B4GALT1通過(guò)多水平調(diào)控PD-L1的表達(dá)來(lái)促進(jìn)肺腺癌的免疫逃逸

       隨著肺癌篩查的普及和計(jì)算機(jī)斷層掃描在臨床實(shí)踐中的應(yīng)用，檢出的肺結(jié)節(jié)數(shù)量明顯增加，其中許多為原位腺癌（AIS）、微浸潤(rùn)性腺癌（MIA）和浸潤(rùn)性腺癌（IAC）。手術(shù)切除后，AIS和MIA的5年生存率均接近100%，而IAC則沒(méi)有如此好的生存獲益。多個(gè)專業(yè)學(xué)會(huì)修訂了肺腺癌（LUAD）及其癌前病變的分類，包括從不典型腺瘤樣增生（AAH）到AIS、MIA和最終IAC的逐步進(jìn)化譜。之前的研究描述了AIS、MIA和IAC的基因組、免疫和代謝情況，這可能有助于早期癌癥的檢測(cè)和預(yù)防。然而，對(duì)于早期肺腺癌從MIA到IAC的發(fā)展軌跡，仍然缺乏深入的分子事件。多原發(fā)肺癌（MPLC）是指同一患者存在多個(gè)獨(dú)立來(lái)源的腫瘤，常以多個(gè)肺結(jié)節(jié)的形式出現(xiàn)，多為MIA或IAC。同一腫瘤龕內(nèi)不同病灶的比較可以排除患者遺傳背景差異造成的偏倚，從而更深入地了解MIA向AIS進(jìn)展過(guò)程中腫瘤內(nèi)部的分子改變。β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶1（B4GALT1），一個(gè)與N-糖合成相關(guān)的基因，在早期肺腺癌的進(jìn)展中至關(guān)重要。N-糖基化模式有助于許多致癌蛋白的穩(wěn)定性和活性，從而促進(jìn)癌癥進(jìn)展。B4GALT1通過(guò)將β-1,4鏈半乳糖轉(zhuǎn)移到受體糖，參與N-糖基化的形成，越來(lái)越多的證據(jù)表明該蛋白與腫瘤的生物學(xué)和進(jìn)展相關(guān)。然而，B4GALT1在肺癌中的作用及其潛在的分子機(jī)制尚不清楚。該研究發(fā)表在《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》，IF：11.3。
技術(shù)路線

主要研究結(jié)果
1. B4GALT1是早期肺腺癌發(fā)生的關(guān)鍵因子
       作者收集了4例MPLC患者的8例LUAD樣本，圖1A總結(jié)了其影像組學(xué)特征和臨床病理特征。每例患者的兩個(gè)原發(fā)腫瘤病理類型不同，MIA或IAC。然后，作者進(jìn)行了RNA測(cè)序，以探索驅(qū)動(dòng)這些樣本中侵襲前LUAD進(jìn)展為侵襲性LUAD的關(guān)鍵分子事件（圖1B）。隨后，作者利用UMAP對(duì)RNA測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行了無(wú)監(jiān)督聚類，發(fā)現(xiàn)了與這4例患者的MIA和IAC病變完全對(duì)應(yīng)的兩個(gè)聚類（圖1C），提示MIA和IAC具有不同的轉(zhuǎn)錄特征。GO和KEGG分析顯示，IAC中高表達(dá)的基因顯著富集于葡萄糖代謝通路（圖1D）。此外，隨著β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性信號(hào)通路的富集，N-糖的生物合成也被發(fā)現(xiàn)，表明糖基化在早期肺癌的發(fā)展中起關(guān)鍵作用。作為糖基化的一種類型，N-糖基化模式可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，而β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶是參與N-糖基生物合成的關(guān)鍵酶。B4GALT1，一個(gè)編碼β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的基因，是IAC樣本中上調(diào)最顯著的基因。因此，作者推測(cè)B4GALT1可能在早期肺腺癌MIA向IAC演變過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。對(duì)TCGA-LUAD數(shù)據(jù)的進(jìn)一步分析表明，B4GALT1 mRNA表達(dá)確實(shí)在早期LUAD中隨著分期增加而增加，但在晚期LUAD中沒(méi)有（圖1E）。此外，GSE166720數(shù)據(jù)集根據(jù)病理分級(jí)將53例早期肺腺癌分為惰性（AIS和MIA）和浸潤(rùn)性腫瘤（IAC），結(jié)果顯示侵襲性腫瘤中的B4GALT1 mRNA表達(dá)高于惰性腫瘤（圖1F）。此外，B4GALT1高表達(dá)預(yù)測(cè)TCGA-LUAD患者較差的DFS和OS（圖1G-H）。在GSE31210數(shù)據(jù)集的I期和II期LUAD患者中，高B4GALT1也預(yù)示著較差的OS（圖1I）。綜上所述，B4GALT1可能在早期肺腺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

