Nature子刊—干擾相分離促進(jìn)抗腫瘤免疫
靶向PD-1/PD-L1軸的免疫療法已成為多種癌癥的一線治療。然而，由于調(diào)控PD-1/PD-L1的難以捉摸的機(jī)制，只有有限的一部分個(gè)體實(shí)現(xiàn)了持久的益處。生物分子縮合物涉及廣泛的生理過程，并且也已報(bào)道控制癌癥相關(guān)的失調(diào)。詳細(xì)研究生物分子冷凝物形成的機(jī)制可能為開發(fā)有效的靶向策略提供機(jī)會，因?yàn)槟[瘤細(xì)胞中的靶向相分離過程有益于臨床。本文首先通過質(zhì)譜、CHIP和空間共定位的方法確定了KAT8與IRF1之間能發(fā)生相分離。同時(shí)，KAT8在K78處乙?；疘RF1以促進(jìn)其DNA結(jié)合，這與H4 K16乙?；瘏f(xié)同作用以增強(qiáng)PD-L1 的表達(dá)。又基于KAT8-IRF1縮合物的形成機(jī)制，開發(fā)了一種細(xì)胞穿透阻斷肽2142-R8，其能破壞KAT8-IRF1縮合物，抑制PD-L1的表達(dá)，增強(qiáng)體內(nèi)和體外抗腫瘤免疫。
本文章于2023年3月發(fā)表于《Nature cancer》上，IF=22.7 。
技術(shù)路線
主要研究內(nèi)容
1.KAT8能夠調(diào)控PD-L1的轉(zhuǎn)錄
使用全基因組CRISPR-Cas9基因敲除篩選來鑒定IFNγ暴露后腫瘤細(xì)胞中PD-Ll表達(dá)的調(diào)節(jié)因子。發(fā)現(xiàn)了編碼組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶KAT8的基因是我們篩選中最顯著富集的基因之一（圖1a，b）。KAT8敲低后在多個(gè)細(xì)胞系（骨肉瘤細(xì)胞系143B，惡性黑色素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375和肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549）PD-L1的總蛋白和mRNA水平顯著降低（圖1c，d）。更重要的是，野生型（WT）KAT8，而不是其C316S催化缺陷突變體，挽救了KAT8耗盡細(xì)胞中PD-Ll和H4 K16 ac的下調(diào)，表明KAT8的乙酰轉(zhuǎn)移酶活性對于PD-L1表達(dá)的調(diào)節(jié)是關(guān)鍵的（圖1e，f）。接下來，研究了KAT8耗竭導(dǎo)致的PD-L1表達(dá)下調(diào)是否影響抗腫瘤反應(yīng)。體外細(xì)胞毒性測定顯示耗盡KAT8顯著增強(qiáng)T細(xì)胞殺傷（圖1g）。在體內(nèi)，KAT8耗竭抑制腫瘤生長并降低腫瘤重量（圖1h，i）同時(shí)增加小鼠中CD3+ CD8+ T細(xì)胞的腫瘤浸潤（圖1j-m）。KAT8消耗不能進(jìn)一步延緩用抗PD-1治療的小鼠中的腫瘤生長（圖1n，o）。此外，免疫組織化學(xué)（IHC），表明在人類癌癥中KAT8和PD-L1之間存在正相關(guān)性（圖1p）。
圖1:KAT8在體內(nèi)外調(diào)控PD-L1的轉(zhuǎn)錄
2.KAT8與IFR1相互作用并形成動態(tài)凝聚物
為了研究KAT8如何調(diào)節(jié)PD-L1 mRNA轉(zhuǎn)錄，我們應(yīng)用鄰近標(biāo)記方法，通過引入TurboID-tagged KAT8進(jìn)入A375細(xì)胞以標(biāo)記潛在的相互作用蛋白。使用質(zhì)譜法，我們鑒定IRF1為標(biāo)記的蛋白質(zhì)之一。通過內(nèi)源和外源水平的免疫沉淀進(jìn)一步證實(shí)了KAT8和IRF1之間的相互作用（圖2b）。用單體增強(qiáng)型綠色熒光蛋白-KAT8（mEGFP-KAT8）和IRF1-mCherry轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在細(xì)胞核中顯示小滴樣凝聚物（圖2c，左）。