基因組和轉(zhuǎn)錄組學分析揭示甲狀旁腺癌的分子特征

       基因組和轉(zhuǎn)錄組學分析增強了許多癌癥的診斷和治療選擇。然而，甲狀旁腺癌的分子特征在很大程度上仍未被探索，從而限制了新的治療干預措施的發(fā)展。在此，作者對50例甲狀旁腺組織（腫瘤12例，腺瘤28例，正常組織10例）進行了基因組和轉(zhuǎn)錄組測序，以研究甲狀旁腺癌的內(nèi)在和比較分子特征。作者在細胞分裂周期73（cell division cycle 73，CDC73）中證實了多個2-hit突變模式，并收斂于雙等位基因失活，從而質(zhì)疑其他基因是否存在第二個hit。此外，在具有生殖系突變的拷貝中，CDC73的等位基因特異性抑制表明在腫瘤發(fā)生之前存在選擇性壓力。轉(zhuǎn)錄組學分析發(fā)現(xiàn)，與腺瘤和正常組織相比，癌組織中E2F靶點、KRAS和TNF-α信號通路以及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化通路的表達上調(diào)。基于腫瘤特異性基因的分子分類模型將腫瘤與腺瘤和正常組織明顯分開，在2例惡性潛能不確定的患者中證明了該模型的臨床實用性。更深層次的基因表達分析和功能預測提示W(wǎng)ilms瘤1（^WT1）是CDC73突變甲狀旁腺癌的潛在生物標志物，并通過免疫組化進一步驗證?？偟膩碚f，作者的研究揭示了甲狀旁腺癌的基因組和轉(zhuǎn)錄組圖譜，并可能有助于指導未來的精準診斷和治療改進。本研究于2023年6月發(fā)表于《Experimental & Molecular Medicine》期刊上，IF：12.8，二區(qū)。

技術(shù)路線

主要研究結(jié)果
1、甲狀旁腺癌的臨床及生化特征
       總共收集了三組共50例甲狀腺組織，其中甲狀旁腺癌12例，甲狀旁腺腺瘤28例，正常甲狀旁腺組織10例，用于基因組和轉(zhuǎn)錄組分析（圖1）。對于基因組圖譜，作者對匹配血液樣本的癌組織進行了WES分析。對于轉(zhuǎn)錄組分析，對所有3組進行RNA測序，所得數(shù)據(jù)用于基因和基因集水平的分析。
       作者首先分析了甲狀旁腺腫瘤的臨床及生化特征（表1）。而正常組個體年齡最?。ㄆ骄挲g=38.4），癌組個體年齡小于腺瘤組個體（平均年齡=61.3歲），代表了普遍存在的遺傳危險因素（即CDC73基因座雜合性丟失）。作者發(fā)現(xiàn)在所有三組中女性占優(yōu)勢（67-89%），沒有統(tǒng)計學意義上的組特異性差異。甲狀旁腺腺瘤和癌變患者術(shù)前甲狀旁腺激素（PTH）和血鈣水平均高于正常人群，且均以癌變患者最高。同樣，3組患者的血磷水平也存在差異，但腫瘤患者的血磷水平最低。臨床遺傳學檢測（血液的靶向測序）在12例腫瘤患者中發(fā)現(xiàn)6例CDC73基因胚系突變。12例甲狀旁腺癌患者中，3例出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移，2例隨訪期間出現(xiàn)局部復發(fā)。這些發(fā)現(xiàn)與已知的甲狀旁腺癌的臨床特征和預后是一致的。

