T細胞（Tregs）和巨噬細胞的百分比較CN對照組更高。雖然單核細胞、NK細胞和黏膜相關固有T細胞（MAIT細胞）在LN中占主導地位，但轉(zhuǎn)移腫瘤細胞對Tregs和巨噬細胞的顯著上調(diào)重塑了TIME（圖1E）?？傊髡咴贑RCLM的不同組織中鑒定出多個具有不同分布模式的細胞亞群。

2、 CRC原發(fā)腫瘤和CRC來源的肝轉(zhuǎn)移腫瘤的空間分布特征
       為了全面分析CRC原發(fā)腫瘤和CRC來源的肝轉(zhuǎn)移腫瘤的空間分布特征，作者從六名患者中收集了六個組織標本，包括四例CRC原發(fā)腫瘤（C1至C4）和兩例肝轉(zhuǎn)移腫瘤（L1和L2）。通過hematoxylin和伊紅（H&E）染色以及每個樣本的基因表達特征，識別出腫瘤區(qū)域（T）和腫瘤周圍區(qū)域（PT）（圖2A）。與腫瘤周圍組織相比，腫瘤組織富集了與細胞周期相關的通路，如G2-M檢查點、E2F靶點和有絲分裂紡錘體（圖2B）。根據(jù)基因表達譜，將腫瘤組織和腫瘤周圍組織分為不同的區(qū)域（圖2A）。考慮到每個區(qū)域包含多個細胞，作者采用了一種基于標記物的策略，將空間轉(zhuǎn)錄組（ST）和單細胞RNA測序（scRNA-seq）數(shù)據(jù)整合起來，估計每個捕獲區(qū)域中不同細胞類型的比例。在ST組織中鑒定出B細胞、T細胞、自然殺傷細胞（NK細胞）、漿細胞、髓系細胞、腫瘤細胞、成纖維細胞和內(nèi)皮細胞。這些細胞簇的比例和得分在每個區(qū)域中有所變化。與C1、C3和C4的腫瘤周圍組織相比，漿細胞的比例在腫瘤組織中下降（圖2C和2D）。

3、原發(fā)和肝轉(zhuǎn)移瘤腫瘤細胞轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性
       研究表明，人類結(jié)直腸腫瘤細胞包含多種細胞類型，其轉(zhuǎn)錄特征反映了正常結(jié)直腸上皮的特征。在正常上皮中已經(jīng)確定了干細胞樣/轉(zhuǎn)運增殖細胞、結(jié)腸細胞、腺細胞和毛刷細胞。進行了亞類聚類分析，并揭示了腫瘤細胞的不同分化譜系，即CA1到CA11。由單個腫瘤細胞產(chǎn)生的腫瘤組織可以概括出親本腫瘤的細胞多樣性。LM中的腫瘤細胞群體多樣性與CC相似（圖1C）。為了進一步研究不同腫瘤細胞簇的功能通路和轉(zhuǎn)錄程序，作者進行了基因集變異分析（GSVA）和轉(zhuǎn)錄因子（TF）分析。結(jié)果顯示，CA2富集了Wnt-β-catenin信號通路，并在CA2中上調(diào)了在Wnt-β-catenin信號通路中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子LEF1。此外，CA2表現(xiàn)出體細胞干細胞分裂通路的上調(diào)。一致的是，CA2具有最高的LGR5表達水平，這是腸道干細胞的標記物。這些結(jié)果表明，CA2可能是TME中的干細胞亞群。此外，CA2具有EPCAM、CDH1和PRSS2的高表達水平，促進腫瘤細胞的粘附和定植。總的來說，聚類鑒定和特征分析展示了腫瘤細胞的功能多樣化，轉(zhuǎn)移腫瘤能夠重現(xiàn)親本腫瘤的細胞多樣性。