然而純化的mEGFP-KAT8或IRF1-mCherry單獨(dú)顯示出液滴形成的弱能力，而將兩者混合在一起顯著增強(qiáng)液滴形成（圖2c）。液滴形成不依賴于熒光蛋白標(biāo)簽也不依賴于KAT8乙酰轉(zhuǎn)移酶活性（圖2d）。此外，液滴能夠隨時(shí)間融合，并且在體外和細(xì)胞中在光漂白后部分恢復(fù)（光漂白后熒光恢復(fù)（FRAP））（圖2e-g），這些液滴可被1，6-己二醇和高濃度NaCl破壞（圖2h，i）?？傊?，這些結(jié)果表明KAT 8-IRF 1凝聚物的動態(tài)和可逆性質(zhì)。超分辨率成像顯示內(nèi)源性KAT8和IRF1在細(xì)胞中形成小的凝聚物，并且觀察到共定位的凝聚物（圖2j-n）。此外，當(dāng)兩種蛋白質(zhì)濃度高于75 nM時(shí)，KAT8-IRF1液滴在體外形成（圖2o-q）。更重要的是，在來自患有癌癥（肺癌、黑色素瘤、乳腺癌和胃癌）的個(gè)體的樣品中，還觀察到KAT8和IRF1縮合物，并且兩種蛋白的熒光強(qiáng)度與PD-Ll表達(dá)呈正相關(guān)（圖2r ）?？傊?，這些結(jié)果表明KAT8和IRF1可以在體內(nèi)和體外形成縮合物。
圖2：KAT8與IRF1在體內(nèi)外形成動態(tài)凝聚物
3.KAT8-IRF1的縮合依賴于多價(jià)互相作用
為了探索KAT8-IRF1縮合物的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，使用IUPred 2分析了這兩種蛋白質(zhì)的氨基酸序列。將KAT8的氨基酸1-68（KAT81-68）和IRF1140-325（其包括反式激活結(jié)構(gòu)域35）評分為IDR（圖3a，b）。KAT81 -68或IRF11140 -325的耗盡破壞了冷凝物的形成（圖3c，d），而不是預(yù)測的IRFl的IDR，負(fù)責(zé)KAT8相互作用（圖3e）。IRF1 DBD（即IRF1115 -325片段）的缺失也損害了與KAT8的縮合物形成（圖3c，d），表明IRF1的DBD介導(dǎo)與KAT8的相互作用，也是冷凝物形成所必需的。此外，將IRF11 -140與來自不相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子MYC或OCT4的IDR融合恢復(fù)了與KAT8的縮合物形成，而單獨(dú)來自MYC或OCT4的IDR構(gòu)建體則不能（圖1A）。3f）。光液滴測定還顯示，當(dāng)KAT8和IRFl IDR與Cry 2融合時(shí)，藍(lán)光誘導(dǎo)增強(qiáng)了兩種蛋白質(zhì)的IDR之間的縮合物形成（圖3g，h ）。.總的來說，這些觀察結(jié)果表明多價(jià)相互作用模型，其中IRF1 DBD和KAT8之間的相互作用可能是冷凝物引發(fā)的先決條件，并且IRF1和KAT8兩者的IDR之間的弱混雜相互作用促進(jìn)冷凝物形成。
圖3：KAT8-IRF1縮合中的多價(jià)相互作用
4.KAT8-IRF1縮合物促進(jìn)PD-L1 mRNA反式激活
接下來，研究了KAT8-IRF 1縮合物是否可以增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄機(jī)器組分，包括MED 1 IDR、CDK7、CDK9、BRD4和在絲氨酸5處磷酸化的活性RNA聚合酶II（RNA Pol II-S5 P），在KAT8-IRF1縮合物中富集（4a，b）。為了測試IDR介導(dǎo)的KAT8-IRF 1縮合在轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)中的作用，設(shè)計(jì)了雷帕霉素誘導(dǎo)的相互作用系統(tǒng)，以通過將KAT8 IDR或IRF1 IDR與FKBP 12或FRB-Gal4 DBD融合來解偶聯(lián)結(jié)構(gòu)化的IRF1 DBD-KAT8相互作用和混雜的IDR相互作用。