靶向巨噬細(xì)胞免疫檢查點(diǎn)Siglec-9——提高膠質(zhì)母細(xì)胞瘤免疫治療療效
新輔助免疫檢查點(diǎn)阻斷療法只能使一小部分多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）患者受益。因此，靶向髓系細(xì)胞上的其他免疫調(diào)節(jié)劑是一種有吸引力的治療選擇。本研究中，作者發(fā)現(xiàn)具有功能可塑性的單核細(xì)胞源腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞亞群，它們高度表達(dá)免疫抑制SIGLEC9基因，并優(yōu)先在抗PD-1治療無反應(yīng)者中積累。在小鼠模型中，敲除Siglece（小鼠同源基因）可顯著抑制腫瘤發(fā)展并延長存活時(shí)間。機(jī)制上，靶向Siglece可通過抗原呈遞、分泌趨化因子和共刺激因子相互作用直接激活CD4+T細(xì)胞和 CD8+T細(xì)胞。此外，Siglece缺失與抗PD-1/PD-L1治療協(xié)同提高抗腫瘤療效。該研究于2023年7月17日發(fā)表在《Nature Cancer》，IF：22.7。
技術(shù)路線
主要研究結(jié)果
1. 新輔助免疫療法重塑GBM微環(huán)境
將24名GBM患者分為三組：7名新診斷患者（ND）、5名復(fù)發(fā)患者（Rec）和12名接受帕博利珠單抗和安羅替尼新輔助聯(lián)合療法（Neo）的患者。Neo組又分為5例非應(yīng)答者和7例應(yīng)答者（圖1a,b）。與非應(yīng)答者相比，應(yīng)答者的PFS和總生存期(OS)更長（圖1b）。對(duì)腫瘤進(jìn)行scRNA-seq分析，獲得 149048個(gè)高質(zhì)量細(xì)胞（圖1c）。比較結(jié)果顯示，Neo/Rec樣本和ND樣本中的T細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞存在顯著差異。巨噬細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的 37.5%，并且在不同疾病階段的代表性逐漸降低，這表明巨噬細(xì)胞在GBM進(jìn)展和治療過程中發(fā)揮重要作用（圖1d）。對(duì)24名患者中18名患者的34個(gè)組織切片進(jìn)行ST分析，使用非負(fù)矩陣分解（cNMF）尋找共有的表達(dá)模塊（圖1e）。與瘤旁區(qū)相比，腫瘤核心區(qū)的缺氧、血管生成和炎癥反應(yīng)基因特征更為明顯（圖1f）。腫瘤核心區(qū)基因表達(dá)的增加與細(xì)胞外基質(zhì)組織、血管生成、IL-4/IL-13 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和炎癥反應(yīng)有關(guān)（圖1g）。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了不同GBM腫瘤區(qū)域的動(dòng)態(tài)空間景觀。
圖1. ND、Rec和Neo中腫瘤微環(huán)境重編程的單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究
2. GBM中多種SIGLEC9+TAM亞群
對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）和單核細(xì)胞進(jìn)行深入分析（圖2a）。發(fā)現(xiàn)一個(gè)主要的小膠質(zhì)細(xì)胞集群（C1，表達(dá)TMEM119和P2RY12）和一個(gè)小的高表達(dá)CXCL10的小膠質(zhì)細(xì)胞集群（C8）（圖2a,b）。TAM（CD68+、TGFBI+ 和 CSF1R+）再聚類顯示五個(gè)亞群：增殖TAMs（C7，MKI67）、IL1+ TAMs（C6，IL1）、一個(gè)未定義的亞群（C5）和兩個(gè)具有SIGLEC9 表達(dá)特征的亞群，分別命名為SIGLEC9+SEPP1+TAMs（C2，SIGLEC9+和SEPP1+）和SIGLEC9+MARCO+TAMs（C9，SIGLEC9+和MARCO+）（圖2a,b）。