4、TME重塑髓系細胞的組成
       髓系細胞是TME中異質(zhì)的亞群，作者鑒定出了三種髓系細胞：單核細胞/巨噬細胞、樹突狀細胞（DCs）和肥大細胞。通過亞類聚類分析，作者鑒定出了八個單核細胞/巨噬細胞亞群和三個傳統(tǒng)DCs（cDCs）亞群（圖3A），并且每個亞群都具有獨特的基因表達模式。每個部位的髓系細胞具有不同的分布模式（圖3B），展示了器官特異性的特征。CD14+單核細胞是PB中最富集的亞群。與腫瘤周圍組織相比，Mac_SPP1亞群在腫瘤組織中富集，而大部分Mac_SPP1亞群細胞來自原發(fā)腫瘤。此外，Mac_CXCL9的比例在LM中顯著增加（圖3C），該亞群表達CXCL9的水平較高，表明該亞群能夠招募CXCR3陽性效應T細胞進入腫瘤。Mac_SPP1亞群中富集參與招募髓系細胞，尤其是粒細胞如CXCL3的基因（圖3D）。髓系抑制性細胞可以高表達CXCR2，CXCL3的受體，并且可以通過表達精氨酸酶和誘導型一氧化氮合酶（iNOS）來抑制CD8+T細胞。GSVA分析顯示，Mac_SPP1亞群參與與炎癥反應相關的途徑。然而，Mac_CXCL9亞群在干擾素-γ（IFN-γ）反應和T細胞活化途徑中富集（圖3E）。軌跡分析顯示，Mac_CXCL9和Mac_SPP1亞群都是終末分化的，表明它們是腫瘤活化的亞群（圖3F）。
       根據(jù)細胞因子表達和功能，DCs可以分為漿細胞樣DCs（pDCs）和cDCs。在TME中已經(jīng)鑒定出不同亞群的cDCs，包括cDC1和cDC2。在作者的數(shù)據(jù)中，CC和LM中都鑒定出了cDC1（cDC_CPNE3）和cDC2（cDC_CD1c）（圖3A）。此外，在LM中還富集了cDC_LAMP3（圖3C）。cDC_LAMP3表達CCR7的水平較高（圖3G），CCR7是CCL19和CCL21的受體，表明它具有遷移至淋巴結(jié)的能力。此外，cDC_LAMP3亞群表現(xiàn)出CD40、CD80和CD86這些共刺激分子的高表達水平，這是DC成熟的標記物（圖3H）。cDC_LAMP3亞群的百分比在LM中顯著增加，表明TIME中腫瘤細胞的增長。

5、CXCL13+T細胞在肝轉(zhuǎn)移腫瘤中的富集
       T細胞，特別是CD8+ T細胞和CD4+ T細胞，在適應性免疫應答中起主導作用。在T細胞中，鑒定出了七個CD8+ T細胞簇，五個傳統(tǒng)CD4+ T（cCD4）細胞簇和兩個調(diào)節(jié)性T細胞（Tregs）簇。CD8+ T細胞和CD4+ T細胞都包括表達CXCL13的簇，這是CXCR5的趨化因子（圖4A、B）。與LN相比，CD8_CXCL13細胞的百分比在LM中顯著增加；然而，在CN、LN和PB中很少檢測到這個亞群（圖4C和D）。在結(jié)腸的穩(wěn)態(tài)下，大約3%至12%的CD4細胞為CXCL13陽性，這被稱為濾泡性輔助T細胞（TFH）。在CC中，CD4_CXCL13的百分比下降，但與LN相比，在LM中這個亞群的百分比增加（圖4E）。
       為了進一步研究CXCL13+ T亞群的特征，作者分析了每個亞群中上調(diào)的通路。GSVA分析顯示，CD8_CXCL13亞群富集了T細胞增殖通路，而CD4_CXCL13亞群富集了G2-M檢查點通路，顯示出這兩個亞群的增殖特性（圖4F和G）。每個簇的基因分析顯示，CD8_CXCL13細胞表達ITGAE的水平較高，ITGAE是組織駐留記憶T（TRM）細胞的標記物?？紤]到TRM細胞也是CD69陽性的，作者通過流式細胞術(shù)鑒定了CD69+CD103+CD8+ T細胞。大多數(shù)CD103+細胞是CD69陽性細胞，而CD69+CD103+CD8+ T細胞在LN中很少出現(xiàn)。一致地，來自CC和LM的CD69+CD103+CD8+ T細胞中Ki67的表達水平高于其他CD8+ T細胞。來自CN和LN的不同CD8+ T細胞亞群的增殖特性幾乎相同（圖4H）。綜上所述，這些結(jié)果表明，由于其高增殖能力，CD8_CXCL13和CD4_CXCL13細胞在CRC的LM中上調(diào)。