雷帕霉素處理后，用KAT8 IDR-FKBP12和IRF1 IDR-FRB-Gal4 DBD共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在細(xì)胞核中顯示小的凝聚物（圖4c），表明該系統(tǒng)可以模擬由KAT8和IRF1 IDR相互作用引起的冷凝。然后，使用Gal4上游活化位點(diǎn)（UAS）報(bào)告基因測定評估了IDR縮合的反式激活作用（圖4d）。IRF1 IDR-FRB-Gal4 DBD的轉(zhuǎn)染增加了報(bào)告基因表達(dá)，而無IDR對照和KAT8 IDR-FKBP12顯示無活性，并且雷帕霉素誘導(dǎo)不能進(jìn)一步增強(qiáng)報(bào)告基因表達(dá)。用KAT 8 IDR-FKBP12和IRF1 IDR-FRB-Gal4 DBD共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞顯示出與在不存在雷帕霉素的情況下僅用IRF1 IDR-FRB-Gal 4 DBD轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相似的報(bào)道基因表達(dá)水平，而報(bào)道基因表達(dá)在雷帕霉素處理后顯著增強(qiáng)（圖4 e）。此外，雷帕霉素劑量-反應(yīng)曲線在KAT8 IDR-FKBP12和IRF1 IDR-FRB-Gal4 DBD穩(wěn)定整合的UAS報(bào)告細(xì)胞中顯示非線性活化模式（圖4f）。這些結(jié)果表明IDR介導(dǎo)的KAT8-IRF1縮合促進(jìn)反式激活。此外，在進(jìn)行dCas 9-SunTag-sgARRAY介導(dǎo)的原位標(biāo)記之后，觀察到內(nèi)源性KAT8和IRF1在細(xì)胞中的PD-Ll啟動子處形成縮合物（圖4g-k）?？傊?，KAT8-IRF1縮合物促進(jìn)PD-L1 mRNA反式激活。
圖4：KAT8-IRF1縮合物促進(jìn)PD-L1 mRNA反式激活
5.KAT8乙?；⒋龠M(jìn)IRF1的活性
接下來，測試了KAT8是否可以乙?；疘RF1。WT KAT8（但不包括其催化缺陷型C316S突變體）與IRF1的共轉(zhuǎn)染顯著增強(qiáng)了其乙酰化（圖5a）。.在應(yīng)用針對乙?；疘RF1K78（K78ac）的特異性抗體后，通過體內(nèi)和體外乙?；瘻y定進(jìn)一步證實(shí)了WT KAT8而不是C316S突變體對IRF1K78的直接催化活性（K78ac）（圖5b，c）。更重要的是，耗盡KAT8導(dǎo)致內(nèi)源IRFl在K78處的乙酰化降低（圖5d）?？傊@些數(shù)據(jù)表明KAT8特異性乙?；疘RF1K78。為了探索KAT8-IRF1縮合是否促進(jìn)IRF1K78ac，進(jìn)行有或沒有液滴形成的體外組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性測定。IRF1K78ac在液滴中顯著增加（圖5e，f），并且液滴中的KAT8的乙?；芰Ρ缺倔w中的高約39.67 ± 1.997倍（圖5g）。這些結(jié)果提供了KAT8通過共縮合促進(jìn)IRFl乙?；淖C據(jù)。接下來，評估了IRF1 K78ac對PD-L1表達(dá)的影響。IRF1 K78R突變體未能上調(diào)PD-L1表達(dá)，并且在PD-L1啟動子處顯示出降低的豐度（圖5 h）。這些結(jié)果表明K78處的乙酰化對于IRFl的DNA結(jié)合是重要的。與這些數(shù)據(jù)一致，通過sgRNA處理消除KAT 8顯著降低IRFl在PD-Ll啟動子處的豐度（圖5i，j）。K78 R細(xì)胞表現(xiàn)出PD-Ll mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的顯著降低（圖5 k）。