還發(fā)現(xiàn)兩個(gè)單核細(xì)胞集群：CD14+單核細(xì)胞（C3）和CD16+單核細(xì)胞（C4）（圖2a）。與Rec樣本相比，主要的小膠質(zhì)細(xì)胞集群（C1）在ND樣本中富集（圖2c）。Rec組主要觀察到SIGLEC9+ SEPP1+ TAMs（C2）和CD14+單核細(xì)胞（C3）（圖2c）。在Neo組中，與應(yīng)答者相比，SIGLEC9+MARCO+TAMs（C9）更多地出現(xiàn)在非應(yīng)答者中，而SIGLEC9+SEPP1+TAMs（C2）則略有增加（圖2c）。進(jìn)行基因集變異分析（GSVA）（圖2d），小膠質(zhì)細(xì)胞在抗腫瘤相關(guān)途徑略有富集，表明這些組織常駐髓系細(xì)胞可能不是抗腫瘤免疫反應(yīng)的驅(qū)動(dòng)力（圖2d）。IL1+TAMs（C6）強(qiáng)烈富集的炎癥反應(yīng)途徑強(qiáng)調(diào)了IL-1在激活巨噬細(xì)胞中的關(guān)鍵作用（圖2d）。IL1+ TAM（C6）在Neo組中的優(yōu)先分布表明，它們可能是由免疫檢查點(diǎn)阻斷療法（ICB）誘發(fā)的（圖2c）。值得注意的是，單核細(xì)胞衍生TAMs的兩個(gè)異質(zhì)亞群（SIGLEC9+SEPP1+TAMs，C2；SIGLEC9+MARCO+TAMs，C9）在活化和抗腫瘤途徑中都有富集（圖2d）。使用基于熵的統(tǒng)計(jì)算法ROGUE量化亞群的異質(zhì)性，發(fā)現(xiàn)SIGLEC9+SEPP1+TAMs（C2）和SIGLEC9+MARCO+TAMs（C9）在不同疾病階段（圖2e）的ROGUE指數(shù)都很低，CXCL10+小膠質(zhì)細(xì)胞集群（C8）也表現(xiàn)出高度異質(zhì)性（低ROGUE指數(shù)）（圖2e）。
3. SIGLEC9引導(dǎo)兩個(gè)表達(dá)SEPP1或MARC的TAM亞群
將單細(xì)胞熵應(yīng)用于TAMs，用統(tǒng)一的流形逼近與投影（UMAP）表示它們的細(xì)胞狀態(tài)可能性。與初始狀態(tài)相比，耗竭SIGLEC9+TAMs后，整體細(xì)胞熵大幅增加，而耗竭M(jìn)ARCO+TAMs則沒有出現(xiàn)整體變化（圖2f）。SEPP1+TAM的耗竭導(dǎo)致大部分區(qū)域的整體細(xì)胞熵更低（圖2f）。因此，維持這兩個(gè)TAM亞群的是 SIGLEC9而不是SEPP1或MARCO。值得注意的是，SIGLEC9+SEPP1+TAMs（C2）表達(dá)高水平的抗炎和血管生成相關(guān)基因，如IL10、VEGFB、SLC40A1、FOLR2 和CSF1R（圖2g）。相反，與 SIGLEC9-SEPP1-TAMs相比，SIGLEC9+SEPP1+TAMs中的主要組織相容性復(fù)合體（MHC）-II基因（HLA-DQA1和HLA-DRB1）、促炎細(xì)胞因子IL18以及抗原遞呈和吞噬相關(guān)基因C1QA/C1QB/C1QC也有所升高（圖2g）。SIGLEC9+MARCO+TAMs的抗炎基因（如MRC1、MARCO和VSIG4）和炎癥基因（如ALOX5、ENO1和FBP1）的表達(dá)均上調(diào)（圖2h）。這些結(jié)果說明SIGLEC9+SEPP1+TAMs和SIGLEC9+MARCO+TAMs代表高度可塑性的免疫抑制巨噬細(xì)胞群。
4. SIGLEC9+TAMs源自單核細(xì)胞
RNA速率分析表明，CD14+單核細(xì)胞（C3）向SIGLEC9+SEPP1+TAMs（C2）和SIGLEC9+MARCO+TAMs（C9）定向流動(dòng)（圖2i）。這表明SIGLEC9+SEPP1+和SIGLEC9+MARCO+TAMs并不是離散的細(xì)胞群，而是連續(xù)的，并且來自單核細(xì)胞。值得注意的是，SIGLEC9+MARCO+TAMs在單核細(xì)胞趨化通路中表現(xiàn)出富集（圖2d），進(jìn)一步支持單核細(xì)胞遷移到腫瘤并逐步分化成SIGLEC9+TAMs的觀點(diǎn)。測量各細(xì)胞群的空間共定位，發(fā)現(xiàn)SIGLEC9+SEPP1+TAMs或SIGLEC9+MARCO+TAMs與CD14+單核細(xì)胞共定位，進(jìn)一步表明它們來自 CD14+單核細(xì)胞（圖2j）。