6、CXCL13+T細胞與結(jié)直腸癌患者預后良好相關
       在上述結(jié)果中，作者展示了與CD4_CXCL13亞群相比，CD8_CXCL13在CC和LM中富集（圖4D和E），這表明CD8_CXCL13細胞可能是一種激活腫瘤的亞群。因此，作者進一步研究了CD8_CXCL13亞群的特征。與其他亞群相比，CD8_CXCL13亞群中觀察到了PDCD1、HAVCR2、LAG3、CTLA4和TIGIT等耗竭標記物的高水平（圖5A和B）。先前的研究顯示，由于持續(xù)的腫瘤抗原刺激，腫瘤反應性T細胞表現(xiàn)出衰竭表型，而衰竭表型表明它們的腫瘤反應性。軌跡分析顯示，CD8_CXCL13細胞是終末分化的（圖5C）。此外，CXCL13+ T細胞亞群在TME中表現(xiàn)出顯著的克隆擴增能力，進一步表明它們具有抗原經(jīng)歷的特性。此外，CD8_CXCL13亞群還表達高水平的效應分子，如GZMB（圖5A和B），這表明該亞群可能保留了部分抗腫瘤功能。由于在組織中檢測CXCL13較為困難，作者嘗試使用CD69和CD103來標記CXCL13+細胞，免疫組織化學（IHC）結(jié)果顯示，在腫瘤組織中，CD69+CD103+CD8+ T細胞與CK19+腫瘤細胞更加接近（圖5D和E），有利于它們的抗腫瘤功能。值得注意的是，CD103+CD8+ T細胞存在于結(jié)直腸癌組織的第三淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)（TLS），TLS評分較高的患者CD8_CXCL13評分也較高，這表明該亞群可能參與了TLS的形成（圖5F和G）。
       為了探索CXCL13+ T細胞在結(jié)直腸癌中的預后價值，作者將來自基因表達庫（GEO）隊列的結(jié)直腸癌患者分為CXCL13高表達組和CXCL13低表達組，并發(fā)現(xiàn)CC中CXCL13的高表達預示著更好的總體生存率（圖5H）?？傊?，富集在TME中的CXCL13+ T細胞是一種對腫瘤具有反應性的亞群，并有助于結(jié)直腸癌患者的良好預后。

7、原發(fā)和肝轉(zhuǎn)移結(jié)的直腸癌中存在不同的成纖維細胞亞群
       成纖維細胞是TME中非免疫細胞的主要類型。作者進一步表征成纖維細胞，探索它們在原發(fā)結(jié)直腸癌和肝轉(zhuǎn)移腫瘤中的異質(zhì)性。在結(jié)直腸癌的TME中鑒定出八個具有獨特基因表達模式的成纖維細胞亞群，分別被命名為F1_PRELP、F2_MCAM、F3_HAS1、F4_F3、F5_CCL11、F6_IGFL2、F7_COCH和F8_MKI67（圖6A）。F2_MCAM亞群在LM中的比例高于CC。F4_F3和F5_CCL11亞群大部分由CC來源的細胞組成（圖6B）。根據(jù)批量RNA測序數(shù)據(jù)，F(xiàn)4_F3的浸潤在CC中增加，與CN相比。然而，根據(jù)軌跡分析，F(xiàn)5_CCL11亞群在CC中的比例降低，可能轉(zhuǎn)變?yōu)镕4_F3亞群（圖6C）。軌跡分析還預測F2_MCAM和F4_F3是兩個不同的終末分化亞群（圖6C）。IHC分析驗證了F2_MCAM在CC和LM中的存在（圖6D）。根據(jù)IHC結(jié)果，MCAM+CAF在LN中非常罕見。大部分MCAM+細胞是內(nèi)皮細胞。然而，與單細胞分析一致，F(xiàn)4_F3亞群只存在于CC中，而在LM中不存在，這可能是由于LN中缺乏F4_F3而CN中存在的現(xiàn)象（圖6E和F）。ST分析也證實，在CC中F4_F3亞群的浸潤要比LM中多（圖6G和H）。F4_F3亞群緊密包圍CN和CC中的上皮細胞，促進其與上皮細胞的相互作用（圖6I）。此外，F(xiàn)4_F3在CC中的增加可能導致更差的預后（圖6J）。總之，作者觀察到原發(fā)結(jié)直腸癌和肝轉(zhuǎn)移腫瘤之間的成纖維細胞具有不同的表型特征和高度可變的頻率，這表明在不同癌癥環(huán)境中TME內(nèi)存在細胞異質(zhì)性。

