孕激素受體通過RUNX轉(zhuǎn)錄因子相互作用和染色質(zhì)重塑介導(dǎo)排卵轉(zhuǎn)錄

       孕激素受體（PGR）在生殖組織中扮演多種角色，從而調(diào)控哺乳動物的生育能力。在卵巢中，通過對一組獨(dú)特基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，迅速、急性誘導(dǎo)PGR是排卵的關(guān)鍵決定因素, 最終導(dǎo)致卵泡破裂。然而，關(guān)于PGR在排卵中的專門功能的分子機(jī)制尚不清楚。我們通過組合ATAC-seq、RNA-seq和ChIP-seq分析，在野生型和特定異構(gòu)體PGR敲除小鼠中，建立了詳細(xì)的PGR作用基因組譜系。我們證明，刺激排卵迅速重塑了三分之二的染色質(zhì)可及性，與基因表達(dá)的改變相關(guān)。我們觀察到，卵巢特異性的PGR作用與RUNX轉(zhuǎn)錄因子的相互作用有關(guān)，70%的PGR結(jié)合區(qū)域也與RUNX1結(jié)合。這些轉(zhuǎn)錄復(fù)合物將PGR結(jié)合到近端啟動子區(qū)域。此外，PGR與典型的NR3C基序的直接結(jié)合使染色質(zhì)具有可及性。所有這些PGR作用共同介導(dǎo)了必需的排卵基因的誘導(dǎo)。我們的發(fā)現(xiàn)突出了一種新的針對排卵的PGR轉(zhuǎn)錄機(jī)制，為不孕不育治療或阻止排卵的新避孕藥提供了新的靶點(diǎn)。
圖形摘要