圖2. 源自單核細(xì)胞的SIGLEC9+巨噬細(xì)胞具有抗腫瘤和免疫抑制的雙重功能
5. SIGLEC9+TAMs在新輔助治療后積聚
與其他疾病階段相比，SIGLEC9在非應(yīng)答者樣本中表達(dá)明顯較高（圖3a）。此外，在應(yīng)答者中SIGLEC9+SEPP1+和SIGLEC9+MARCO+TAMs中SIGLEC9表達(dá)明顯減少，這表明其具有抑制功能（圖3b）。差異基因表達(dá)（DGE）分析顯示，與ICB治療應(yīng)答者相比，非應(yīng)答者的SIGLEC9+SEPP1+和SIGLEC9+MARCO+TAMs表達(dá)更高的C1QA、C1QB、CD14和SPP1（圖3c,d）。在應(yīng)答者中，炎癥因子如APOE、IL1B、STAT1，T細(xì)胞趨化因子CCL3、CCL4和與IFN-γ相關(guān)的ISG15均上調(diào)（圖3c，d）。值得注意的是，SIGLEC9+TAMs 在應(yīng)答者中顯示出更好的T細(xì)胞趨化性，這表明它們可以增強(qiáng)ICB治療的陽性反應(yīng)（圖3e）。SIGLEC9+TAMs顯示出與新輔助抗PD-1治療的GBM數(shù)據(jù)集中髓樣細(xì)胞-C6亞群的相似性，均表達(dá)免疫抑制基因，如GPNMB、CSTB和MRC1(圖3f-h)。在人類復(fù)發(fā)性GBM數(shù)據(jù)集中，SIGLEC9+SEPP1+TAM與表達(dá)吞噬/脂質(zhì)和抗炎基因的TAM亞群一致，而SIGLEC9+MARCO+TAM與缺氧性TAM相似（圖3i）。SIGLEC9+TAMs與其他數(shù)據(jù)集的相似性表明這些細(xì)胞類型的免疫抑制功能。
圖3. 新輔助抗PD-1治療后SIGLEC9+巨噬細(xì)胞持續(xù)存在
6. SIGLEC9+TAMs與不良臨床結(jié)局相關(guān)
評(píng)估大型臨床隊(duì)列中的SIGLEC9基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)癌癥基因組圖譜（TCGA）GBM隊(duì)列中，SIGLEC9 的表達(dá)與OS呈負(fù)相關(guān)（圖 4a）。以scRNA-seq為參照，對(duì)TCGA數(shù)據(jù)進(jìn)行CIBERSORTx反卷積分析，發(fā)現(xiàn)在同一隊(duì)列中，SIGLEC9+TAM 的比例與OS呈負(fù)相關(guān)（圖4b）。通過免疫組化（IHC）方法評(píng)估Siglec-9，該方法使用的組織芯片來自一個(gè)大型 GBM 隊(duì)列，在該隊(duì)列中，高水平的 Siglec-9 與OS呈負(fù)相關(guān)（圖4c）。
7. Siglece基因缺失增強(qiáng)小鼠的抗腫瘤活性
Siglece是人類 SIGLEC9的小鼠功能同源物，使用野生型（WT）和 Siglece 基因敲除（Siglece-/-）小鼠進(jìn)行反向翻譯研究。首先在蛋白質(zhì)水平上評(píng)估C57/BL6 小鼠的 Siglec-E（圖4d）。在脾臟和淋巴結(jié)中，WT小鼠的巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞中高表達(dá)Siglec-E，樹突狀細(xì)胞（DC）中表達(dá)較少，T細(xì)胞、B細(xì)胞或自然殺傷（NK）細(xì)胞上幾乎沒有表達(dá)，而Siglece-/-小鼠在所有這些免疫細(xì)胞上都沒有表達(dá)Siglec-E（圖4e,f）。Siglec-E在腫瘤浸潤白細(xì)胞中的表達(dá)與接種CT2A膠質(zhì)瘤細(xì)胞的小鼠同系腫瘤中的脾和淋巴結(jié)中的表達(dá)相似（圖4g）。Siglece的缺失明顯阻礙了內(nèi)臟腫瘤的生長（圖4h），從而延長小鼠的存活時(shí)間（圖4i）。鑒于Siglec-E在其他髓系細(xì)胞上也有表達(dá)（圖 4d-g），使用CSF1R單克隆抗體阻斷導(dǎo)致巨噬細(xì)胞的大量消減和 TAM在腫瘤中的浸潤，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞的耗竭完全消除Siglece基因缺陷小鼠的腫瘤生長抑制（圖4j）。