國自然熱點之一tsRNA——5′-tiRNA-Gln控制肝細胞癌發(fā)展

       tRNA衍生的小RNA（tsRNA）是新型的非編碼RNA，參與各種疾病的發(fā)生和發(fā)展。然而，它們在肝細胞癌（HCC）中的確切存在和功能仍不清楚。本研究中，對HCC中差異表達的tsRNA進行分析。發(fā)現(xiàn)一種新的tsRNA，tRNA Gln-TTG衍生的5′-tiRNA-Gln明顯下調，其表達水平與患者的病情發(fā)展相關聯(lián)。5′-tiRNA-Gln通過結合真核啟動因子4A-I（EIF4A1）發(fā)揮其功能，導致翻譯受到部分抑制，控制HCC的發(fā)展。該研究于2023年3月發(fā)表在《Frontiers of Medicine》，IF：8.1。 
技術路線

主要研究結果
1. HCC和正常組織中tsRNA特征普分析
       為了確定特定的tsRNA在原發(fā)性HCC中的表達，作者通過RNA-PAGE分析4對腫瘤和鄰近的非腫瘤肝組織tiRNA的水平。HCC組織的總tiRNA低于鄰近組織（圖1A）。通過高通量測序對這些樣本的小RNA轉錄組進行分析。結果顯示，無論在腫瘤還是鄰近的非腫瘤組織中，reads數(shù)都在20-24 nt和31-33 nt富集（圖1B）。miRNA占總reads數(shù)的絕大部分，其次是tsRNA和前體tRNA（圖1C）。腫瘤組織中有77個tsRNA，非腫瘤組織中有67個tsRNA，共有tsRNA 有208個（圖1D）。無論是在腫瘤還是鄰近的非腫瘤組織中，5-tRF所占比例最高，其次是3-tRF和5′-tiRNA（圖1E和1F）。

圖1. HCC組織中的小ncRNA概況

2. 5′-tiRNA-Gln在腫瘤組織中下調，負向調節(jié)HCC轉移和腫瘤大小
       對差異表達的tsRNA進行分析，總共發(fā)現(xiàn)80個上調的和74個下調的tsRNA（圖2A）。其中包括19個tiRNA（圖2B），只有5′-tiRNA-Gln的表達與數(shù)據(jù)庫中一致。通過RT-qPCR在76個HCC組織對中驗證了5′-tiRNA-Gln的表達水平。結果顯示，與差異分析結果一致，5′-tiRNA-Gln在腫瘤組織中明顯下調，表明具有腫瘤抑制作用（圖2C）。Northern blot實驗也得到了類似的結果（圖2D）。作者還發(fā)現(xiàn)，轉移組的5′-tiRNA- Gln的相對平均水平明顯低于非轉移組（圖2E）。且5′-tiRNA-Gln表達水平的降低與大腫瘤呈正相關（圖2F）。這些結果表明，5′-tiRNA-Gln在HCC中明顯下調，在HCC轉移和腫瘤大小中起著負向調節(jié)作用。

圖2. 5′-tiRNA -Gln在HCC組織中下調并與HCC進展有關

3. 過表達5′-tiRNA-Gln抑制HCC細胞增殖、遷移和侵襲
       5′-tiRNA-Gln mimics轉染24小時后，分析它對HCC細胞生長、遷移和侵襲的影響。CCK-8實驗顯示，5′-tiRNA-Gln mimics降低細胞的活力（圖3A）。Transwell實驗顯示，5′-tiRNA-Gln mimics的過表達降低了Huh-7細胞的遷移和侵襲能力（圖3B）。siRNA進行功能缺失實驗，之后對細胞活力、遷移和侵襲進行研究（圖3C和3D），結果表明，5′-tiRNA-Gln的敲除增強SK-Hep-1細胞的生存能力、遷移和侵襲。將穩(wěn)定轉染5′-tiRNA-Gln或對照RNA的Huh-7細胞皮下注射到裸鼠體內，6周后，與對照組相比，5′-tiRNA-Gln腫瘤重量更少（圖3E）。菌落形成實驗也得到類似的結果（圖3F）。這些結果表明，過表達5′-tiRNA-Gln抑制HCC細胞的活力。