8、原發(fā)腫瘤中富集表達F3的成纖維細胞亞群分泌促腫瘤因子，與結(jié)直腸癌患者預后不良有關
       為了研究在CC和LM中富集的不同成纖維細胞對TME的重塑作用，作者進一步分析了F2_MCAM和F4_F3的特征。F2_MCAM富集了JAG1和NOTCH3，這兩者參與了NOTCH信號通路。F4_F3富集了C3和CXCL1，表明該亞群參與了補體和炎癥反應通路（圖7A和B）。F4_F3還高表達MMP2和MMP3，這可能與細胞外基質(zhì)的組織結(jié)構(gòu)有關（圖7A）。此外，F(xiàn)4_F3還富集了參與血管生成和腫瘤浸潤的促腫瘤因子，如VEGFA、NRG1、HGF、GDF15、AREG和BMP2（圖7C）。F4_F3與腫瘤細胞之間的相互作用分析進一步揭示了它們通過NRG1和Erb-B2受體酪氨酸激酶3（ERBB3）信號通路進行交流，而ERBB3幾乎富集在腫瘤細胞中，并可以與ERBB2形成異源二聚體，促進腫瘤細胞增殖并使CRC患者對西妥昔單抗產(chǎn)生耐藥性（圖7D）。ST分析還顯示了F3與NRG1的共定位，圍繞著ERBB3+腫瘤細胞（圖6G和圖7E至I）。跨膜遷移實驗顯示重組人NRG1（rNRG1）可以促進RKO和SW620細胞的遷移（圖7J）。高表達F3和NRG1的CRC患者預后較差（圖7K）。這些結(jié)果表明，富集于CC的F4_F3成纖維細胞通過分泌促腫瘤因子可能導致CRC患者預后不佳。