圖1 研究工作流程示意圖概述

2、甲狀旁腺癌的基因組圖譜
       為研究甲狀旁腺癌的基因組變異情況，作者在10例甲狀旁腺癌樣本中發(fā)現(xiàn)了體細胞突變，其中有匹配的血液樣本（圖2a）。非同義單核苷酸變異（SNVs）和插入-缺失（indels）的數(shù)目在18-848之間，中位數(shù)為59個，每兆堿基對應1.18個突變。除1例具有異常高突變計數(shù)（P5）的樣本外，所有癌癥的突變計數(shù)均低于其他癌癥。
       首先，作者檢測CDC73的突變模式。6例（P5、P6、P11、P22、P32、P75）患者中存在（4個無義SNVs和7個移碼缺失）的胚系或體細胞截短突變，考慮為CDC73-突變型（CDC73^Mut）。作者發(fā)現(xiàn)胚系突變和體細胞突變的基因組位點明顯分開（圖2b）；胚系突變位于Ras-like結(jié)構(gòu)域的上游，Ras-like結(jié)構(gòu)域?qū)τ谂cPAF1（聚合酶相關(guān)因子1）和染色質(zhì)的相互作用至關(guān)重要，而體細胞突變集中在外顯子1-2，表明轉(zhuǎn)錄本完全丟失。6例（P5、P6、P11和P22）患者中有4例出現(xiàn)明顯的2次打擊突變，導致CDC73雙等位基因失活，稱為Knudson’s two-hit假說（即1例胚系易感性和1例獲得性體細胞突變）。1例患者（P32）僅有1個體細胞移碼突變（CDC73p . R52Ifs * 9），但由于雜合性丟失（LOH），伴隨著野生型等位基因的完全丟失，導致雙等位基因失活（圖2c）。1例患者（P75）僅存在種系截短突變（CDC73p . E130Gfs * 11），表現(xiàn)出與早期病理分類的交界性，預示著一個亞克隆體細胞突變的機會。總體而言，所有6例患者的突變模式均表現(xiàn)為截短CDC73導致的雙等位基因失活，反對CDC73以外的基因中存在二次打擊。
       接下來，作者評估了4例攜帶野生型CDC73（CDC73^WT）的（P65、P66、P68、P77）患者的突變譜。作者發(fā)現(xiàn)CDC73^WT（中位數(shù)=29.0）患者的變異體數(shù)量低于CDC73^Mut（中位數(shù)=152.5；p=0.0095，Mann-Whitney檢驗）患者（圖2d），表明其基因組完整性較高。盡管樣本量有限，作者在CDC73^WT患者中觀察到一些復發(fā)突變。在2例CDC73^WT患者（P68為TP53 p . C3F , P77為TP53 p . H61R）中觀察到TP53的體細胞錯義突變，這兩種突變在其他癌癥中都曾被報道過，并且預期是有害的。盡管（p = 0.1333，F(xiàn)isher精確檢驗）不具有統(tǒng)計學意義，但這可能意味著TP53突變在CDC73非依賴性甲狀旁腺癌中的局限性。同樣，在CCDC40（卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域包含40個）的3個體細胞突變中，在CDC73^WT患者（P65和P77）中發(fā)現(xiàn)2個截短移碼突變（CCDC40 p.K970Nfs * 51和CCDC40 p.G987Rfs * 96）。CCDC40突變是已知的原發(fā)性纖毛運動障礙的主要原因，但其與癌癥的相關(guān)性尚未見報道。KMT2D、KRAS（in-frame delete）和FRAT2（WNT信號通路的FRAT調(diào)節(jié)因子2）的其他突變可能與甲狀旁腺癌的發(fā)生有關(guān)；然而，證據(jù)仍然有限。
       突變標簽分析顯示每個癌癥組有兩個不同的標簽：CDC73Mut的SBS13（單堿基替換簽名13）和CDC73^WT的SBS6（圖2e）。在CDC73Mut組中還發(fā)現(xiàn)了SBS1，后來被證實是P5僅此一個的簽名，并且在每個CDC73Mut樣本中都不存在。SBS13是CDC73Mut組發(fā)現(xiàn)的主要標志，已知其與活化的APOBEC胞苷脫氨酶相關(guān)，已被提議作為免疫治療和靶向治療的標志物。進一步的APOBEC富集分析也證實了CDC73Mut組中APOBEC的顯著高相關(guān)性（圖2f），這可能是CDC73Mut和CDC73^WT腫瘤進展機制不同的另一條線索。

