腸道菌群紊亂遍及早期帕金森病、REM睡眠行為障礙及其一級親屬

       微生物-腸-腦軸被認為在帕金森病（Parkinson ' s disease，PD）中發(fā)揮重要作用。在本研究中，作者對早期PD、REM睡眠行為障礙（RBD）、RBD一級親屬（RBD-FDR）和健康對照人群進行了腸道菌群的橫斷面研究，以反映PD的腸-腦分期模式。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組和RBD-FDR相比，早期PD和RBD的腸道菌群組成發(fā)生了顯著變化。在控制了抗抑郁藥、滲透性瀉藥和排便頻率等潛在的混雜因素后，RBD和RBD-FDR中已經(jīng)出現(xiàn)了產(chǎn)CH3(CH2)2COOH鹽細菌的耗竭和促炎柯林斯氏菌的富集。隨機森林模型確定了12個有效區(qū)分RBD和對照的微生物標(biāo)記。這些發(fā)現(xiàn)表明，PD樣腸道菌群失調(diào)發(fā)生在RBD發(fā)生時的PD前驅(qū)期，并在較年輕的RBD-FDR受試者中開始出現(xiàn)。該研究將具有病因?qū)W和診斷意義。本研究于2023年5月發(fā)表于期刊《Nature Communications》上，IF：16.6。
技術(shù)路線

主要研究內(nèi)容
1、社會人口學(xué)和臨床特征
       本研究包括來自香港地區(qū)v-PSG診斷的RBD及RBD家系隊列的452例受試者的糞便樣本。在剔除11個低read count的樣本后，共有441個樣本留作進一步分析（圖1）。所有早期PD患者均為臨床確診的PD，運動癥狀起病時間小于5年?？刂疲╪ = 108，年齡67.3 ± 7.0歲，男性占63.9%）與RBD（n = 170，年齡68.6 ± 7.6歲，男性占73.5%）及早期PD組（n = 36，67.8 ± 5.6歲，男性占86.1%）進行年齡、性別匹配。與RBD-FDR（n=127，q值< 0.05）組相比，三組患者年齡均較大，男性均較多。RBDQ-HK問卷所捕獲的RBD特征的嚴(yán)重程度從對照、RBD-FDR到RBD和PD早期（RBDQ-HK總分，6.3 ± 7.0 vs 9.2 ± 8.4 vs 39.2 ± 17.7 vs 32.8 ± 16.1，P值< 0.001）均顯著增加。127例RBD-FDR中，11例（8.7%）經(jīng)結(jié)構(gòu)化臨床訪談確診為疑似RBD。前驅(qū)期PD的總似然比（LR）是用于識別有前驅(qū)期PD風(fēng)險的受試者的研究標(biāo)準(zhǔn)。
       胃腸道癥狀采用成人羅馬Ⅳ診斷問卷和帕金森病自主神經(jīng)量表進行評估。從對照、RBD-FDR、RBD到早期PD患者（8.3 vs 9.4 vs 45.3 vs 69.4%，P值< 0.001），功能性便秘的患病率呈增加趨勢。排便費力是功能性便秘的核心特征，即使在調(diào)整了年齡和性別（8.8 vs 15.8 vs 45.4 vs 68.6%，P值< 0.001）后，四組人群的排便費力程度仍呈進行性增加。此外，作者使用排便頻率評分[ BMF，取值范圍為1（大便次數(shù)> 1次/天）~ 6（≤1 /周）]和大便性狀一致性（Bristol糞便性狀量表（Bristol Stool Form Scale，BSFS）反向計分，分?jǐn)?shù)越高表示糞便越硬）作為結(jié)腸傳輸時間的代理指標(biāo)，這兩個指標(biāo)在四組（P值均< 0.001）中均表現(xiàn)出增加的趨勢。其他胃腸功能紊亂，如腸易激綜合征和功能性腹瀉，各組間無差異。
       在臨床特征方面，與對照組和RBD-FDR（所有q值均< 0.05）28相比，RBD患者報告了更多的終生重性抑郁障礙和焦慮障礙。其他潛在的混雜人類疾病，如糖尿病和血脂異常，在四組人群中分布相似。用藥情況指在大便收集期間服用的任何藥物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超過一半的RBD和早期PD患者服用苯二氮卓類藥物，而分別有30.6%和13.9%的早期PD患者和5.3%和25.3%的RBD患者服用滲透性瀉藥和抗抑郁藥。在PD特異性藥物中，47.2%的早期PD患者接受了卡比多巴/左旋多巴，其次為單胺氧化酶B抑制劑（41.7%）、多巴胺激動劑（8.3%）、鹽酸苯海索（5.6%）、兒茶酚- O-甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑（2.8%）。

