scRNA-seq揭示RCT誘導(dǎo)腫瘤生態(tài)系統(tǒng)重塑

       放化療（RCT）是一種治療宮頸癌癥的有效方法，它不僅影響惡性細(xì)胞，而且影響腫瘤免疫和基質(zhì)細(xì)胞。在本研究中，作者將RCT前后的宮頸癌組織進(jìn)行單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）,發(fā)現(xiàn)RCT后殘留的上皮細(xì)胞上調(diào)MHC II類基因表達(dá)。此外，RCT過程中募集具有促炎性質(zhì)的單核細(xì)胞樣髓系抑制細(xì)胞（MDSCs）和高表達(dá)細(xì)胞毒性基因的CD16⁺ NK細(xì)胞。然而，RCT后細(xì)胞毒性T細(xì)沒有顯著增加。該研究于2023年1月發(fā)表在《Signal Transduction and Targeted Therapy》，IF：39.3。
技術(shù)路線

主要研究結(jié)果
1. scRNA-seq鑒定RCT宮頸癌微環(huán)境動(dòng)態(tài)變化
       作者從2名宮頸上皮腫瘤患者中收集三份鄰近正常宮頸組織樣本用于scRNA-seq（圖1a）。此外，作者還利用了由15個(gè)免疫組織化（IHC）驗(yàn)證的RCT前與RCT后宮頸癌樣本構(gòu)成的cohort 1，以及由20個(gè)RCT前與RCT后宮頸癌樣本bulk RNA-seq數(shù)據(jù)構(gòu)成的cohort 2（圖1b）。作者富集免疫細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞進(jìn)行scRNA-seq。在這些細(xì)胞中，作者共注釋出9種細(xì)胞簇：髓系細(xì)胞，T細(xì)胞，漿細(xì)胞，B細(xì)胞，DC細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，血管成纖維細(xì)胞，以及基質(zhì)成纖維細(xì)胞（圖1c）。作者發(fā)現(xiàn)，RCT后上皮細(xì)胞顯著降低，而髓系細(xì)胞明顯升高（圖1d）。

圖1：RCT前后宮頸癌單細(xì)胞微觀

2. 上皮細(xì)胞亞型之間存在不同的RCT敏感性和免疫原性
       接下來，作者對(duì)上皮細(xì)胞進(jìn)一步聚類，共產(chǎn)生五種亞群Epi1-5（圖1e）。RCT改變了這五種上皮細(xì)胞亞群比例，最顯著的是Epi2比例增加和Epi3比例減少（圖1f，g）。然后，作者對(duì)RCT如何影響上皮細(xì)胞亞群的免疫反應(yīng)進(jìn)行研究。免疫相關(guān)最高差異表達(dá)基因（DEG）和GO數(shù)據(jù)顯示，參與白細(xì)胞趨化、淋巴細(xì)胞活化、抗原呈遞和處理基因表達(dá)增加（圖2a–c）。RCT后，所有上皮細(xì)胞以及Epi1/4/5中顯著上調(diào)抗原呈遞和處理基因（包括MHC-II），雖然抗原處理和呈遞通路在Epi2/3中保持相對(duì)穩(wěn)定，但只有Epi2顯示MHC-I表達(dá)下調(diào)（圖2d，e）?；颊邩颖局械奶卣骰虮磉_(dá)也出現(xiàn)類似的變化：在多數(shù)患者中，觀察到的基因表達(dá)變化與總體基因表達(dá)變化相對(duì)應(yīng)。來自cohort 1樣品的IHC染色也證實(shí)RCT后上皮細(xì)胞MHC-II基因表達(dá)上調(diào)（圖2f，g）。
       接下來，作者評(píng)估RCT如何影響上皮細(xì)胞亞群的惡性特征。與正常和RCT后樣本相比，RCT前樣本中G2/S期基因表達(dá)比例更高（圖2h）。雖然3個(gè)上皮細(xì)胞亞群中非整倍體細(xì)胞（腫瘤細(xì)胞）比例在RCT后降為零，但在RCT 3周后檢測(cè)到Epi2/3中仍然殘留大量非整倍體細(xì)胞（圖2i）。盡管殘留的Epi2/3亞群在同時(shí)間點(diǎn)沒有發(fā)生增殖（圖2h），但Epi2高表達(dá)SPRR和S100A家族基因，它們是癌前期和癌轉(zhuǎn)移標(biāo)志。

圖2：RCT激活上皮細(xì)胞免疫反應(yīng)

