BaP/BPDE的新發(fā)現(xiàn)—促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞焦亡，誘導(dǎo)流產(chǎn)
環(huán)境苯并(a)芘(BaP)及其最終代謝產(chǎn)物BPDE(苯并(a)芘-7,8-二氫二醇-9,10-環(huán)氧化物)是典型的持久性有機(jī)污染物和內(nèi)分泌干擾物。BaP/BPDE暴露可引起人滋養(yǎng)細(xì)胞功能障礙并誘發(fā)流產(chǎn)。然而，潛在的機(jī)制在很大程度上仍然難以捉摸。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)BPDE暴露通過(guò)上調(diào)NLRP3/Caspase1/GSDMD通路誘導(dǎo)人滋養(yǎng)細(xì)胞焦亡。我們還發(fā)現(xiàn)lnc-HZ14在暴露于BPDE的滋養(yǎng)細(xì)胞和復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RM)絨毛組織中高表達(dá)。Lnc-HZ14通過(guò)促進(jìn)IRF1介導(dǎo)的ZBP1轉(zhuǎn)錄，增加METTL3介導(dǎo)的m6A甲基化NLRP3 mRNA及其穩(wěn)定性，增強(qiáng)ZBP1/NLRP3蛋白相互作用，促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞焦亡。lnc-HZ14/ZBP1/NLRP3軸下調(diào)可有效緩解BPDE誘導(dǎo)的滋養(yǎng)細(xì)胞焦亡。從lnc-HZ14/ZBP1/NLRP3軸的上調(diào)可以看出，RM比HC的絨毛組織有更高水平的焦亡。在BaP暴露小鼠模型中，BaP暴露通過(guò)上調(diào)小鼠Zbp1/Nlrp3軸誘導(dǎo)胎盤(pán)組織焦亡和流產(chǎn)，敲低NLRP3可有效減少胎盤(pán)焦亡，減輕BaP誘導(dǎo)的小鼠流產(chǎn)。血清IL-1β蛋白水平可能是預(yù)測(cè)流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)的一個(gè)有希望的指標(biāo)。這些發(fā)現(xiàn)為BaP/BPDE誘導(dǎo)的滋養(yǎng)細(xì)胞焦亡和流產(chǎn)提供了新的認(rèn)識(shí)，并可能有助于進(jìn)一步評(píng)估BaP/BPDE對(duì)雌性生殖的毒理學(xué)影響。本文于2023年5月發(fā)表于“Journal of Hazardous materials”（IF=13.6）上。
技術(shù)路線
結(jié)果
1）BPDE暴露通過(guò)上調(diào)NLRP3通路誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞焦亡
我們用BPDE處理人滋養(yǎng)層細(xì)胞(Swan 71和HTR-8/ SVneo)，并探討B(tài)PDE暴露是否會(huì)導(dǎo)致滋養(yǎng)層細(xì)胞焦亡。我們發(fā)現(xiàn)BPDE暴露導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞腫脹(圖1A)，這是一種典型的細(xì)胞焦亡形態(tài)。然后，我們檢測(cè)了BPDE暴露的人滋養(yǎng)細(xì)胞中焦亡通路的表達(dá)水平。BPDE暴露增加了暴露于BPDE的人滋養(yǎng)細(xì)胞中NLRP3的mRNA水平(圖1B)以及NLRP3、Pro-Caspase 1、cleave-Caspase 1、GSDMD和GSDMD-N的蛋白水平(圖1C)。此外，BPDE暴露的滋養(yǎng)細(xì)胞中裂解-IL-1b水平也升高(圖1C)。綜上所述，BPDE暴露通過(guò)上調(diào)NLRP3/Caspase1/GSDMD途徑誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞焦亡。
2）Lnc-HZ14在BPDE暴露的人滋養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，通過(guò)上調(diào)NLRP3通路促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞焦亡