圖1 課題選擇和招募流程圖

2、腸道菌群組成隨α-突觸核蛋白病的進展而改變
       從441份糞便樣品中共鑒定出84個科，249個屬。作者觀察到屬水平的alpha多樣性（Chao 1、Gini Simpson和Shannon指數(shù)）在組間具有可比性。使用變調(diào)的多變量方差分析（PERMANOVA，99，999個置換），調(diào)整年齡和性別，評估每對組間微生物組成（即β多樣性）的個體間差異。與對照組（R2 = 0.035，q值< 0.001）相比，早期PD組呈現(xiàn)明顯的菌群聚集模式。同樣，RBD的菌群組成與早期PD（R2 = 0.008，q值= 0.066）相似，但與對照組和RBD-FDR（所有q值< 0.001）差異顯著。微生物組成分析發(fā)現(xiàn)，對照組和RBD-FDR之間沒有顯著差異（圖2b）。盡管如此，早期PD、RBD和對照組的腸道菌群組成仍將得到組間主成分比較和主坐標(biāo)（PCo A）分析的不同聚類模式的支持，分別如圖2所示。

圖2 在α-突觸核蛋白病的前驅(qū)和早期階段改變了微生物組成

3、腸道微生物在α-突觸核蛋白病的前驅(qū)期和早期階段逐漸發(fā)生改變
       在過濾掉低豐度（< 10%）和豐度（< 0.05%）的類群后，共剩余36科88屬用于差異豐度分析。屬的Read count表通過中心對數(shù)比（CLR）變換被重新框定為組成型數(shù)據(jù)。作者發(fā)現(xiàn)35.2%的屬（n = 31）與α-突觸核蛋白?。↘endall ' s tau-b相關(guān)性，q值< 0.05）的4個階段顯著相關(guān)。在這些菌屬中，Butyricicoccus和Faecalibacterium與疾病進展（Kendall ' s τb =-0.204和- 0.198，q值< 0.001，圖3c）的相關(guān)性最強，而Faecalibacterium也是第一主成分變異的主要貢獻者，如圖3d所示。
       采用克魯斯卡爾- Wallis檢驗對差異類群進行分析，發(fā)現(xiàn)4個類群（q值< 0.05）之間存在顯著差異的有16科26屬。應(yīng)用微生物組多變量線性模型（MaAsLin 2）進一步評估對照、RBD-FDR、RBD和早期PD之間的關(guān)聯(lián)。模型包括四個階段，（參照=對照）為固定效應(yīng)，家庭id為隨機效應(yīng)。與對照（未經(jīng)校正的MaAsLin 2，所有q值< 0.05，圖3a）相比，42個差異類群中有19個（45.2%），包括產(chǎn)CH3(CH2)2COOH菌（如羅斯氏菌、毛螺菌科_ND3007_group、毛螺菌屬、[真細菌]_Ventriosum_group、Butyricicoccus、Faecalibacterium和家族毛螺菌科等）、產(chǎn)H2S菌脫硫弧菌屬、粘蛋白降解菌Akkermansia、柯林斯菌屬、Oscillospiraceae_UCG-002和- 005，在RBD和早期PD中顯著改變。當(dāng)進一步將年齡和性別作為固定效應(yīng)納入Ma As Lin 2模型（調(diào)整后的MaAsLin 2）時，這些關(guān)聯(lián)仍然在q值< 0.1時顯著。
       有趣的是，在調(diào)整的（β = 0.58，q值= 0.035）和未調(diào)整的（β = 0.49，q值= 0.038）模型中，促炎柯林斯氏菌的富集已經(jīng)出現(xiàn)在α-突觸核蛋白病的早期前驅(qū)階段RBD-FDR中（圖3a、e）。此外，與對照組（β =-0.54，q值= 0.069）相比，作者觀察到RBD-FDR中產(chǎn)CH3(CH2)2COOH鹽的[真細菌]_Ventriosum_group邊緣減少。進一步分析發(fā)現(xiàn)，與不具有可能RBD特征（CLR豐度，-0.36 ± 1.8 vs 0.35 ± 1.7，q值= 0.028，補充圖3）的RBD-FDR相比，具有可能RBD特征（n = 11）的RBD-FDR在[真細菌]_ventriosum_group中出現(xiàn)了更明顯的下降。