3. RCT誘導(dǎo)髓系細(xì)胞促炎基因的表達(dá)
       根據(jù)標(biāo)記基因的表達(dá)，作者將髓系細(xì)胞分為七個(gè)亞群：三種巨噬細(xì)胞亞型、兩種單核細(xì)胞來源的髓系抑制細(xì)胞（M-MDSCs）和兩種DC群體（圖3a）。髓系細(xì)胞可能同時(shí)包含促腫瘤和抗腫瘤的細(xì)胞亞群。為驗(yàn)證這一觀點(diǎn)，作者量化促炎M1-和抗炎M2相關(guān)基因在巨噬細(xì)胞亞群中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)它們顯示出M1和 M2綜合特征（圖3b）。髓系細(xì)胞組成在RCT后有所改變（圖3c，d）： FCN1_M-MDSC相對(duì)比例顯著增加，CD1C_DC相對(duì)比例下降。cohort 1中的IHC以及cohort 2中bulk RNA-seq數(shù)據(jù)也證實(shí)了FCN1_M-MDSC的富集。無論細(xì)胞亞群比例如何，RCT后所有亞群的促炎信號(hào)均有所增加（圖3h）。GO結(jié)果顯示，參與白細(xì)胞遷移和激活的基因在RCT后中M-MDSCs、巨噬細(xì)胞和DC中表達(dá)增加（圖3i、j）。
       與所報(bào)導(dǎo)的輻射募集MDSCs一致，作者觀察到M-MDSCs趨化和遷移的富集時(shí)期（圖3i），這可能有助于FCN1_MMDSC的增加（圖3d）。此外，F(xiàn)CN1_M-MDSC亞群的促炎和抗炎特征分別顯著上調(diào)和下調(diào)（圖3h）。總而言之，RCT通過誘導(dǎo)髓系細(xì)胞中促炎基因表達(dá)和促進(jìn)具有促炎上調(diào)和抗炎下調(diào)功能的FCN1_M-MDSCs募集，改變了宮頸癌的免疫平衡。

圖3：RCT增加具有促炎特征的FCN1_M-MDSC細(xì)胞

4. RCT嚴(yán)重影響淋巴細(xì)胞.
       淋巴細(xì)胞中NK和T細(xì)胞具有促腫瘤或抗腫瘤作用。作者檢測(cè)到10個(gè)T細(xì)胞亞群和2個(gè)NK細(xì)胞亞群（圖4a）。RCT后，CD16_NK細(xì)胞比例顯著增加，而CD56_NK細(xì)胞比例保持不變（圖4b，c）。cohort 1樣本IHC驗(yàn)證了CD16_NK細(xì)胞的增加（圖4d，e），cohort 2數(shù)據(jù)驗(yàn)證了CD16表達(dá)的變化（圖4f）。NK細(xì)胞DEG和GO結(jié)果顯示，RCT后，兩個(gè)NK細(xì)胞亞群中與白細(xì)胞遷移相關(guān)基因以及CD16_NK細(xì)胞亞群中細(xì)胞毒性相關(guān)基因均有所增加（圖4g、h）。CD16_N K細(xì)胞增強(qiáng)了RCT后GZMB、GZMH和NKG7的表達(dá)，主要在NK細(xì)胞毒性顆粒中表達(dá)（圖4i）。同時(shí)，作者發(fā)現(xiàn)細(xì)胞毒性基因的表達(dá)與患者生存率呈正相關(guān)（圖4j）。隨著NK細(xì)胞組成發(fā)生變化，RCT后局部T細(xì)胞群也發(fā)生重組。其中，CD4_naive細(xì)胞顯著增加，而Exhausted_CD8_T細(xì)胞顯著降低（圖4k）。盡管所有T細(xì)胞亞群中的抑制特征下調(diào)，但細(xì)胞毒性評(píng)分沒有增加，這與NK細(xì)胞不同（圖4l）。

圖4：RCT增加具有細(xì)胞毒性特征的CD16_NK細(xì)胞豐度

5. RCT期間癌相關(guān)成纖維細(xì)胞減少促瘤特征基因表達(dá)
       成纖維細(xì)胞影響腫瘤發(fā)展過程。作者鑒定成纖維細(xì)胞六個(gè)亞群：基質(zhì)癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（mCAF），炎性CAFs（iCAFs），抗原呈遞CAFs（apCAFs），血管CAFs（vCAFs）（圖5a）。作者比較了RCT前后CAF亞群特征。他們發(fā)現(xiàn)，iCAFs和一種apCAFs（以下稱為apCAF2）細(xì)胞比例顯著降低，而vCAF1細(xì)胞比例增加（圖5b，c）。CAF亞群特征基因表達(dá)結(jié)果顯示（圖5d），RCT后CAF血管生成特征減少，炎癥評(píng)分增加（圖5e，f）。腫瘤特征分析顯示，在RCT治療期間，TNF和JAK/STAT通路表達(dá)上調(diào)，血管生成通路表達(dá)下調(diào)（圖5g）。血管生成和免疫抑制均促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，這些數(shù)據(jù)表明RCT可能減弱CAF腫瘤促進(jìn)的功能。