       該研究于2023年4月發(fā)表發(fā)表在《Nucleic Acids Research》，IF：14.9。
技術(shù)路線

結(jié)果
1、排卵刺激通過不同的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合重塑染色質(zhì)狀態(tài)和轉(zhuǎn)錄
       通過hCG注射小鼠誘導(dǎo)排卵提供了一個體內(nèi)模型，用于研究顆粒細(xì)胞對排卵信號的快速反應(yīng)。比較ATAC-seq揭示了染色質(zhì)可及性和排卵轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的動態(tài)變化。嚴(yán)格的ATAC-seq峰值調(diào)用標(biāo)準(zhǔn)確定了總共71,287個可訪問的染色質(zhì)峰，其中三分之二的峰在黃體生成素(LH)刺激后的6小時(shí)內(nèi)發(fā)生了改變，有28,729個位點(diǎn)（40.3%）受LH誘導(dǎo)，21,257個位點(diǎn)（29.8%）顯著抑制，21,301個位點(diǎn)（29.8%）可及性無變化（FDR ≤ 0.05，圖1A）。LH介導(dǎo)的可及性變化不僅發(fā)生在啟動子區(qū)域，還發(fā)生在遠(yuǎn)端增強(qiáng)子和基因區(qū)域（圖1B）。
       為了預(yù)測參與LH介導(dǎo)的開放染色質(zhì)位點(diǎn)可及性變化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的活性，進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合模體的差異分析（圖1C）。許多已知的排卵轉(zhuǎn)錄因子（如JUN/FOS、RUNX、CREB和CEBP）的模體在LH刺激后開放染色質(zhì)峰中的結(jié)合分?jǐn)?shù)顯著增加，而CTCF、NR5A和ESRR的模體則富集于LH前開放染色質(zhì)位點(diǎn)。有趣的是，NR3C家族的典型模體，包括孕激素受體(PGR)、糖皮質(zhì)激素受體（NR3C1/GR）、醛固酮受體（NR3C2/MR）和雄激素受體（NR3C4/AR），在LH刺激前的開放染色質(zhì)中顯示出顯著較高的結(jié)合分?jǐn)?shù)。為支持這些發(fā)現(xiàn)，使用HOMER進(jìn)行的新生模體富集分析也在LH誘導(dǎo)的開放染色質(zhì)區(qū)域中鑒定出了JUN/FOS、RUNT和CEBP的模體，但沒有在LH抑制的開放染色質(zhì)區(qū)域中發(fā)現(xiàn)（圖1D）。NR5A和GATA家族的模體在所有ATAC-seq峰集中同樣富集。重要的是，在LH抑制的子集中僅發(fā)現(xiàn)與NR3C成員結(jié)合的模體最匹配，與差異轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合分析模式一致。轉(zhuǎn)錄因子直接結(jié)合到這些模體的證據(jù)可在聚合的足跡圖中觀察到（圖1E）。顯示與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到這些位點(diǎn)相關(guān)的足跡模式，可以觀察到中度至深度的凹陷（JUN/FOS、CTCF、NR5A）和較淺的模式（RUNT、NR3C），暗示這些轉(zhuǎn)錄因子停留時(shí)間的差異。JUN/FOS足跡僅在LH刺激后才明顯，而NR3C足跡的證據(jù)在未刺激的細(xì)胞中最明顯。
       通過對體內(nèi)LH刺激前或LH刺激后8小時(shí)收集的顆粒細(xì)胞進(jìn)行RNA-seq分析，將染色質(zhì)可及性譜系與基因表達(dá)變化相關(guān)聯(lián)。共鑒定了2088個差異表達(dá)基因（DEG），其中52%受LH刺激上調(diào)（圖2A）。其中包括許多已知與排卵相關(guān)的基因，如Ptgs2、Pgr、Runx1、Runx2和Adamts1。使用Ingenuity Pathway Analysis（IPA）軟件預(yù)測LH DEG的潛在上游調(diào)控因子，確定了一系列轉(zhuǎn)錄因子，其中許多也是對LH激增作出反應(yīng)的DEG，包括PGR（log FC = 6.4）、RUNX1（log FC = 4.6）、CEBPβ（log FC = 2.5）和JUNB（log FC = 2.1）。值得注意的是，除了PGR外，這些轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合模體也顯示出LH刺激后的可及性增加（圖1C、D）。通過比較LH DEG和這些基因啟動子（TSS上游3 kb內(nèi)）的LH依賴性染色質(zhì)可及性，展示了排卵前顆粒細(xì)胞中啟動子可及性與下游基因表達(dá)之間的全局關(guān)系。69.3%的LH驅(qū)動DEG（2088個基因中的1447個）在啟動子可及性發(fā)生顯著變化時(shí)顯示出轉(zhuǎn)錄變化（圖2B，紅色符號）。LH誘導(dǎo)的基因的啟動子可及性大多增加，而LH抑制的基因的可及性較低（Spearman相關(guān)系數(shù)=0.4297）。作為示例，Cxcr4和Inhbb是兩個分別上調(diào)和下調(diào)的基因，其表達(dá)模式與基因啟動子處的ATAC-seq信號明顯相關(guān)（圖2C）。然而，在某些情況下，差異調(diào)節(jié)的基因具有一直可及的啟動子，如Cited1。LH誘導(dǎo)的啟動子可及性高的轉(zhuǎn)錄活躍基因主要與排卵相關(guān)的生物過程相關(guān)，包括血管生成、MAPK信號通路和炎癥應(yīng)答?？傊?，這些結(jié)果表明，作為對LH激增的全局染色質(zhì)重塑，很可能通過激活一組特定的轉(zhuǎn)錄因子，驅(qū)動與LH觸發(fā)的排卵相關(guān)的基因表達(dá)譜系。