在我們最近的研究中，我們對(duì)暴露于BPDE的Swan 71細(xì)胞進(jìn)行了全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并鑒定出一組新的lncRNA。在這項(xiàng)工作中，我們重點(diǎn)研究了lnc-HZ14。我們進(jìn)一步驗(yàn)證了lnc-HZ14在BPDE暴露的Swan 71和HTR-8/SVneo細(xì)胞中高表達(dá)(圖2A)。CCK8結(jié)果顯示，BPDE暴露誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞死亡，lnc-HZ14的敲低減少了BPDE誘導(dǎo)的滋養(yǎng)細(xì)胞死亡(圖2B)，表明BPDE暴露至少部分通過(guò)上調(diào)lnc-HZ14誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞死亡。為了進(jìn)一步探索其調(diào)控作用，我們以空載體細(xì)胞為對(duì)照組，在人滋養(yǎng)細(xì)胞Swan 71細(xì)胞中過(guò)表達(dá)lnc-HZ14，并通過(guò)RT-qPCR驗(yàn)證其效率。然后對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行mRNA測(cè)序，得到1128個(gè)下調(diào)mRNA和589個(gè)上調(diào)mRNA (圖2C)。對(duì)這些差異表達(dá)mRNA的GO(圖2D)分析顯示，lnc-HZ14可能調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞免疫系統(tǒng)、先天免疫反應(yīng)以及生長(zhǎng)和死亡，這些都與細(xì)胞焦亡有關(guān)。在測(cè)序數(shù)據(jù)中，我們還發(fā)現(xiàn)lnc-HZ14過(guò)表達(dá)的Swan 71細(xì)胞中，NLRP3、Caspase1、GSDMD和IL-1 β等焦亡相關(guān)基因的mRNA水平均顯著升高(圖2E)，這表明lnc-HZ14可能調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細(xì)胞的焦亡。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一點(diǎn)，lnc-HZ14在Swan 71和HTR-8/ SVneo細(xì)胞中過(guò)表達(dá)或沉默。lnc-HZ14過(guò)表達(dá)導(dǎo)致滋養(yǎng)層細(xì)胞焦亡(圖2F)。lnc-HZ14過(guò)表達(dá)也降低了滋養(yǎng)層細(xì)胞的活力，這種降低可以通過(guò)用VX765(一種典型的細(xì)胞焦亡抑制劑)處理細(xì)胞來(lái)逆轉(zhuǎn)(圖2G)。過(guò)表達(dá)lnc-HZ14使NLRP3、Caspase1、GSDMD mRNA水平升高，NLRP3、Pro-Caspase1、cleave-Caspase1、GSDMD、GSDMD-N蛋白水平升高(圖2H、J)；而lnc-HZ14的敲低則降低了NLRP3和Caspase1的mRNA和蛋白表達(dá)水平，而對(duì)cleaved-Caspase1和GSDMD-N的表達(dá)水平影響不大(圖2I,K)。與此同時(shí)，lnc-HZ14過(guò)表達(dá)的滋養(yǎng)細(xì)胞中，cleave-IL-1β蛋白水平也較高，而lnc-HZ14沉默的細(xì)胞中，cleave-IL-1β蛋白水平?jīng)]有進(jìn)一步下降(圖2J,K)。綜上所述，lnc-HZ14在BPDE暴露的人滋養(yǎng)細(xì)胞中高表達(dá)，通過(guò)上調(diào)NLRP3/Caspase1/GSDMD通路促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞焦亡。
3）Lnc-HZ14增強(qiáng)了METTL3介導(dǎo)的NLRP3 mRNA的穩(wěn)定性