IRF1在PD-Ll啟動子處的豐度在經(jīng)受IFNγ處理的K78R細(xì)胞中也顯著降低（圖5l）。同樣，由KAT8-IRF1 K78R形成的細(xì)胞內(nèi)縮合物顯示出大的不規(guī)則和較低動態(tài)的簇，而不與RNA Pol II-SSP共定位（圖5m，n）。盡管K78 R突變體在體外顯示出與KAT8相互作用和共縮合的類似能力（圖5 o，p)。與WT液滴相比，由KAT8-IRF1 K78R形成的液滴顯示來源于PD-L1啟動子的DNA探針的募集顯著減少（圖5o）?？傊?，這些結(jié)果表明KAT8在K78處乙?；疘RF1，這增強(qiáng)了IRF1的DNA結(jié)合活性及其對PD-L1啟動子的定位和隨后的PD-L1 mRNA轉(zhuǎn)錄的激活。
圖5：KAT8乙?；⒋龠M(jìn)IRF1的活性
6.IRF 1乙?；瘜AT 8募集至PD-L1啟動子
KAT8是哺乳動物細(xì)胞中H4K16ac所需的主要乙酰轉(zhuǎn)移酶，研究KAT 8是否調(diào)節(jié)PD-Ll啟動子中的H4K16ac。KAT 8敲低細(xì)胞顯示出H4K16ac的總體減少，而其他H4乙?；稽c(diǎn)（H4K5ac、H4K8ac和H4K12ac）保持不受影響（圖6a）。來自ENCODE數(shù)據(jù)庫的染色質(zhì)免疫沉淀測序（ChIP-seq）數(shù)據(jù)顯示KAT 8和IRF 1在PD-L1的啟動子區(qū)域富集（圖6 b）。ChIP-qPCR顯示，當(dāng)KAT 8表達(dá)被sgRNA耗盡時(shí)，PD-L1啟動子處的H4K16ac也顯著降低（圖6c）。鑒于KAT8和IRF1的共縮合，評估了IRF1是否進(jìn)而增強(qiáng)響應(yīng)IFNγ的PD-L1啟動子處的KAT 8募集。具有IRFl耗竭的細(xì)胞在IFNγ處理后具有PD-Ll啟動子處的KAT 8和H4 K16 ac的豐度顯著降低（圖6d，e）。此外，K78R細(xì)胞在IFNγ暴露后還顯示出降低的KAT8定位和PD-Ll啟動子處的H4K16ac（圖6 f，g），表明IRF 1乙?；鰪?qiáng)PD-L1啟動子處的KAT 8募集和H4K16ac修飾作為正反饋。
圖6：IRF 1乙?；瘜AT 8募集至PD-L1啟動子
7.破壞KAT 8-IRF 1縮合物抑制PD-L1表達(dá)
IRF1 DBD和KAT8之間的結(jié)構(gòu)化結(jié)構(gòu)域相互作用在縮合物形成中的重要作用，表明靶向結(jié)構(gòu)化結(jié)構(gòu)域相互作用也可能破壞KAT8-IRF1縮合物，而不是靶向非結(jié)構(gòu)化IDR。為了測試該假設(shè)，構(gòu)建了一系列IRF1 DBD截?cái)啵▓D7a）并各自在細(xì)胞中與KAT8共轉(zhuǎn)染以鑒定負(fù)責(zé)與KAT8相互作用的IRF1的最小區(qū)域。然后將人和小鼠中的完全保守的N-末端區(qū)域鑒定為負(fù)責(zé)IRF1-KAT 8相互作用的主要區(qū)域（圖7 b-d），并且預(yù)測的β-片層的關(guān)鍵殘基47、48（Mut）的突變消除了相互作用（圖7c-f）。接下來，合成了兩種肽，2142-R8和Mut-R8，其衍生自2142和Mut，其中8個(gè)精氨酸殘基融合到它們的C末端（R8）。為了評估2142-R8在細(xì)胞中的生理?xiàng)l件下對KAT8-IRF 1縮合物的破壞能力，使用具有V5-TurboID標(biāo)記的KAT 8的鄰近標(biāo)記系統(tǒng)（圖2a）。在用2142-R8處理細(xì)胞后，生物素標(biāo)記的IRF1的水平顯著降低（圖7 g），表明細(xì)胞中IRF 1和KAT 8之間的相互作用被抑制。因此，IRF1 K78的乙?；灰种疲⑶襊D-L1啟動子處的H4K16ac減少（圖7h，i）。同樣，在細(xì)胞中和體外2142-R8處理后，KAT 8-IRF 1縮合物減少（圖7j，k）。最重要的是，2142-R8有效地抑制了用IFNγ處理的細(xì)胞中PD-Ll表達(dá)的上調(diào)（圖7l，m）。此外，RNA測序分析顯示，2142-R8處理下調(diào)PD-Ll，而主要組織相容性復(fù)合物I類（MHCI類）相關(guān)基因和大多數(shù)IRFl下游的表達(dá)保持不變，這與來自KAT 8耗盡細(xì)胞的數(shù)據(jù)一致（圖7 n，o）?？傊?，這些結(jié)果表明了2142-R8破壞KAT 8-IRF 1縮合物抑制PD-L1表達(dá)。
