國(guó)自然熱點(diǎn)之一tsRNA——5′-tiRNA-Gln控制肝細(xì)胞癌發(fā)展

       tRNA衍生的小RNA（tsRNA）是新型的非編碼RNA，參與各種疾病的發(fā)生和發(fā)展。然而，它們?cè)诟渭?xì)胞癌（HCC）中的確切存在和功能仍不清楚。本研究中，對(duì)HCC中差異表達(dá)的tsRNA進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)一種新的tsRNA，tRNA Gln-TTG衍生的5′-tiRNA-Gln明顯下調(diào)，其表達(dá)水平與患者的病情發(fā)展相關(guān)聯(lián)。5′-tiRNA-Gln通過(guò)結(jié)合真核啟動(dòng)因子4A-I（EIF4A1）發(fā)揮其功能，導(dǎo)致翻譯受到部分抑制，控制HCC的發(fā)展。該研究于2023年3月發(fā)表在《Frontiers of Medicine》，IF：8.1。 
技術(shù)路線

主要研究結(jié)果
1. HCC和正常組織中tsRNA特征普分析
       為了確定特定的tsRNA在原發(fā)性HCC中的表達(dá)，作者通過(guò)RNA-PAGE分析4對(duì)腫瘤和鄰近的非腫瘤肝組織tiRNA的水平。HCC組織的總tiRNA低于鄰近組織（圖1A）。通過(guò)高通量測(cè)序?qū)@些樣本的小RNA轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，無(wú)論在腫瘤還是鄰近的非腫瘤組織中，reads數(shù)都在20-24 nt和31-33 nt富集（圖1B）。miRNA占總reads數(shù)的絕大部分，其次是tsRNA和前體tRNA（圖1C）。腫瘤組織中有77個(gè)tsRNA，非腫瘤組織中有67個(gè)tsRNA，共有tsRNA 有208個(gè)（圖1D）。無(wú)論是在腫瘤還是鄰近的非腫瘤組織中，5-tRF所占比例最高，其次是3-tRF和5′-tiRNA（圖1E和1F）。

圖1. HCC組織中的小ncRNA概況

2. 5′-tiRNA-Gln在腫瘤組織中下調(diào)，負(fù)向調(diào)節(jié)HCC轉(zhuǎn)移和腫瘤大小
       對(duì)差異表達(dá)的tsRNA進(jìn)行分析，總共發(fā)現(xiàn)80個(gè)上調(diào)的和74個(gè)下調(diào)的tsRNA（圖2A）。其中包括19個(gè)tiRNA（圖2B），只有5′-tiRNA-Gln的表達(dá)與數(shù)據(jù)庫(kù)中一致。通過(guò)RT-qPCR在76個(gè)HCC組織對(duì)中驗(yàn)證了5′-tiRNA-Gln的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與差異分析結(jié)果一致，5′-tiRNA-Gln在腫瘤組織中明顯下調(diào)，表明具有腫瘤抑制作用（圖2C）。Northern blot實(shí)驗(yàn)也得到了類似的結(jié)果（圖2D）。作者還發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)移組的5′-tiRNA- Gln的相對(duì)平均水平明顯低于非轉(zhuǎn)移組（圖2E）。且5′-tiRNA-Gln表達(dá)水平的降低與大腫瘤呈正相關(guān)（圖2F）。這些結(jié)果表明，5′-tiRNA-Gln在HCC中明顯下調(diào)，在HCC轉(zhuǎn)移和腫瘤大小中起著負(fù)向調(diào)節(jié)作用。

圖2. 5′-tiRNA -Gln在HCC組織中下調(diào)并與HCC進(jìn)展有關(guān)

3. 過(guò)表達(dá)5′-tiRNA-Gln抑制HCC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲
       5′-tiRNA-Gln mimics轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，分析它對(duì)HCC細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和侵襲的影響。CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示，5′-tiRNA-Gln mimics降低細(xì)胞的活力（圖3A）。Transwell實(shí)驗(yàn)顯示，5′-tiRNA-Gln mimics的過(guò)表達(dá)降低了Huh-7細(xì)胞的遷移和侵襲能力（圖3B）。siRNA進(jìn)行功能缺失實(shí)驗(yàn)，之后對(duì)細(xì)胞活力、遷移和侵襲進(jìn)行研究（圖3C和3D），結(jié)果表明，5′-tiRNA-Gln的敲除增強(qiáng)SK-Hep-1細(xì)胞的生存能力、遷移和侵襲。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染5′-tiRNA-Gln或?qū)φ誖NA的Huh-7細(xì)胞皮下注射到裸鼠體內(nèi)，6周后，與對(duì)照組相比，5′-tiRNA-Gln腫瘤重量更少（圖3E）。菌落形成實(shí)驗(yàn)也得到類似的結(jié)果（圖3F）。這些結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)5′-tiRNA-Gln抑制HCC細(xì)胞的活力。