圖3. 5′-tiRNA-Gln可抑制HCC細胞在體外和體內的增殖、遷移和侵襲。

4. 5′-tiRNA-Gln與EIF4A1選擇性互作
       將生物素標記的5′-tiRNA-Gln轉染到Huh-7細胞中48小時，MS鑒定出84個特異性結合的蛋白質。根據(jù)蛋白質的得分，EIF4A1被選為候選人（圖4A），它是翻譯啟動過程中的一個關鍵酶。根據(jù)GEPIA生存曲線分析，HCC中較高的EIF4A1表達水平意味著較低的生存率（圖4B），表明其具有腫瘤蛋白作用。RNA pull-down實驗證明，EIF4A1與5′-tiRNA- Gln有更強的結合力（圖4C）。RIP實驗證實，5′-tiRNA-Gln在EIF4A1免疫沉淀物中明顯富集（圖4D）。RNA FISH和免疫熒光檢測顯示，5′-tiRNA-Gln和EIF4A1在細胞質中發(fā)生共定位（圖4E）。因此，作者推斷5′-tiRNA-Gln通過與細胞質中的EIF4A1相互作用來抑制HCC腫瘤發(fā)展。

圖4. 5′-tiRNA-Gln與EIF4A1選擇性互作

5. 5′-tiRNA-Gln過表達抑制翻譯
       通過嘌呤霉素捕獲，確定新生蛋白合成水平（圖5A），驗證5′-tiRNA-Gln對EIF4A1功能的影響。結果顯示，5′-tiRNA-Gln抑制蛋白質的合成率。COG/KOG功能分類分析表明，下調的蛋白主要與轉錄和翻譯、核糖體結構和生物生成過程有關（圖5C）。對下調蛋白的KEGG分析顯示，乙型肝炎、MAPK信號傳導、丙型肝炎和癌癥的途徑發(fā)生顯著變化（圖5D）。Western blot表明，通過過表達5′-tiRNA-Gln和下游的磷酸化蛋白（p-ERK1/2和p- STAT3），ARAF、MEK1/2和STAT3的表達被下調。然而，在BID的表達中沒有觀察到明顯的差異（圖5E）。這些結果表明，5′-tiRNA-Gln的過量表達直接針對EIF4A1的功能，而不是其表達水平，從而抑制了EIF4A1相關翻譯。

圖5. 5′-tiRNA-Gln在Huh-7細胞中抑制翻譯

6. G-四鏈體結構是5′-tiRNA-Gln的必要條件
       根據(jù)QGRS Mapper構建了沒有能力形成G-四聯(lián)體的突變體5′-tiRNA-Gln。通過過表達突變體5′-tiRNA-Gln，研究了Huh-7細胞的活力、遷移和侵襲能力（圖6A和6B）。突變體與5′-tiRNA-Gln有明顯差異。RNA pull-down實驗表明突變體5′-tiRNA-Gln未能特異性地下拉EIF4A1（圖6C）。接下來測定了多聚核糖體的情況，結果顯示，與突變體相比，5′-tiRNA-Gln減少了mRNA與多聚核糖體的結合（圖6D）。進一步， 檢測了ARAF、MEK1/2和STAT3的表達。ARAF、MEK1/2和STAT3的mRNA沒有明顯差異（圖6E），而與突變體相比，過表達5′-tiRNA-Gln明顯降低了它們與EIF4A1的mRNA（圖6F）和蛋白質結合水平（圖6G）。這些結果表明，5′-tiRNA-Gln形成G-四鏈體的潛力，是其調節(jié)EIF4A1介導的翻譯和抑制HCC進展的必要條件。

圖6. 突變的5′-tiRNA-Gln失去了抑制Huh-7細胞活力的功能

7. HCC腫瘤中5′-tiRNA-Gln的表達水平與ARAF、MEK1/2或STAT3的免疫表達負相關
       IHC染色和Spearman相關性分析顯示，HCC組織中5′-tiRNA-Gln和ARAF、MEK1/2或STAT3的表達水平有明顯的負相關（圖7A）。圖7B為5′-tiRNA-Gln在HCC進展中的作用示意圖。

圖7. HCC組織中5′-tiRNA-Gln與ARAF、MEK1/2和STAT3的表達呈負相關

結論
       綜上所述，該研究分析了HCC中差異表達的tsRNA，并發(fā)現(xiàn)了一種新的tiRNA，即5′-tiRNA-Gln，它是一種腫瘤抑制因子。5′-tiRNA-Gln與EIF4A1相互作用，通過分子內G-四鏈體結構負向調節(jié)相關蛋白的翻譯，抑制了HCC細胞的增殖、遷移和侵襲。

實驗方法
RNA-PAGE，RT-qPCR，Northern blot，siRNA干擾，Transwell，裸鼠成瘤，菌落實驗，RNA pull-down，RIP，RNA FISH，Western blot，多聚核糖體分析，質譜分析，IHC染色
參考文獻
Wu C, Liu D, Zhang L, Wang J, Ding Y, Sun Z, Wang W. 5'-tiRNA-Gln inhibits hepatocellular carcinoma progression by repressing translation through the interaction with eukaryotic initiation factor 4A-I. Front Med. 2023 Mar 28. doi: 10.1007/s11684-022-0966-6. Epub ahead of print. PMID: 36973570.