圖7：2142-R8破壞KAT 8-IRF 1縮合物抑制PD-L1表達(dá)
8.2142-R8肽增強(qiáng)抗腫瘤免疫
評估2142-R8在增強(qiáng)抗腫瘤免疫中的功效，體外細(xì)胞毒性測定顯示2142-R8而非Mut-R8增強(qiáng)T細(xì)胞殺傷（圖8a）。在體內(nèi)，用2142-R8而不是Mut-R8處理減少了荷瘤小鼠中KAT 8-IRF1斑點(diǎn)的共定位、腫瘤體積和腫瘤重量（圖8b-e）。同樣，腫瘤PD-Ll表達(dá)降低，并且活性CD8 + T細(xì)胞的浸潤通過2142-R8而不是Mut-R8增加（圖8f-l）。總之，這些結(jié)果說明2142-R8肽抑制PD-L1表達(dá)并增強(qiáng)體內(nèi)抗腫瘤免疫。
圖8：2142-R8肽增強(qiáng)抗腫瘤免疫
結(jié)論
越來越多的證據(jù)表明生物分子縮合物在調(diào)節(jié)癌癥發(fā)展，這表明靶向這一過程可能是有希望的。這篇文章在KAT8-IRF1縮合物的背景下，證明了IRF1 DBD和KAT8之間的特定結(jié)構(gòu)化相互作用是縮合物引發(fā)的先決條件，而IRF1和KAT8 IDR的弱混雜相互作用促進(jìn)縮合物形成。基于這種機(jī)制，鑒定了2142-R8肽，其可以阻斷IRF1 DBD和KAT8相互作用并破壞KAT8-IRF1縮合物的形成，隨后抑制PD-L1表達(dá)和增強(qiáng)體外和體內(nèi)抗腫瘤免疫?？傊@些的數(shù)據(jù)表明，抑制癌癥相關(guān)冷凝物的形成可能是一種潛在的癌癥治療策略。
實(shí)驗(yàn)方法
構(gòu)建質(zhì)粒，免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)，組織IHC和熒光IHC，體外乙酰化測定，液滴和大量樣品的乙?；w外毒性試驗(yàn)，肽下拉實(shí)驗(yàn)，蛋白表達(dá)和純化實(shí)驗(yàn)，相分離實(shí)驗(yàn)，optoDroplets實(shí)驗(yàn)，Gal 4-UAS-mEGFP報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，質(zhì)譜，鄰近標(biāo)記分析，流式細(xì)胞術(shù)，dCas9-SunTag PD-L1啟動子可視化，全基因組CRISPR-Cas9基因敲除篩選，RNA測序和分析流水線，westernblot，RT-qPCR，體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)，熒光漂白恢復(fù)實(shí)驗(yàn)。
參考文獻(xiàn)
Wu, Y., Zhou, L., Zou, Y., Zhang, Y., Zhang, M., Xu, L., Zheng, L., He, W., Yu, K., Li, T., Zhang, X., Chen, Z., Zhang, R., Zhou, P., Zhang, N., Zheng, L., & Kang, T. (2023). Disrupting the phase separation of KAT8-IRF1 diminishes PD-L1 expression and promotes antitumor immunity. Nature cancer, 4(3), 382–400. https://doi.org/10.1038/s43018-023-00522-1