圖3 α-突觸核蛋白病前驅(qū)和早期腸道微生物的差異

4、腸道微生物群作為RBD的潛在診斷生物標(biāo)志物
       基于RBD患者體內(nèi)的微生物變化，作者進一步研究了利用微生物標(biāo)志物預(yù)測RBD狀態(tài)。在訓(xùn)練集（占整個數(shù)據(jù)庫的80%）中用隨機森林算法搭建機器學(xué)習(xí)模型，在剩余數(shù)據(jù)（即測試集）中測試訓(xùn)練好的模型的性能。特征矩陣由88個篩選屬的CLR豐度組成，特征選擇基于10折交叉驗證的25次重復(fù)的遞歸特征消除（RFE）算法。在訓(xùn)練集中，微生物標(biāo)記物可以區(qū)分RBD和對照，其受試者工作特征曲線下的平均面積（AUC）為0.79（[ 95% CI ] = [ 0.78，0.80 ]，見圖4b）。對于獨立測試集，預(yù)測模型的平均準(zhǔn)確率為0.68（[ 95% CI ] = [ 0.66，0.70 ]），AUC為0.75（[ 95% CI ] = [ 0.73，0.78 ]，見圖4c）。特征選擇顯示，88個屬中有12個至少出現(xiàn)在訓(xùn)練好的模型最終特征集中的60%（15/25）。
       基于腸道菌群的分類器在區(qū)分RBD和RBD-FDR方面也表現(xiàn)出良好的性能，在測試集中的平均準(zhǔn)確率為0.67（[ 95% CI ] = [ 0.66，0.69 ]），AUC為0.72（[ 95% CI ] = [ 0.69，0.74 ]，圖4d）。

圖4 隨機森林模型預(yù)測RBD狀態(tài)

5、宿主因素對α-突觸核蛋白病前驅(qū)和早期的微生物群有影響
       進一步，作者檢測了宿主因素對α-突觸核蛋白病不同階段微生物變化的影響。評估社會人口學(xué)（年齡和性別）、BMF評分和對微生物群具有混雜效應(yīng)的藥物（包括抗抑郁藥和苯二氮卓類藥物）。精神疾病與抗抑郁藥物使用（卡方檢驗，P值= 5.3 × 10-22）高度相關(guān)，不作為協(xié)變量納入。建立包括每對分組和所有協(xié)變量的多元統(tǒng)計模型（PERMANOVA，99，999個置換），而PD特異性藥物（卡比多巴/左旋多巴、MAO-B抑制劑和多巴胺激動劑）僅在涉及早期PD組的比較中進行評估。在目前的模型中，作者仍然觀察到與對照（所有q值均< 0.001）相比，RBD和早期PD中的微生物組成發(fā)生了顯著的變化。除分組因素外，BMF評分、性別、滲透性瀉劑和質(zhì)子泵抑制劑（PPIs）使用等協(xié)變量與微生物組成的相關(guān)性較強，而年齡、他汀類藥物、抗抑郁藥、苯二氮卓類藥物和PD特異性藥物對組成變化的影響較?。▓D5b）。
       應(yīng)用Ma As Lin 2檢驗分類單元豐度與協(xié)變量的相關(guān)性。模型包括四個階段（參照=對照）和所有協(xié)變量作為固定效應(yīng)，家庭id作為隨機效應(yīng)。此外，對早期PD組的分類群豐度進行單獨建模，以評估單個分類群對PD特異性藥物的反應(yīng)。將Ma As Lin 2檢驗得到的顯著關(guān)聯(lián)（q值< 0.25）繪制在圖5a中。作者發(fā)現(xiàn)產(chǎn)CH3(CH2)2COOH菌（如毛螺菌屬、[真細菌]_Ventriosum_group、Butyricicoccus等）的耗竭在RBD和早期PD中仍然顯著。同樣，與對照相比，RBDFDR中柯林斯菌屬增加，[真細菌]_Ventriosum_group顯著減少。在協(xié)變量方面，BMF得分與分類單元豐度之間的關(guān)聯(lián)是廣泛的，類似于疾病進展。特別是BMF（較慢的結(jié)腸轉(zhuǎn)運）得分較高與Butyricicoccus（β=-0.34，q值= 0.009）和Oscillospiraceae_UCG-005（β = 0.32，q值= 0.003）豐度較低和較高分別與強相關(guān)（圖5a-c）。特別地，作者觀察到在作者的數(shù)據(jù)中抗抑郁藥的使用和RBD /早期PD富集的屬（例如Akkermansia和UBA1819）有很強的共現(xiàn)性（圖5c）。