隨后，我們探討了lnc-HZ14如何調(diào)節(jié)NLRP3 mRNA水平。首先，我們?cè)u(píng)估了lnc-HZ14對(duì)NLRP3 mRNA穩(wěn)定性的影響。Lnc-HZ14過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了兩種滋養(yǎng)細(xì)胞中NLRP3 mRNA的穩(wěn)定性(圖3A)。MeRIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)了NLRP3 mRNA的m6A修飾(圖3B)。隨后，我們發(fā)現(xiàn)lnc-HZ14過(guò)表達(dá)增加了NLRP3 mRNA的m6A修飾水平(圖3B)。我們檢測(cè)了過(guò)表達(dá)或敲低METTL3或METTL14的滋養(yǎng)細(xì)胞中NLRP3的mRNA水平。結(jié)果顯示，METTL3的過(guò)表達(dá)增加，而METTL3的敲低降低NLRP3的mRNA水平降低(圖3C)。然而，NLRP3的mRNA水平在METTL14的過(guò)表達(dá)或敲低后沒(méi)有顯著變化。因此，我們利用METTL3研究了NLRP3 mRNA的m6A修飾。NLRP3 mRNA的m6A修飾水平隨著METTL3過(guò)表達(dá)而升高，隨著METTL3敲低而降低(圖3D)。因此，METTL3過(guò)表達(dá)上調(diào)，而METTL3敲低則下調(diào)NLRP3蛋白水平(圖3E)。此外，lnc-HZ14過(guò)表達(dá)也上調(diào)，而lnc-HZ14敲低則降低METTL3蛋白水平(圖3F)。過(guò)表達(dá)lnc-HZ14進(jìn)一步增加了NLRP3 mRNA上m6A修飾水平(圖3B)。綜上所述，lnc-HZ14上調(diào)了METTL3表達(dá)水平，增加了METTL3介導(dǎo)的NLRP3 mRNA上m6A修飾水平，從而增強(qiáng)了NLRP3 mRNA的穩(wěn)定性。
4）Lnc-HZ14促進(jìn)了IRF1介導(dǎo)的ZBP1轉(zhuǎn)錄及其蛋白與NLRP3的相互作用
有報(bào)道稱ZBP1可誘導(dǎo)NLRP3活化，形成ZBP1-NLRP3炎性體，誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡。然而，其在滋養(yǎng)細(xì)胞焦亡中的形成及其作用尚未被研究。因此，我們探索lnc-HZ14是否以及如何調(diào)節(jié)ZBP1的表達(dá)水平。有報(bào)道稱，在原代骨髓源性巨噬細(xì)胞(BMDM)和肺成纖維細(xì)胞中，IRF1是ZBP1的轉(zhuǎn)錄因子。在Swan 71細(xì)胞中，IRF1過(guò)表達(dá)上調(diào)，而IRF1敲低下調(diào)ZBP1 mRNA和蛋白水平(圖4A,B)。此外，lnc-HZ14過(guò)表達(dá)也增加，而lnc-HZ14沉默減少IRF1蛋白水平(圖4C)。mRNA測(cè)序數(shù)據(jù)顯示，在lnc-HZ14過(guò)表達(dá)的Swan 71細(xì)胞中，ZBP1 mRNA水平顯著升高(圖2E)。隨后，我們發(fā)現(xiàn)lnc-HZ14過(guò)表達(dá)上調(diào)ZBP1 mRNA和蛋白水平(圖4C,D)；而lnc-HZ14的敲除下調(diào)了它們的表達(dá)水平(圖4C,D)。IRF1 ChIP實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，IRF1可以結(jié)合ZBP1的啟動(dòng)子區(qū)域，lnc-HZ14過(guò)表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)了這種結(jié)合(圖4E)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)還顯示，IRF1對(duì)ZBP1的野生型啟動(dòng)子序列具有轉(zhuǎn)錄活性，而對(duì)ZBP1的突變型啟動(dòng)子序列沒(méi)有活性；lnc-HZ14過(guò)表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)了這種轉(zhuǎn)錄活性(圖4F)。雖然有報(bào)道稱ZBP1和NLRP3可以形成ZBP1-NLRP3炎性體，但它們之間是否存在物理相互作用尚不清楚。在滋養(yǎng)細(xì)胞中，我們發(fā)現(xiàn)ZBP1和NLRP3之間存在蛋白相互作用，并且這種相互作用隨著lnc-HZ14的過(guò)表達(dá)而進(jìn)一步增強(qiáng)(圖4G)。因此，lnc-HZ14上調(diào)ZBP1和NLPR3的表達(dá)水平，也增強(qiáng)了它們之間的蛋白相互作用，從而促進(jìn)ZBP1-NLRP3炎癥小體的形成和滋養(yǎng)細(xì)胞的焦亡。