圖1 B4GALT1是早期肺腺癌發(fā)生的關(guān)鍵因子

2. B4GALT1在體內(nèi)外調(diào)控肺腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移
       通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)和EdU實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證B4GALT1對(duì)細(xì)胞增殖的影響。MTT結(jié)果顯示，B4GALT1敲低后細(xì)胞活力明顯下降。相反，B4GALT1過(guò)表達(dá)增加了細(xì)胞活力（圖2A）。同樣，EdU實(shí)驗(yàn)顯示B4GALT1對(duì)LUAD細(xì)胞增殖有顯著影響（圖2B）。集落形成實(shí)驗(yàn)表明B4GALT1表達(dá)對(duì)克隆形成能力也有影響（圖2C）。此外，B4GALT1敲低顯著誘導(dǎo)LUAD細(xì)胞凋亡（圖2D）。然后，作者確定B4GALT1是否通過(guò)改變細(xì)胞周期影響LUAD細(xì)胞增殖。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，B4GALT1敲低伴隨著G1/G0期的細(xì)胞周期阻滯（圖2E）。

圖2 B4GALT1在體內(nèi)外調(diào)節(jié)肺腺癌細(xì)胞的增殖

       接下來(lái)，作者檢測(cè)了B4GALT1對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲的潛在影響。在傷口愈合試驗(yàn)中，B4GALT1表達(dá)顯著損害了傷口閉合（圖3A）。Transwell實(shí)驗(yàn)也表明B4GALT1的敲低阻礙了腫瘤的遷移。相反，B4GALT1過(guò)表達(dá)顯著促進(jìn)細(xì)胞遷移（圖3B）。此外，B4GALT1敲低抑制了LUAD細(xì)胞通過(guò)基質(zhì)侵襲，而B(niǎo)4GALT1過(guò)表達(dá)促進(jìn)了LUAD細(xì)胞的侵襲（圖3C）。
       作者將A549細(xì)胞注射到BALB/c裸鼠皮下，以確定B4GALT1是否影響體內(nèi)LUAD腫瘤的生長(zhǎng)。B4GALT1敲低組的腫瘤體積較對(duì)照組明顯減小。在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，B4GALT1敲低組的腫瘤平均重量顯著低于對(duì)照組（圖3D）。此外，Ki67染色顯示，在B4GALT1敲低形成的腫瘤中，Ki67陽(yáng)性細(xì)胞的比例降低（圖3E）。