圖1.人絨毛膜促性腺激素治療后顆粒細(xì)胞染色質(zhì)景觀的整體變化

圖2.hCG治療后顆粒細(xì)胞的整體轉(zhuǎn)錄變化。

2、PGR和RUNX1在排卵期顆粒細(xì)胞中相互結(jié)合染色質(zhì)
       RUNX1在排卵中具有功能重要性，并且RUNT基序在圍絕經(jīng)期顆粒細(xì)胞的PGR ChIP-seq峰值中高度富集。此外，我們發(fā)現(xiàn)在LH刺激后獲得染色質(zhì)可及性的區(qū)域含有富集的RUNT基序（圖1C）。RUNX1和RUNX2的表達(dá)在顆粒細(xì)胞中對LH激素的刺激作出反應(yīng)時(shí)被誘導(dǎo)，并且在顆粒細(xì)胞特異性Sf1-cre RUNX1 KO小鼠中排卵被延遲。為了確定RUNX1是否是介導(dǎo)排卵基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的關(guān)鍵因素，我們使用ChIP-seq在體內(nèi)hCG處理前或處理后的6小時(shí)內(nèi)定義了顆粒細(xì)胞中RUNX1的全基因組靶點(diǎn)。在LH激素釋放前就檢測到全局RUNX1-染色質(zhì)結(jié)合，但在LH激素釋放后也被7倍誘導(dǎo)（16065個LH誘導(dǎo)的峰值）（圖3A）。LH激活的RUNX1結(jié)合與LH誘導(dǎo)的開放染色質(zhì)強(qiáng)烈相關(guān)（通過ATAC-seq定義）。通過比較RUNX1和PGR的ChIP-seq，我們在對LH刺激做出反應(yīng)的顆粒細(xì)胞中確定了RUNX1和PGR之間的明顯關(guān)系。PGR和RUNX1在100 bp內(nèi)共享了大量結(jié)合位點(diǎn)，其中9704個染色質(zhì)位點(diǎn)（總PGR的70%或總RUNX1結(jié)合位點(diǎn)的52%）同時(shí)結(jié)合了PGR和RUNX1（圖3B）。在這些共享的PGR/RUNX1結(jié)合位點(diǎn)中，有9288個位于同一時(shí)間點(diǎn)鑒定的ATAC-seq開放染色質(zhì)位點(diǎn)中。將轉(zhuǎn)錄活躍的RUNX1和PGR cistrome分為每個轉(zhuǎn)錄因子共享或only結(jié)合的部分，發(fā)現(xiàn)沒有RUNX1共結(jié)合的PGR結(jié)合位點(diǎn)與基因啟動子的關(guān)聯(lián)程度相對較低。在PGR/RUNX1共結(jié)合位點(diǎn)中，靠近啟動子的結(jié)合（在TSS的1 kb范圍內(nèi)）是PGR的主要特點(diǎn)（圖3C）。PGR和RUNX1結(jié)合位點(diǎn)的顯著高度重疊，再加上我們先前報(bào)告的顆粒細(xì)胞PGR ChIP-seq中富集的RUNX1結(jié)合基序，暗示了PGR以先前報(bào)道的顆粒細(xì)胞特異性能力通過與RUNX1共結(jié)合來靶向近端啟動子。這種依賴關(guān)系不是相互的，因?yàn)镽UNX1顯示出獨(dú)立于PGR共結(jié)合的近端啟動子占據(jù)的優(yōu)勢。為了測試LH誘導(dǎo)的RUNX1染色質(zhì)結(jié)合是否依賴于PGR，我們比較了在PGR重疊位點(diǎn)與獨(dú)立于PGR的位點(diǎn)上LH誘導(dǎo)的RUNX1結(jié)合強(qiáng)度。在RUNX1富集水平上沒有觀察到差異，這表明PGR不太可能在這些共享位點(diǎn)上發(fā)揮RUNX1的連接或招募作用。