9、LM TME中表達MCAM的成纖維細胞通過Notch信號通路調(diào)節(jié)CD8_CXCL13細胞的產(chǎn)生
       在CD8_CXCL13和CD4_CXCL13亞群中，Notch信號通路的轉(zhuǎn)錄因子RBPJ表達較高（圖5A）。有報道稱，Notch信號通路可以通過配體和受體的相互作用來激活。在與其配體相互作用后，Notch的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域可以被切割并轉(zhuǎn)位到細胞核中，調(diào)控其靶基因的轉(zhuǎn)錄。LM中RBPJ的表達與CXCL13和ITGAE呈正相關，而在CC中未觀察到這種關聯(lián)（圖8A）。CD8_CXCL13和CD4_CXCL13亞群主要表達NOTCH1受體（圖8B）。為了進一步了解哪些細胞類型在CD8_CXCL13和CD4_CXCL13亞群中調(diào)控Notch信號通路，作者分析了Notch配體的表達水平，包括DLL1、DLL3、DLL4、JAG1和JAG2，發(fā)現(xiàn)Notch配體主要在成纖維細胞和內(nèi)皮細胞中表達。F2_MCAM亞群富集了JAG1，F(xiàn)5_COCH亞群富集了DLL1，而E2_DLL4亞群富集了DLL4、JAG1和JAG2（圖8C）。使用CellPhone DB進行的Notch及其配體的相互作用分析顯示，在內(nèi)皮細胞中，E2_DLL4亞群與CXCL13+ T細胞之間的相互作用最強，而在成纖維細胞中，F(xiàn)2_MCAM亞群通過JAG1-NOTCH1與CD8_CXCL13和CD4_CXCL13亞群相互作用（圖8D）。由于成纖維細胞在TME中的分布呈散點狀，作者推測F2_MCAM亞群有助于激活CXCL13+ T細胞中的Notch信號通路。
       接下來，作者根據(jù)LM中F2_MCAM的比例將患者分為兩組，并發(fā)現(xiàn)F2_MCAM高的LM中CD8_CXCL13亞群比例較高（圖8E）。通過GEO數(shù)據(jù)集分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)2_MCAM浸潤評分較高的患者在LM中CD8_CXCL13亞群的浸潤評分也較高，但在CD4_CXCL13亞群和CC中未觀察到類似的關聯(lián)（圖8F）。此外，作者通過ST檢測了LM中F2_MCAM和CD8_CXCL13的位置。與單細胞結(jié)果一致，F(xiàn)2_MCAM浸潤評分較高的區(qū)域在ST樣本中CD8_CXCL13的浸潤評分也較高（圖8G和圖8H）。此外，LM中Notch信號通路的相互作用強度比CC中更強，這可能是由于LM中F2_MCAM亞群的比例較高（圖6B）。
       已有研究報道Notch信號通路調(diào)控CD8+ T細胞的抗腫瘤免疫，但對于Notch信號通路是否可以調(diào)控CXCL13的表達了解甚少。為了探索這種調(diào)控作用，作者使用JASPAR（http://jaspar.genereg.net/）預測了RBPJ在CXCL13啟動子上的結(jié)合位點。發(fā)現(xiàn)了幾個潛在的結(jié)合位點，表明RBPJ可能作為轉(zhuǎn)錄因子影響CXCL13的表達。

10、ST組織中的細胞間相互作用網(wǎng)絡
       作者還研究了原發(fā)腫瘤和肝轉(zhuǎn)移瘤的ST中不同簇之間的細胞相互作用。結(jié)果顯示，VEGFA-NRP1和VEGFA-NRP2配體受體對在原發(fā)腫瘤和肝轉(zhuǎn)移瘤中都富集。作者還發(fā)現(xiàn)CC和LM之間存在不同的富集配體受體對。ERBB3-NRG1配對在C1和C3中富集，但在L1和L2中不存在（圖9A），這表明ERBB3-NRG1相互作用在原發(fā)腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移中可能具有潛在作用。
       綜上所述，作者發(fā)現(xiàn)在CRC原發(fā)腫瘤中富集的F3+成纖維細胞可以通過產(chǎn)生包括NRG1在內(nèi)的各種促腫瘤因子來調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)展和/或遷移，這些因子與腫瘤細胞表達的ERBB3相互作用以發(fā)揮其促腫瘤功能。然而，在LM中富集的MCAM+成纖維細胞可以通過Notch信號通路調(diào)節(jié)CD8_CXCL13細胞的生成，與CC中的促腫瘤亞群F3+成纖維細胞不同，這表明不同癌癥環(huán)境中間質(zhì)細胞的細胞異質(zhì)性（圖9B）。

實驗方法
組織加工與細胞分選、scRNA-seq、無監(jiān)督的細胞聚類和標注、ssGSEA、GSVA、SCENIC、Monocle2、Spatial-seq、流式細胞術(shù)、CellPhone DB、IHC染色、生存分析、基因表達相關性分析、Transwell遷移率分析。
參考文獻
Wang F, Long J, Li L, Wu ZX, Da TT, Wang XQ, Huang C, Jiang YH, Yao XQ, Ma HQ, Lian ZX, Zhao ZB, Cao J. Single-cell and spatial transcriptome analysis reveals the cellular heterogeneity of liver metastatic colorectal cancer. Sci Adv. 2023 Jun 16;9(24):eadf5464. doi: 10.1126/sciadv.adf5464. Epub 2023 Jun 16.