圖5：RCT減弱癌相關(guān)成纖維細(xì)胞促瘤特征

6. RCT過程中內(nèi)皮細(xì)胞增強(qiáng)血管生成、缺氧和炎癥基因表達(dá)
       作者鑒定出五個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞亞群（ECs）（圖6a）。GO結(jié)果顯示，EC1富集于干擾素-γ通路和抗原處理與呈遞，EC2富集于上皮細(xì)胞遷移，EC3富集于細(xì)胞基質(zhì)粘附，EC4富集于DNA損傷檢查，EC5富集于白細(xì)胞趨化（圖6b）。RCT期間，EC2細(xì)胞比例顯著降低，RCT后的EC2-4細(xì)胞比例占所有EC的一半以上（圖6c，d）?；虻谋磉_(dá)和GO相關(guān)的EC發(fā)展、血管重塑以及缺氧在RCT期間富集于EC中，尤其是EC2-4（圖6e、f）。除了血管生成增強(qiáng)，參與上皮增殖的基因在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)也顯著上調(diào)（圖6e，f）。此外，RCT后缺氧、血管生成以及炎癥相關(guān)基因顯著富集，包括TNF-κB和白細(xì)胞介素相關(guān)通路（圖6g）。

圖6：RCT增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞血管生成、缺氧和炎性特征

7. 細(xì)胞亞群和細(xì)胞相互作用的臨床意義
       為了解這些細(xì)胞亞群的臨床作用，作者使用CIBERSORTx來評(píng)估亞群細(xì)胞豐度。他們發(fā)現(xiàn)，vCAF2、Exhausted_CD8_T和EC2與宮頸癌患者預(yù)后不良顯著相關(guān)，而GZMK_CD8_T與預(yù)后良好顯著相關(guān)（圖7a）。此外，作者還研究了RCT前后樣品中上皮細(xì)胞、NK細(xì)胞、T細(xì)胞、M-MDSCs、巨噬細(xì)胞、DC和CAFs中細(xì)胞-細(xì)胞相互作用網(wǎng)絡(luò)（圖7b）。RCT后，M-MDSCs、NK細(xì)胞和CAFs具有更多的傳入相互作用，而上皮細(xì)胞、T細(xì)胞和DC具有較少的傳入相互作用（圖7b）。對(duì)于傳出相互作用，M-MDSCs、NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在RCT后表現(xiàn)出較少的相互作用，而上皮細(xì)胞和CAFs表現(xiàn)出更多的相互作用。同時(shí)，作者觀察了RCT前后細(xì)胞亞群之間趨化因子的配體-受體相互作用（圖7c）。與RCT前相比，RCT后上皮細(xì)胞與M-MDSCs之間以及CAFs與M-MDSCs之間存在更多的相互作用。而NK細(xì)胞在RCT后與CCL5-CCR1具有更強(qiáng)的相互作用。

圖7：細(xì)胞亞群臨床作用和細(xì)胞互作

結(jié)論
       作者展示了RCT誘導(dǎo)腫瘤生態(tài)系統(tǒng)重塑的綜合轉(zhuǎn)錄景觀。他們發(fā)現(xiàn)，RCT后留下了上調(diào)MHC II類基因表達(dá)的上皮細(xì)胞以及惡性上皮細(xì)胞。另外，RCT可引起抗腫瘤免疫反，包括募集表達(dá)細(xì)胞毒性基因的CD16⁺NK細(xì)胞和增加促炎特征的FCN1⁺M-MDSC細(xì)胞。

實(shí)驗(yàn)方法
scRNA-seq，免疫組化染色
參考文獻(xiàn)
Liu C, Li X, Huang Q, Zhang M, Lei T, Wang F, Zou W, Huang R, Hu X, Wang C, Zhang X, Sun B, Xing L, Yue J, Yu J. Single-cell RNA-sequencing reveals radiochemotherapy-induced innate immune activation and MHC-II upregulation in cervical cancer. Signal Transduct Target Ther. 2023 Jan 30;8(1):44. doi: 10.1038/s41392-022-01264-9. PMID: 36710358; PMCID: PMC9884664.