       通過將具有PGR和/或RUNX1結(jié)合的基因與我們的LH響應(yīng)性差異表達(dá)基因列表進(jìn)行比較，展示了PGR和RUNX1在基因表達(dá)中對排卵信號的重要性（圖3D）。值得注意的是，所有LH介導(dǎo)的差異表達(dá)基因中，至少62.4%的基因在其近端啟動子（在3 kb范圍內(nèi)）上具有PGR或RUNX1結(jié)合，與LH抑制的差異表達(dá)基因相比，LH誘導(dǎo)的差異表達(dá)基因更頻繁地被PGR和/或RUNX1結(jié)合。其中，大多數(shù)（55%）RUNX1結(jié)合的LH差異表達(dá)基因和大多數(shù)（87%）PGR結(jié)合的LH差異表達(dá)基因?qū)嶋H上都被兩個轉(zhuǎn)錄因子共結(jié)合，這意味著PGR和RUNX1在目標(biāo)啟動子上的同時(shí)相互作用是它們各自在基因調(diào)控中的主要機(jī)制。在排卵期顆粒細(xì)胞中的許多已知的PGR和RUNX1靶基因的啟動子中可以看到PGR/RUNX1的相互染色質(zhì)占據(jù)（Rgcc，Adamts1和Cstl）（圖3E）。PGR/RUNX1的合作還可以通過形成與調(diào)控基因的近端啟動子接觸的遠(yuǎn)端增強(qiáng)子來調(diào)控靶基因的表達(dá)。為了研究這一點(diǎn)，我們整合了公開可用的小鼠顆粒細(xì)胞Hi-C的染色質(zhì)-染色質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)。Hi-C確定了與516/2088個LH差異表達(dá)基因的TSS相關(guān)的遠(yuǎn)端染色質(zhì)相互作用，其中至少28%被PGR和/或RUNX1結(jié)合（圖3D）。與PGR和RUNX1在近端啟動子上的結(jié)合不同，PGR/RUNX1在遠(yuǎn)端增強(qiáng)子上的結(jié)合與LH誘導(dǎo)和LH抑制的基因表達(dá)同樣相關(guān)。以PGR靶基因Adamts1為例，它顯示了強(qiáng)烈的PGR/RUNX1共結(jié)合，位于通過小鼠顆粒細(xì)胞中的Hi-C以及人類卵巢中的啟動子捕獲-C指示的遠(yuǎn)端區(qū)域與Adamts1 TSS相互作用（圖3F）。
       基序富集分析顯示，期望的典型RUNT基序在RUNX1基因組中高度且顯著富集（相對于背景的3.5倍，P值為1e-787），以及PGR基因組中（相對于背景的2.8倍，P值為1e-370）（圖3G）。NR3C基序在RUNX1結(jié)合的基因組中也富集（相對于背景的2倍，P值為1e-25）。這種富集僅限于PGR/RUNX1共結(jié)合位點(diǎn)。其他富集的非典型基序包括與JUN/FOS、CEBP和GATA轉(zhuǎn)錄因子對應(yīng)的基序。
       通過近距離連接測定（PLA）證實(shí)了PGR和RUNX1在小鼠顆粒細(xì)胞核中的密切物理相互作用，這些細(xì)胞在模擬體內(nèi)排卵刺激的情況下經(jīng)過hCG和R5020處理長達(dá)8小時(shí)（圖4A）。PLA信號顯示LH刺激迅速短暫誘導(dǎo)了PGR/RUNX1復(fù)合物，表明在刺激前大部分時(shí)間不存在的PGR/RUNX1相互作用在刺激后4小時(shí)內(nèi)增加。此外，通過免疫沉淀結(jié)合質(zhì)譜法在PGR表達(dá)的人類顆粒細(xì)胞中，根據(jù)對R5020處理的響應(yīng)，也表明了RUNX1和PGR之間的物理相互作用（圖4B）。PGR還可以與其他RUNX成員相互作用，正如在暴露于排卵刺激的顆粒細(xì)胞中的PGR/RUNX2 PLA所示（圖4C）。