圖2 甲狀旁腺癌的基因組圖譜

3、甲狀旁腺癌的轉(zhuǎn)錄組學分析
       使用49個組織的RNA測序數(shù)據(jù)（11個癌，7個CDC73Mut和4個CDC73^WT；28個腺瘤；10例正常甲狀旁腺組織），DEGs分析兩種情況：癌vs正常和腺瘤vs正常（圖3a）。作者發(fā)現(xiàn)整體基因表達譜在腺瘤中高度保守，表現(xiàn)出與正常甲狀旁腺（Pearson相關(guān)系數(shù)r=0.982）基因表達譜的強相關(guān)性。相比之下，（Pearson相關(guān)系數(shù)r=0.943）在癌組織中的基因表達發(fā)生了明顯的偏移。因此，在癌組織（n=1 136）中DEGs的數(shù)量多于腺瘤組織（n=33），其中26個DEGs在兩者中差異表達。因此，鑒定出1110個癌癥和7個腺瘤特異性DEGs。
通路水平分析發(fā)現(xiàn)，癌中富集了許多癌癥標志性通路（圖3b）。特別是，與正常樣本（校正p值< 0.01和FDR < 0.25）相比，E2F靶點、G2M檢查點、糖酵解、Myc靶點和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)的通路上調(diào)。在腺瘤中也觀察到G2M和Myc靶通路的輕度上調(diào)，但KRAS信號和TNF-α信號下調(diào)，與癌相反（p< 0.003）。在腺瘤DEGs的GO富集結(jié)果中，包括即使是微小的1.5倍變化到正常的DEGs，也觀察到屬于細胞生長或神經(jīng)元發(fā)育的基因上調(diào)。
       進一步評估發(fā)現(xiàn)CDC73^Mut和CDC73^WT在通路激活方面存在差異。CDC73^Mut中E2F靶基因的上調(diào)更為顯著，這可能暗示針對較高突變負荷的DNA損傷應答（圖3c）。而E2F和Myc靶點的激活，mTORC1和Hedgehog信號通路被普遍觀察到，CDC73^WT甲狀旁腺癌表現(xiàn)出更強的EMT和氧化磷酸化的激活（圖3d）。眾所周知，EMT在腫瘤進展中的激活與腫瘤發(fā)生和血管生成密切相關(guān)。此外，上調(diào)的氧化磷酸化的組合可以有力地證明轉(zhuǎn)移，更具體地說，混合E/M表型。事實上，CDC73^WT隊列中的其中一名患者在樣本制備后出現(xiàn)了多處轉(zhuǎn)移。盡管在其他CDC73^WT患者中未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移的跡象，但考慮到這一結(jié)果，不能排除轉(zhuǎn)移的可能性。

圖3 甲狀旁腺癌和腺瘤與正常組織的轉(zhuǎn)錄組學分析

4、CDC73等位基因失衡及等位基因特異性表達
       如前所述，CDC73基因的2次點突變導致2個可分離的等位基因：一個攜帶胚系變異體（簡稱CDC73^Germ），另一個獲得體細胞突變（CDC73^Som）?；蚪M和轉(zhuǎn)錄組圖譜的聯(lián)合分析可以檢測DNA和RNA水平的不平衡，包括等位基因特異性拷貝數(shù)變化（CNAs）和兩個等位基因之間的表達偏差。作者在1q31.2檢測到頻繁的（70%）等位基因特異性CNAs，包括CDC73的遺傳性病變。值得注意的是，4個具有CDC73雙打擊突變（P5、P6、P11和P22）的樣本均顯示體細胞突變的瘤內(nèi)變異等位基因頻率（VAF tumor）升高，而生殖細胞突變的VAF tumor在腫瘤DNA中降低，提示CDC73^Som中拷貝數(shù)增加和/或CDC73^Germ中拷貝數(shù)丟失（圖4a）。同樣，如前所述（圖2c），CDC73 LOH（P32）的患者被保留CDC73僅限于^Som。因此，5例CDC73體細胞突變患者在CDC73^Som中均表現(xiàn)為相對獲益。
       進一步分析發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)錄水平上存在額外的偏向性。等位基因特異性RNA-seq分析顯示，在4例CDC73雙打擊突變患者中，CDC73^Som的基因表達比預期的（從DNA水平的等位基因頻率來看）高2.3~7.9倍（圖4a）。這些結(jié)果表明，CDC73^Som中的等位基因增益不僅保留，而且由于等位基因特異性表達，在轉(zhuǎn)錄水平上進一步增強。同樣，作者發(fā)現(xiàn)僅存在CDC73^Germ突變的P75中CDC73^Germ的基因表達顯著低于預期，也支持在所有6例CDC73^Mut患者中CDC73^Som具有更高的等位基因特異性表達。
       基于以上結(jié)果，作者提出了一個合理的模型來解釋CDC73^Som對CDC73^Germ的雙工偏好（基因組和轉(zhuǎn)錄組）（圖4b）。另一個完整的等位基因（CDC73^Wt）與一個失活的等位基因（CDC73^Germ）一起出生，單獨承擔該基因的指定作用，如細胞穩(wěn)態(tài)和腫瘤抑制。這導致在腫瘤發(fā)生之前更積極地使用CDC73^Wt，這可以通過惡化CDC73^Germ（例如，拷貝丟失或轉(zhuǎn)錄抑制）或積極選擇CDC73^Wt（例如,復制增益或轉(zhuǎn)錄激活）來實現(xiàn)。在腫瘤發(fā)生時，第二個打靶基因（體細胞截短突變）將CDC73^Wt轉(zhuǎn)化為CDC73^Som，保持了CDC73^Germ在基因組和轉(zhuǎn)錄組水平上的優(yōu)勢，并在腫瘤進展過程中獲得了進一步的選擇性優(yōu)勢。總的來說，作者的模型解釋了CDC73中的等位基因不平衡和等位基因特異性表達是基于對由種系截短突變引起的CDC73單倍型不足的功能補償，正如在其他研究中多次報道的那樣。