5）BPDE暴露通過(guò)上調(diào)lnc-HZ14/ZBP1/NLRP3軸誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞焦亡
BPDE暴露還上調(diào)了ZBP1的mRNA和蛋白水平(圖5A、B)以及IRF1的蛋白水平(圖5B)，并在IRF1 ChIP檢測(cè)中增強(qiáng)了IRF1在ZBP1啟動(dòng)子區(qū)域的占據(jù)(圖5C)，從而促進(jìn)了IRF1介導(dǎo)的ZBP1 mRNA在BPDE暴露的滋養(yǎng)細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄。同時(shí)，BPDE暴露還增加了METTL3蛋白水平(圖5B)和NLRP3 mRNA上的m6A修飾水平(圖5D)。在BPDE暴露的Swan 71細(xì)胞中，METTL3的再敲低降低了NLRP3 mRNA上的m6A修飾(圖5E)。此外，lnc-HZ14、NLRP3或ZBP1的敲除降低了BPDE暴露的滋養(yǎng)細(xì)胞中cleaved-caspase 1和GSDMD-N的表達(dá)水平(圖5F)。在細(xì)胞表型上，BPDE暴露導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞大量死亡，細(xì)胞腫脹、膜破裂等典型的焦亡形態(tài)；lnc-HZ14、NLRP3或ZBP1的敲低均可減少滋養(yǎng)層細(xì)胞的焦亡(圖5G)。綜上所述，BPDE暴露通過(guò)上調(diào)lnc-HZ14/ZBP1/NLRP3軸誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞焦亡，下調(diào)lnc-HZ14/ZBP1/NLRP3軸可有效緩解BPDE誘導(dǎo)的滋養(yǎng)細(xì)胞焦亡。
6）Lnc-HZ14/ZBP1/NLRP3軸與RM絨毛組織焦亡有關(guān)
為了探討絨毛組織是否可能發(fā)生焦亡，以及這種焦亡是否與流產(chǎn)相關(guān)，我們收集了原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RM)組和與其匹配的健康對(duì)照組(HC)組的絨毛組織樣本，并評(píng)估了幾種典型焦亡基因的表達(dá)水平。我們發(fā)現(xiàn)，與HC組相比，RM組NLRP3、Caspase1、GSDMD和IL-1β的mRNA水平(圖6A)以及NLRP3、Caspase1、cleave -Caspase1、GSDMD、GSDMD-N和IL-1β的蛋白水平均較高(圖6B、C)。隨后，在絨毛組織中分析lnc-HZ14/ZBP1/NLRP3軸。首先，通過(guò)RT-qPCR分析證實(shí)，lnc-HZ14和ZBP1 mRNA在RM和絨毛組織中高表達(dá)(圖6D,E)。其次，RM組織中IRF1和ZBP1蛋白水平高于HC組織(圖6F,G)。IRF1 ChIP實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步顯示，相對(duì)于HC絨毛組織，RM中更多的ZBP1啟動(dòng)子區(qū)域被IRF1富集(圖H)。第三，與HC組織相比，RM組織的METTL3蛋白水平也更高(圖6F,G)。因此，在RM組織中，NLRP3 mRNA的m6A修飾水平也增加了(圖6I)。最后，隨機(jī)使用6個(gè)RM和HC絨毛組織樣本進(jìn)行Co-IP檢測(cè)，結(jié)果顯示RM組被NLRP3拉下的ZBP1蛋白水平明顯高于HC組(圖6J,K)。因此，這些數(shù)據(jù)都支持RM組織相對(duì)于HC絨毛組織存在更高水平的焦亡，這可以通過(guò)lnc-HZ14/ZBP1/NLRP3軸的上調(diào)來(lái)證明。
7）BaP暴露誘導(dǎo)小鼠胎盤(pán)組織焦亡和流產(chǎn)