圖3 B4GALT1調(diào)控肺腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲

3. B4GALT1限制了CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)和活性
       通過(guò)對(duì)IAC中高表達(dá)基因的GO分析，作者還發(fā)現(xiàn)了與T細(xì)胞免疫應(yīng)答相關(guān)功能的基因的富集（圖1D）。既往研究報(bào)道，在從MIA到IAC的LUAD進(jìn)展過(guò)程中，免疫抑制增強(qiáng)。因此，作者應(yīng)用CIBERSORT算法來(lái)估計(jì)MIA和IAC腫瘤中免疫細(xì)胞的相對(duì)豐度。作者發(fā)現(xiàn)，與MIA相比，IAC的CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)較少（圖4A）。隨后的免疫熒光染色分析也表明，IAC腫瘤中的CD8+T細(xì)胞比MIA腫瘤中的少（圖4B）。關(guān)鍵CD8+T細(xì)胞效應(yīng)分子GZMB的免疫組織化學(xué)染色顯示，IAC腫瘤的GZMB水平較低，表明IAC腫瘤中CD8+T細(xì)胞的活性減弱（圖4C）。為了確定B4GALT1是否引起了這種免疫狀態(tài)的改變，作者對(duì)這些樣本進(jìn)行了BGALT1的免疫組織化學(xué)染色（圖4D），發(fā)現(xiàn)B4GALT1的水平與CD8 +T細(xì)胞的數(shù)量之間存在明顯的負(fù)相關(guān)，GZMB的水平也存在明顯的負(fù)相關(guān)（圖4E）。
       為了確定B4GALT1是否為功能失調(diào)T細(xì)胞的重要調(diào)節(jié)因子，作者研究了在小鼠癌細(xì)胞與特異性靶向癌細(xì)胞抗原的小鼠原代T細(xì)胞共培養(yǎng)的背景下，公開(kāi)可用的規(guī)律成簇的分散短回文重復(fù)序列（CRISPR）篩查的數(shù)據(jù)。基于5個(gè)獨(dú)立研究中的9個(gè)這樣的篩選，作者發(fā)現(xiàn)靶向B4GALT1的gRNAs一致被負(fù)向選擇（圖4F）。這些結(jié)果表明，B4GALT1可能導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞功能障礙，并可能使肺腺癌細(xì)胞在失活時(shí)更容易受到CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)論，作者進(jìn)行了T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞殺傷試驗(yàn)，以測(cè)試B4GALT1表達(dá)對(duì)CD8+T細(xì)胞活性的影響，CD8+T細(xì)胞活性是從健康供者的外周血和C57BL/6小鼠的脾臟中分離出來(lái)的（圖4G）。正如預(yù)期，B4GALT1抑制顯著增強(qiáng)了CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的LUAD細(xì)胞死亡，并且在A549和LLC細(xì)胞系中，B4GALT1上調(diào)使LUAD細(xì)胞對(duì)CD8+T細(xì)胞更具抗性（圖4H）。

圖4 B4GALT1限制了CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)和活性

4. B4GALT1與PD-L1相互作用并通過(guò)介導(dǎo)其糖基化增強(qiáng)PD-L1蛋白穩(wěn)定性，從而促進(jìn)肺腺癌的免疫逃逸
       越來(lái)越多的證據(jù)表明，免疫抑制與免疫檢查點(diǎn)的失調(diào)有關(guān)。因此，作者在B4GALT1高表達(dá)和低表達(dá)的腫瘤之間比較了著名的免疫檢查點(diǎn)分子的表達(dá)水平（圖5A）。值得注意的是，CD274（PD-L1）在B4GALT1高表達(dá)的腫瘤中比在B4GALT1低表達(dá)的腫瘤中表達(dá)最顯著。在A549和LLC細(xì)胞中，敲低或過(guò)表達(dá)B4GALT1均可引起PD-L1 mRNA和蛋白水平的降低或升高（圖5B-C）。因此，作者有理由假設(shè)B4GALT1通過(guò)影響肺腺癌中PD-L1的表達(dá)來(lái)介導(dǎo)CD8+T細(xì)胞功能障礙。在過(guò)表達(dá)B4GALT1的LUAD細(xì)胞中，敲低CD274可恢復(fù)CD8+T細(xì)胞殺傷能力，這證實(shí)了這一推測(cè)（圖5D）。
       接下來(lái)，作者研究了B4GALT1如何影響PD-L1水平。B4GALT1是參與N-糖基生物合成的關(guān)鍵基因，參與N-糖基化的形成。因此，作者推測(cè)N-糖基化可能通過(guò)涉及翻譯后修飾的機(jī)制參與B4GALT1介導(dǎo)的PD-L1調(diào)控。首先，在CHX處理后，作者發(fā)現(xiàn)B4GALT1敲除降低了A549和LLC細(xì)胞中PD-L1蛋白的半衰期，而B(niǎo)4GALT1穩(wěn)定表達(dá)顯著增加了PD-L1蛋白的穩(wěn)定性（圖5E）。此外，co-IP驗(yàn)證了B4GALT1與PD-L1之間的相互作用（圖5F）。為了在生物化學(xué)上證實(shí)兩者的相互作用，作者表達(dá)并純化了含有B4GALT1的GST融合蛋白，并進(jìn)行了GST pull down實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，GST-B4GALT1可以下調(diào)A549細(xì)胞裂解液中的PD-L1（圖5G）。然后，作者試圖研究B4GALT1是否通過(guò)N-連接糖基化來(lái)調(diào)節(jié)PD-L1蛋白。用衣霉素（N-連鎖糖基化抑制劑）處理A549和LLC細(xì)胞，與未處理細(xì)胞相比，PD-L1表達(dá)顯著下調(diào)，與B4GALT1敲低一致。此外，衣霉素恢復(fù)了B4GALT1過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)的PD-L1表達(dá)（圖5H）。為了進(jìn)一步鑒定PD-L1的N-連接糖基化位點(diǎn)，作者首先使用NetNGlyc 1.0服務(wù)器工具預(yù)測(cè)了PD-L1的N-連接糖基化基序。然后，使用flag標(biāo)記的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染B4GALT1過(guò)表達(dá)細(xì)胞，這些質(zhì)粒攜帶PD-L1的全長(zhǎng)編碼序列，或者含有N35、N192或N200處突變的N-連鎖糖基化位點(diǎn)的編碼序列，用于CHX分析（圖5I）。結(jié)果顯示，即使在B4GALT1過(guò)表達(dá)的情況下，突變N192和N200的N-糖基化位點(diǎn)也顯著降低了PD-L1蛋白的穩(wěn)定性，提示這些殘基是B4GALT1修飾的PD-L1的N-糖基化位點(diǎn)。綜上所述，B4GALT1通過(guò)介導(dǎo)PD-L1的糖基化與PD-L1相互作用，從而促進(jìn)肺腺癌的免疫逃逸。