圖4 CDC73等位基因失衡及等位基因特異性表達

5、甲狀旁腺癌和腺瘤的分子分型
       基于RNA-seq鑒定的轉(zhuǎn)錄譜，作者構(gòu)建了甲狀旁腺癌與腺瘤和正常甲狀旁腺的分子分類模型。應用最嚴格的過濾方法從DEGs集中篩選出597個癌癥特異性強的基因，并將其用于49個樣本（11例癌，28例腺瘤，10例正常甲狀旁腺組織）的層次聚類。在未經(jīng)任何訓練或優(yōu)化的初始聚類中，作者發(fā)現(xiàn)所有的癌癥樣本與非癌癥樣本明顯分開（圖5），表明基因集中存在的分子特征存在內(nèi)在差異。
       在2例患者中顯示了分子分型的臨床實用性：P27和P67。兩例患者最初均被診斷為惡性潛能不確定的非典型甲狀旁腺腫瘤，但均為單發(fā)；P27與癌聚集，P67與腺瘤（圖5紅色箭頭）聚集。進一步的前瞻性隨訪發(fā)現(xiàn)P27出現(xiàn)臨床復發(fā)，而P67未觀察到病理進展的跡象，包括典型的包膜或血管侵犯。需要進一步的隊列研究來驗證分子分型在惡性潛能不確定的病例中的實用性，這些病例發(fā)生在0.5-5%的甲狀旁腺腫瘤中。

圖5 甲狀旁腺癌和腺瘤的分子分型

6、^WT1作為CDC73突變型甲狀旁腺癌的潛在標志物
       利用全轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，作者尋找可能的甲狀旁腺癌單基因標志物。在腫瘤特異性表達（圖4a紅色圓點）的基因中，基于腎母細胞瘤1（WT1）與CDC73的功能相關(guān)性，作者重點關(guān)注腎母細胞瘤1（WT1）；已知WT1直接抑制CDC73，誘導MYC和BCL-2促進細胞增殖和腫瘤發(fā)生。此外，由于WT1在腫瘤中的持續(xù)上調(diào)，WT1已被認為是多種癌癥的單一分子生物標志物。
       作者檢驗了WT1作為CDC73突變型甲狀旁腺癌單基因生物標志物的可行性。作者發(fā)現(xiàn)WT1在腫瘤中的過表達是CDC73^Mut患者特有的，而在CDC73^WT患者中不存在（圖6a）。此外，對38例甲狀旁腺組織（28例腺瘤，4例CDC73^WT癌，6例CDC73^Mut癌）進行WT1的免疫組織化學（IHC）染色，證實甲狀旁腺癌組織中存在CDC73^Mut特異性WT1（圖6b）。即無論是腺瘤（圖6c）還是CDC73^WT癌均未被WT1抗體染色（圖6d），但5例CDC73^Mut癌均顯示染色陽性（圖6e）。由于已知WT1的特定剪接體與某些疾病相關(guān)，作者進一步用DEXSeq檢查了WT1的轉(zhuǎn)錄本類型，作者證實CDC73^Mut組中過表達的WT1是一個典型的轉(zhuǎn)錄本。作者預期這些結(jié)果將為將來開發(fā)一種更快、更便宜、更準確的診斷甲狀旁腺癌及其突變狀態(tài)的臨床測試提供依據(jù)。

圖6 ^WT1在CDC73Mut癌中的差異表達

結(jié)論
       作者通過比較甲狀旁腺癌、腺瘤和正常甲狀旁腺樣本的轉(zhuǎn)錄組學分析，確定甲狀旁腺癌的特征性分子特征。作者預計，突變和轉(zhuǎn)錄譜、具有表型特異性表達的基因、等位基因特異性偏倚和潛在的單基因標記將為未來的研究提供新的見解，以改善診斷和個性化的治療策略，這些已經(jīng)在許多其他癌癥中進行了研究。

實驗方法
全外顯子組測序，轉(zhuǎn)錄組測序，突變特征分析，等位基因特異性拷貝數(shù)分析，計算腫瘤內(nèi)VAF，鑒別癌和腺瘤特異性DEGs，GSEA分析，基于DEGs的分層聚類，免疫組織化學（IHC），WT1轉(zhuǎn)錄物的鑒定
參考文獻
Jo SY, Hong N, Lee S, Jeong JJ, Won J, Park J, Kim GJ, Kim SK, Kim S, Rhee Y. Genomic and transcriptomic profiling reveal molecular characteristics of parathyroid carcinoma. Exp Mol Med. 2023 May;55(5):886-897. doi: 10.1038/s12276-023-00968-4. Epub 2023 May 1. PMID: 37121965; PMCID: PMC10238422.