為了直接評(píng)估BaP暴露導(dǎo)致胎盤(pán)組織焦亡進(jìn)而導(dǎo)致流產(chǎn)的因果關(guān)系，我們構(gòu)建了一個(gè)小鼠模型，將妊娠小鼠暴露于BaP誘導(dǎo)流產(chǎn)。BaP暴露增加胚胎吸附，提高流產(chǎn)率(圖7A, B)。BaP暴露小鼠胎盤(pán)組織中Nlrp3 mRNA水平(圖7C)以及Nlrp3、Caspase1、cleaved -Caspase1、Gsdmd-N和Il-1β蛋白水平(圖7D、E)均高于對(duì)照組，表明BaP暴露導(dǎo)致BaP暴露小鼠胎盤(pán)組織焦亡并誘導(dǎo)流產(chǎn)。BaP暴露上調(diào)了BaP暴露小鼠胎盤(pán)組織中Zbp1 mRNA水平(圖7F)以及Irf1和Zbp1蛋白水平(圖7G,H)。此外，BPDE暴露也上調(diào)了Mettl3蛋白水平(圖7G,H)。我們還構(gòu)建了以AS-Nlrp3(敲低小鼠Nlrp3)治療BaP暴露小鼠的流產(chǎn)干預(yù)模型。BaP暴露可上調(diào)Nlrp3、cleaved-Caspase1、Gsdmd-N和Il-1β蛋白水平，而敲低Nlrp3可下調(diào)其在BaP暴露小鼠胎盤(pán)組織中的表達(dá)水平(圖7I、J)。敲低Nlrp3進(jìn)一步有效地減少了BaP暴露小鼠的胚胎吸附，降低了流產(chǎn)率(圖7K,L)。因此，這些結(jié)果表明，BaP暴露引起胎盤(pán)組織焦亡，進(jìn)而導(dǎo)致BaP暴露小鼠流產(chǎn)。
8）血清IL-1β可作為預(yù)測(cè)流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)的檢測(cè)指標(biāo)
IL-1β是一種典型的分泌性蛋白，是提示強(qiáng)烈炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵炎癥因子。然后，我們探討血清IL-1β是否可以作為預(yù)測(cè)流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)的檢測(cè)指標(biāo)。結(jié)果表明，HC組IL-1β水平范圍為9.99 ~ 43.6 pg/mL，平均±SD為27.1±9.56 pg/mL；RM組IL-1β水平范圍為16.7 ~ 69.8 pg/mL，平均±SD為44.7±15.6 pg/mL(圖8A,B)。與HC血清樣品相比，RM血清樣品中IL-1β水平顯著升高。HC血清中IL-1β蛋白水平呈正態(tài)分布(圖8C、D)。隨著血清IL-1β水平的升高，RM在總女性中的比例呈上升趨勢(shì)(圖8E)，表明血清IL-1β水平越高，流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)越高。條件logistic回歸進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)(圖8F)。ROC曲線分析顯示，血清IL-1β水平在95%置信區(qū)間內(nèi)的曲線下面積(AUC)值為0.830，表明IL-1β可能具有較好的預(yù)測(cè)能力，具有較高的特異性和敏感性(圖8G)。這些數(shù)據(jù)表明血清IL-1β蛋白水平可能是反映流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)的有希望的指標(biāo)。
結(jié)論
我們的研究結(jié)果揭示了BaP/BPDE誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞焦亡和生殖毒性的潛在機(jī)制，指出了BaP/BPDE對(duì)雌性生殖的潛在風(fēng)險(xiǎn)。
實(shí)驗(yàn)方法
細(xì)胞焦亡形態(tài)的顯微鏡成像，CCK-8，RT-qPCR，RNA穩(wěn)定性分析，WB，ELISA，ChIP，熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，Co-IP，MeRIP。
參考文獻(xiàn)
Wang R, Xu X, Yang J, Chen W, Zhao J, Wang M, Zhang Y, Yang Y, Huang W, Zhang H. BPDE exposure promotes trophoblast cell pyroptosis and induces miscarriage by up-regulating lnc-HZ14/ZBP1/NLRP3 axis. J Hazard Mater. 2023 Aug 5;455:131543. doi: 10.1016/j.jhazmat.2023.131543.