圖5 α-突觸核蛋白病前驅(qū)和早期宿主-微生物組相互作用

6、便秘（排便頻率）介導(dǎo)菌群對α-突觸核蛋白病的影響
       既往研究提示腸道菌群失調(diào)與便秘之間存在雙向因果關(guān)系30?？紤]到即使在調(diào)整了排便頻率后，RBD和RBD-FDR中不同的微生物變化仍然存在，作者進一步假設(shè)便秘可能并不完全是一個混雜因素，而是連接腸道微生物群和α-突觸核蛋白病的潛在因果通路中的一個中介因素。因此，作者在控制、RBD-FDR和RBD患者（n = 405）中進行了中介分析。以前驅(qū)期PD（排除RBD、便秘等條目）的總似然比為結(jié)局，第一主成分（由PCo A分析得）的值和BMF score分別為暴露和中介建立模型。作者發(fā)現(xiàn)大約30%的腸道菌群對前驅(qū)期PD的總效應(yīng)通過中介物（即BMF評分），表明了從腸道菌群失調(diào)、便秘到α-突觸核蛋白病的潛在因果關(guān)系方向（圖6）。

圖6 排便頻率的中介作用

7、前驅(qū)期和早期α-突觸核蛋白病的微生物代謝變化
       最后，作者使用PICRUSt2（通過重建未觀測狀態(tài)對群落進行系統(tǒng)發(fā)育研究）分析來識別在α-突觸核蛋白病前驅(qū)期和早期階段存在差異的MetaCyc通路?？唆斔箍? Wallis檢驗顯示四組（q值< 0.05）之間有18條代謝通路存在顯著差異。與之前在PD患者中的研究結(jié)果一致，作者觀察到在前驅(qū)期和早期α-突觸核蛋白?。碦BD或早期PD）（MaAsLin2，q值< 0.05）中，短鏈脂肪酸代謝（發(fā)酵產(chǎn)乳酸、乙醇和乙酸）和碳水化合物生物合成途徑富集，而輔因子和維生素生物合成（B1、B2、B12）減少。
       進一步的多變量關(guān)聯(lián)分析顯示，前驅(qū)期和早期α-突觸核蛋白病中碳水化合物生物合成的富集似乎受到BMF評分、年齡和他汀類藥物使用的顯著影響。類似地，B族維生素合成途徑的耗竭與性別、苯二氮卓類藥物和滲透性瀉劑使用密切相關(guān)。然而，在RBD-FDR、RBD和早期PD中，改變的微生物脂肪酸代謝（SCFA轉(zhuǎn)化為乳酸和乙醇）和pre Q0生物合成（7-去氮嘌呤生物合成），即使在調(diào)整了所有潛在的協(xié)變量后，仍然相對于對照顯著。此外，與RBD-FDR組相比，對照組中維生素B12生物合成的補救途徑和從頭合成途徑顯著富集。

圖7 前驅(qū)期和早期α-突觸核蛋白病的微生物代謝變化

實驗方法
16S V3-V4 rRNA數(shù)據(jù)處理，差異豐度分析，Random forest classification，宿主-微生物相互作用分析，Mediation analysis，16S標(biāo)記序列的功能預(yù)測
參考文獻
Huang B, Chau SWH, Liu Y, Chan JWY, Wang J, Ma SL, Zhang J, Chan PKS, Yeoh YK, Chen Z, Zhou L, Wong SH, Mok VCT, To KF, Lai HM, Ng S, Trenkwalder C, Chan FKL, Wing YK (2023) Gut microbiome dysbiosis across early Parkinson's disease, REM sleep behavior disorder and their first-degree relatives. Nat Commun.;14(1):2501. doi: 10.1038/s41467-023-38248-4.