圖3.在排卵周圍顆粒細(xì)胞中，PGR和RUNX1共有共同的染色質(zhì)靶點(diǎn)。

圖4.顆粒細(xì)胞中的PGR與RUNX轉(zhuǎn)錄因子相互作用，以響應(yīng)黃體生成素激增。

3、PGR介導(dǎo)顆粒細(xì)胞染色質(zhì)可及性
       PGR結(jié)合區(qū)域主要與轉(zhuǎn)錄活性染色質(zhì)重疊，如PGR和H3K27ac ChIP-seq峰值重疊75%，以及90%的PGR結(jié)合位點(diǎn)與ATAC-seq峰值重疊。此外，在激素刺激的顆粒細(xì)胞中還展示了PGR與組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶CBP/p300之間的相互作用。通過對PGRWT和PGRKO小鼠顆粒細(xì)胞的ATAC-seq進(jìn)一步研究了PGR結(jié)合與染色質(zhì)可及性之間的功能關(guān)系。發(fā)現(xiàn)在缺乏PGR的情況下，1499個位點(diǎn)的峰值強(qiáng)度顯著改變（圖5A）；有趣的是，在PGRKO中，只有6個位點(diǎn)的ATAC峰值強(qiáng)度增加，而大多數(shù)位點(diǎn)在PGRKO中失去了可及性。盡管PGR-染色質(zhì)結(jié)合傾向于顆粒細(xì)胞的近端啟動子區(qū)域，但PGR依賴的ATAC-seq峰值在整個基因組特征中更均勻地分布（圖5B）。PGR的消融導(dǎo)致了236個基因的失調(diào)，通過對PGRWT和PGRKO顆粒細(xì)胞的RNA-seq鑒定出這些基因。一致地，在這些PGR依賴基因的啟動子處，ATAC-seq峰值的強(qiáng)度減少是明顯的（Spearman相關(guān)系數(shù)=0.5116，P值<0.0001）（圖5C）。這表明這些基因的啟動子可及性受到PGR消融的顯著影響。以Gpt2為例，其啟動子在PGRKO中的可及性不同，在PGR缺失時(shí)不顯著改變的Abhd2的啟動子可及性也顯示了PGR依賴的染色質(zhì)可及性（圖5D）。
       在PGR驅(qū)動的ATAC峰值上進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄因子模體富集分析，并與PGR ChIP-seq中富集的模體進(jìn)行了比較。與ChIP-seq一樣，PGR驅(qū)動的ATAC峰值序列中最高度富集且最顯著的模體是經(jīng)典的NR3C模體（相對于背景富集了12.4倍）。與PGR ChIP-seq類似，PGR依賴的ATAC峰值中也顯著富集了一些非經(jīng)典模體（圖5E）。有趣的是，53%（795個中的1499個）的PGR依賴的ATAC位點(diǎn)被PGR結(jié)合，而只有17.8%（267個位點(diǎn)）顯示出任何RUNX1結(jié)合，其中幾乎所有位點(diǎn)（250/267個位點(diǎn)）均被PGR和RUNX1結(jié)合（圖5F）。此外，PGRKO的ATAC-seq表明PGR通過結(jié)合經(jīng)典NR3C模體直接促進(jìn)染色質(zhì)可及性的子集區(qū)域。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，我們使用與PGR密切相關(guān)的AR HT-SELEX數(shù)據(jù)生成了NR3C DNA結(jié)合的定量模型。從二核苷酸模型派生的能量logo（15個堿基對）符合NR3C共識或PGR模體。接下來，我們使用該模型估計(jì)了每個峰值中的PGR結(jié)合親和力，并將其與PGR ChIP-seq峰值強(qiáng)度進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示PGR結(jié)合得分與PGR結(jié)合峰值呈現(xiàn)出適度的線性關(guān)系。我們通過受試者工作特征（ROC）曲線分析來檢查DNA結(jié)合模型預(yù)測PGR染色質(zhì)占據(jù)的能力，發(fā)現(xiàn)結(jié)合親和力對于所有PGR ChIP位點(diǎn)的染色質(zhì)占據(jù)只有適度的預(yù)測能力（AUROC = 0.63，n = 13,976），但在也是PGR依賴的ATAC-seq峰值的PGR ChIP峰值上的預(yù)測準(zhǔn)確性非常高（AUROC = 0.9，n = 804）（圖5G）。這得到了強(qiáng)烈的支持，因?yàn)榕c所有PGR結(jié)合位點(diǎn)相比，PGR綁定的PGR依賴ATAC峰值在ChIP峰值強(qiáng)度和NR3C模體結(jié)合親和力上表現(xiàn)出明顯的增強(qiáng)（圖5H）。綜上所述，這表明PGR通過結(jié)合選定的染色質(zhì)區(qū)域的NR3C模體來驅(qū)動染色質(zhì)重塑，而在非經(jīng)典位點(diǎn)上的共享PGR/RUNX結(jié)合對于促進(jìn)染色質(zhì)可及性的依賴性較小。