圖5 B4GALT1與PD-L1相互作用并通過(guò)介導(dǎo)其糖基化增強(qiáng)PD-L1蛋白穩(wěn)定性，從而促進(jìn)早期肺腺癌的免疫逃逸

5. B4GALT1通過(guò)調(diào)控TAZ糖基化促進(jìn)PD-L1轉(zhuǎn)錄
       以上數(shù)據(jù)表明，B4GALT1可以增強(qiáng)PD-L1蛋白的穩(wěn)定性。此外，作者注意到B4GALT1敲低或過(guò)表達(dá)后CD274 mRNA的變化（圖5B）。這些結(jié)果表明，B4GALT1也可能對(duì)CD274有轉(zhuǎn)錄作用。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，作者進(jìn)行了熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)，結(jié)果顯示B4GALT1過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了CD274啟動(dòng)子活性（圖6A）。此外，有趣的是，作者發(fā)現(xiàn)IAC腫瘤中高表達(dá)的基因在Hippo信號(hào)通路中富集（圖1D）。在之前的研究中，作者發(fā)現(xiàn)Hippo信號(hào)通路中一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子——含WW結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子1（TAZ）可以通過(guò)增加CD274啟動(dòng)子的活性來(lái)誘導(dǎo)PD-L1的上調(diào)。在本研究中，作者還驗(yàn)證了TAZ在肺腺癌中對(duì)CD274的調(diào)控作用。TAZ敲低導(dǎo)致A549和LLC細(xì)胞中CD274 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低（圖6B-C）。進(jìn)一步的報(bào)告基因分析表明，TAZ敲低降低了全長(zhǎng)CD274啟動(dòng)子的活性，但對(duì)缺失區(qū)域的啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)無(wú)影響（圖6D）。重要的是，B4GALT1過(guò)表達(dá)不影響帶有缺失區(qū)域的CD274啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)的活性，表明B4GALT1通過(guò)TAZ影響CD274啟動(dòng)子的活性（圖6E）。此外，TAZ敲低顯著降低了B4GALT1誘導(dǎo)的全長(zhǎng)CD274啟動(dòng)子活性和CD274 mRNA水平的增加（圖6F-G），表明B4GALT1通過(guò)TAZ介導(dǎo)了CD274的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。此外，TAZ敲低逆轉(zhuǎn)了B4GALT1誘導(dǎo)的PD-L1蛋白水平（圖6H）。
       作者進(jìn)一步探索了B4GALT1影響TAZ水平的機(jī)制。通過(guò)對(duì)TCGA和GEO數(shù)據(jù)集的分析，作者觀察到B4GALT1的表達(dá)在蛋白水平而不是mRNA水平與TAZ水平顯著相關(guān)，這與qRT-PCR和WB結(jié)果一致（圖6I-J）。因此，作者懷疑TAZ蛋白可能通過(guò)獲得N-糖基修飾而在翻譯后水平受到B4GALT1的調(diào)節(jié)。通過(guò)CHX分析，作者發(fā)現(xiàn)B4GALT1可以增加TAZ蛋白的穩(wěn)定性（圖6K）。此外，co-IP（圖6L）和GST pull-down實(shí)驗(yàn)（圖6M）表明B4GALT1直接與TAZ相互作用。此外，在B4GALT1過(guò)表達(dá)細(xì)胞中，衣霉素處理后TAZ蛋白水平顯著降低（圖6N），表明TAZ的N-連接糖基化受B4GALT1調(diào)節(jié)。然后，作者應(yīng)用NetNGlyc 1.0服務(wù)器工具預(yù)測(cè)TAZ的潛在N-連接糖基化位點(diǎn)，并突變N184和N256位點(diǎn)（圖6O）。CHX分析結(jié)果表明，B4GALT1過(guò)表達(dá)不能促進(jìn)TAZ蛋白穩(wěn)定性，但N256位點(diǎn)發(fā)生了突變，提示N256是B4GALT1修飾的TAZ的N-糖基化位點(diǎn)。
       這些結(jié)果表明，B4GALT1/TAZ介導(dǎo)了PD-L1的翻譯修飾。