圖3. 5′-tiRNA-Gln可抑制HCC細(xì)胞在體外和體內(nèi)的增殖、遷移和侵襲。

4. 5′-tiRNA-Gln與EIF4A1選擇性互作
       將生物素標(biāo)記的5′-tiRNA-Gln轉(zhuǎn)染到Huh-7細(xì)胞中48小時(shí)，MS鑒定出84個(gè)特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。根據(jù)蛋白質(zhì)的得分，EIF4A1被選為候選人（圖4A），它是翻譯啟動(dòng)過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵酶。根據(jù)GEPIA生存曲線分析，HCC中較高的EIF4A1表達(dá)水平意味著較低的生存率（圖4B），表明其具有腫瘤蛋白作用。RNA pull-down實(shí)驗(yàn)證明，EIF4A1與5′-tiRNA- Gln有更強(qiáng)的結(jié)合力（圖4C）。RIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)，5′-tiRNA-Gln在EIF4A1免疫沉淀物中明顯富集（圖4D）。RNA FISH和免疫熒光檢測(cè)顯示，5′-tiRNA-Gln和EIF4A1在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)生共定位（圖4E）。因此，作者推斷5′-tiRNA-Gln通過(guò)與細(xì)胞質(zhì)中的EIF4A1相互作用來(lái)抑制HCC腫瘤發(fā)展。

圖4. 5′-tiRNA-Gln與EIF4A1選擇性互作

5. 5′-tiRNA-Gln過(guò)表達(dá)抑制翻譯
       通過(guò)嘌呤霉素捕獲，確定新生蛋白合成水平（圖5A），驗(yàn)證5′-tiRNA-Gln對(duì)EIF4A1功能的影響。結(jié)果顯示，5′-tiRNA-Gln抑制蛋白質(zhì)的合成率。COG/KOG功能分類分析表明，下調(diào)的蛋白主要與轉(zhuǎn)錄和翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物生成過(guò)程有關(guān)（圖5C）。對(duì)下調(diào)蛋白的KEGG分析顯示，乙型肝炎、MAPK信號(hào)傳導(dǎo)、丙型肝炎和癌癥的途徑發(fā)生顯著變化（圖5D）。Western blot表明，通過(guò)過(guò)表達(dá)5′-tiRNA-Gln和下游的磷酸化蛋白（p-ERK1/2和p- STAT3），ARAF、MEK1/2和STAT3的表達(dá)被下調(diào)。然而，在BID的表達(dá)中沒(méi)有觀察到明顯的差異（圖5E）。這些結(jié)果表明，5′-tiRNA-Gln的過(guò)量表達(dá)直接針對(duì)EIF4A1的功能，而不是其表達(dá)水平，從而抑制了EIF4A1相關(guān)翻譯。

圖5. 5′-tiRNA-Gln在Huh-7細(xì)胞中抑制翻譯

6. G-四鏈體結(jié)構(gòu)是5′-tiRNA-Gln的必要條件
       根據(jù)QGRS Mapper構(gòu)建了沒(méi)有能力形成G-四聯(lián)體的突變體5′-tiRNA-Gln。通過(guò)過(guò)表達(dá)突變體5′-tiRNA-Gln，研究了Huh-7細(xì)胞的活力、遷移和侵襲能力（圖6A和6B）。突變體與5′-tiRNA-Gln有明顯差異。RNA pull-down實(shí)驗(yàn)表明突變體5′-tiRNA-Gln未能特異性地下拉EIF4A1（圖6C）。接下來(lái)測(cè)定了多聚核糖體的情況，結(jié)果顯示，與突變體相比，5′-tiRNA-Gln減少了mRNA與多聚核糖體的結(jié)合（圖6D）。進(jìn)一步， 檢測(cè)了ARAF、MEK1/2和STAT3的表達(dá)。ARAF、MEK1/2和STAT3的mRNA沒(méi)有明顯差異（圖6E），而與突變體相比，過(guò)表達(dá)5′-tiRNA-Gln明顯降低了它們與EIF4A1的mRNA（圖6F）和蛋白質(zhì)結(jié)合水平（圖6G）。這些結(jié)果表明，5′-tiRNA-Gln形成G-四鏈體的潛力，是其調(diào)節(jié)EIF4A1介導(dǎo)的翻譯和抑制HCC進(jìn)展的必要條件。

圖6. 突變的5′-tiRNA-Gln失去了抑制Huh-7細(xì)胞活力的功能

7. HCC腫瘤中5′-tiRNA-Gln的表達(dá)水平與ARAF、MEK1/2或STAT3的免疫表達(dá)負(fù)相關(guān)
       IHC染色和Spearman相關(guān)性分析顯示，HCC組織中5′-tiRNA-Gln和ARAF、MEK1/2或STAT3的表達(dá)水平有明顯的負(fù)相關(guān)（圖7A）。圖7B為5′-tiRNA-Gln在HCC進(jìn)展中的作用示意圖。

圖7. HCC組織中5′-tiRNA-Gln與ARAF、MEK1/2和STAT3的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)

結(jié)論
       綜上所述，該研究分析了HCC中差異表達(dá)的tsRNA，并發(fā)現(xiàn)了一種新的tiRNA，即5′-tiRNA-Gln，它是一種腫瘤抑制因子。5′-tiRNA-Gln與EIF4A1相互作用，通過(guò)分子內(nèi)G-四鏈體結(jié)構(gòu)負(fù)向調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白的翻譯，抑制了HCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

實(shí)驗(yàn)方法
RNA-PAGE，RT-qPCR，Northern blot，siRNA干擾，Transwell，裸鼠成瘤，菌落實(shí)驗(yàn)，RNA pull-down，RIP，RNA FISH，Western blot，多聚核糖體分析，質(zhì)譜分析，IHC染色
參考文獻(xiàn)
Wu C, Liu D, Zhang L, Wang J, Ding Y, Sun Z, Wang W. 5'-tiRNA-Gln inhibits hepatocellular carcinoma progression by repressing translation through the interaction with eukaryotic initiation factor 4A-I. Front Med. 2023 Mar 28. doi: 10.1007/s11684-022-0966-6. Epub ahead of print. PMID: 36973570.