圖5.PGR介導(dǎo)顆粒細(xì)胞染色質(zhì)的可及性。

4、PGR亞型介導(dǎo)特異性排卵基因調(diào)控
       先前的研究已經(jīng)在總PGRKO和AKO小鼠中記錄了受干擾的排卵表型，但在BKO小鼠中沒有，通過對這三個小鼠品系的排卵率評估，我們驗(yàn)證了這一點(diǎn)。我們在從每個品系中獲取的PGRKO、AKO或BKO和WT同胞中的顆粒細(xì)胞中進(jìn)行了RNA-seq，并通過分層聚類發(fā)現(xiàn)，AKO顆粒細(xì)胞的全局基因表達(dá)模式與總PGRKO相似，而BKO則更接近每個品系的WT（圖6A）。在AKO中鑒定了310個基因的差異表達(dá)，其中153個（或49.4%）也在缺乏兩個PGR亞型的情況下被鑒定出來（圖6B）。在這些基因中，48.6%和58.5%的AKO和PGRKO差異表達(dá)基因分別也在對LH峰值的響應(yīng)中差異表達(dá)。另一方面，失去PGR-B沒有導(dǎo)致顯著的轉(zhuǎn)錄變化（圖6B）。
       為了確定共調(diào)控下游PGR靶基因的轉(zhuǎn)錄因子，使用IPA對DEG數(shù)據(jù)集的上游調(diào)控因子進(jìn)行了分析（圖6C）。如預(yù)期，PGR在PGRKO和AKO數(shù)據(jù)集中被顯示為最顯著的調(diào)控因子。此外，已知被PGR誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子，如PPARG和HIF1A，也在兩個數(shù)據(jù)集中富集。重要的是，這種獨(dú)立的方法還支持RUNX、JUN/FOS和CBP/p300作為PGR依賴性轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的介導(dǎo)因子，因?yàn)镽UNX1、CBFα、JUN、FOS和p300也被通過上游分析鑒定出來。我們在AKO和BKO品系的hCG/孕激素刺激顆粒細(xì)胞中進(jìn)行了PGR/RUNX1和PGR/RUNX2的PLA。在AKO而不是BKO顆粒細(xì)胞中觀察到與RUNX1和RUNX2的蛋白質(zhì)相互作用的減少（圖6D）。

圖6.通過與特定轉(zhuǎn)錄因子配對的相互作用，圍排卵期顆粒細(xì)胞中由PGR亞型驅(qū)動的轉(zhuǎn)錄組。

實(shí)驗(yàn)方法
顆粒細(xì)胞培養(yǎng)及激素治療、ATAC-seq、RNA-seq、ChIP-seq、鄰位連接試驗(yàn)(PLA)、GFP-TRAP免疫沉淀、質(zhì)譜。
參考文獻(xiàn)
Dinh DT, Breen J, Nicol B, Foot NJ, Bersten DC, Emery A, Smith KM, Wong YY, Barry SC, Yao HHC, Robker RL, Russell DL. Progesterone receptor mediates ovulatory transcription through RUNX transcription factor interactions and chromatin remodelling. Nucleic Acids Res. 2023 Apr 26:gkad271. doi: 10.1093/nar/gkad271. Epub ahead of print. PMID: 37099375.