圖6 B4GALT1通過(guò)調(diào)控TAZ糖基化促進(jìn)PD-L1轉(zhuǎn)錄

6. 抑制B4GALT1可增強(qiáng)抗PD-1治療LUAD的療效
       為了評(píng)估B4GALT1在體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)作用，作者使用LLC小鼠LUAD細(xì)胞系在免疫正常的C57BL/6小鼠中構(gòu)建皮下異種移植瘤，然后使用PD-1 mAb或IgG同型CTRL（IgG2a）處理移植瘤（圖7A）。作者發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，B4GALT1敲低限制了腫瘤生長(zhǎng)，這與PD-1單抗治療一致。此外，與其他組相比，B4GALT1抑制和PD-1阻斷聯(lián)合治療組的腫瘤負(fù)荷下降最顯著，且未觀察到體重減輕和其他常見(jiàn)毒性作用（圖7B-F）。在治療結(jié)束時(shí)收集腫瘤樣本進(jìn)行進(jìn)一步分析，免疫組織化學(xué)染色和流式細(xì)胞術(shù)分析表明，B4GALT1缺陷顯著降低了PD-L1水平，增加了CD8+T細(xì)胞和CD8+GZMB+細(xì)胞密度（圖7G-H）。特別是，PD-1 mAb和B4GALT1抑制聯(lián)合治療導(dǎo)致了腫瘤區(qū)域中活化CD8+T細(xì)胞的最顯著富集（圖7H）。這些結(jié)果證實(shí)抑制B4GALT1通過(guò)下調(diào)PD-L1表達(dá)增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)和功能，從而提高抗PD-1治療的療效。綜上所述，這些結(jié)果表明B4GALT1通過(guò)上調(diào)PD-L1表達(dá)和抑制CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)促進(jìn)腫瘤免疫逃逸。

圖7 抑制B4GALT1可增強(qiáng)抗PD-1治療LUAD的療效

結(jié)論
       基于獨(dú)特的MPLC模型，作者揭示了B4GALT1促進(jìn)了早期LUAD的免疫逃避和腫瘤發(fā)生，并確定了B4GALT1在轉(zhuǎn)錄水平通過(guò)穩(wěn)定TAZ蛋白調(diào)節(jié)PD-L1，在翻譯后水平直接通過(guò)PD-L1的N-連接糖基化蛋白修飾來(lái)調(diào)節(jié)PD-L1的新機(jī)制。該研究為將B4GALT1作為L(zhǎng)UAD的潛在治療靶點(diǎn)提供了一定的理論基礎(chǔ)。

實(shí)驗(yàn)方法
RNA測(cè)序，qRT-PCR，蛋白質(zhì)印跡，MTT增殖測(cè)定，菌落形成測(cè)定，細(xì)胞遷移和侵襲測(cè)定，流式細(xì)胞術(shù)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，免疫組織化學(xué)（IHC），免疫熒光，免疫共沉淀，GST pull-down，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)
參考文獻(xiàn)
Cui Y, Li J, Zhang P, Yin D, Wang Z, Dai J, et al. B4GALT1 promotes immune escape by regulating the expression of PD-L1 at multiple levels in lung adenocarcinoma. J Exp Clin Cancer Res. 2023 Jun 12;42(1):146.