將骨髓衍生巨噬細(xì)胞（BMDMs）轉(zhuǎn)移到腫瘤小鼠體內(nèi)，評(píng)估腫瘤生長和小鼠存活率。發(fā)現(xiàn)移植的Siglece-/- BMDMs阻礙WT 腫瘤小鼠的腫瘤生長，并延長小鼠的存活時(shí)間，復(fù)制Siglece-/-小鼠腫瘤生長受阻和存活時(shí)間延長的現(xiàn)象（圖4k、l）。相反，與WT BMDCs相比，被轉(zhuǎn)移的Siglece-/-骨髓源性DCs（BMDCs）對(duì)腫瘤生長沒有不同的影響（圖4m,n）。這些結(jié)果表明，在小鼠GBM模型中，表達(dá)Siglece的巨噬細(xì)胞是介導(dǎo)腫瘤根除的主要細(xì)胞群。
圖4. SIGLEC9+巨噬細(xì)胞與不良臨床結(jié)局有關(guān)，Siglece基因缺失阻礙小鼠GBM模型腫瘤的生長
8. Siglece基因缺失激活巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞
利用scRNA-seq分析評(píng)估Siglece-/-小鼠的顱內(nèi)腫瘤微環(huán)境（圖5a）。觀察到 Siglece-/-小鼠腫瘤中的免疫細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞和DCs大量增加（圖5b）。巨噬細(xì)胞增加參與抗腫瘤反應(yīng)的基因的表達(dá)，包括趨化因子，如 Ccl3、Ccl4、Ccl5、Ccl7、Ccl8、Ccl9、Cxcl9和Cxcl10，它們能招募和激活細(xì)胞溶解性T細(xì)胞，以及IFN-γ刺激基因，如Isg15（圖5c,d）。與WT腫瘤相比，體內(nèi)Siglece-/-腫瘤中T細(xì)胞表達(dá)更高水平的Il2、Il17a和Ifng（圖5d）。流式細(xì)胞熒光分選技術(shù)（FACS）分析顯示，與 WT 相比，Siglece 基因缺失后，CD45+細(xì)胞、骨髓細(xì)胞（CD11b+、F4/80+、Ly6C+和DCs）和淋巴細(xì)胞（CD4+T、CD8+T 和NK細(xì)胞）的浸潤明顯增加（圖5e），這與scRNA-seq分析結(jié)果一致。皮下腫瘤的實(shí)時(shí)PCR分析也驗(yàn)證了這些結(jié)果（圖5f）。接下來，分析了瘤內(nèi)巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Siglece-/-巨噬細(xì)胞中CD80和MHC-II等活化標(biāo)記物的表達(dá)增加（圖5g）。與WT BMDMs相比，將Siglece-/- BMDMs與CT2A細(xì)胞共培養(yǎng)顯著增加趨化因子的表達(dá)，包括Ccl4、Ccl8和Cxcl9（圖5h）。當(dāng)與CT2A細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，BMDMs中Siglece的缺失顯著增加Il4和Il10的表達(dá)（圖5i）。雖然Siglece缺失增加Pd-l1的表達(dá)，但與WT BMDMs共培養(yǎng)后，Pd-l1的表達(dá)仍與WT BMDMs 相似（圖5i）。Siglece-/- BMDMs分別顯著增加來OT-II或OT-I轉(zhuǎn)基因小鼠的CD4+和CD8+T細(xì)胞的增殖比例（圖5j,k）。來自Siglece基因缺失小鼠的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TILs）也顯示出CD107a、IFN-γ和Ki67等活化標(biāo)志物的表達(dá)增加（圖 5l）。此外，在WT小鼠皮下腫瘤生長過程中，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞上Siglec-E的表達(dá)增加，而DC上的表達(dá)卻沒有增加（圖5m）。這一結(jié)果進(jìn)一步支持了負(fù)反饋環(huán)的存在，在負(fù)反饋環(huán)中，Siglece可防止免疫系統(tǒng)的過度反應(yīng)，并作為巨噬細(xì)胞的免疫檢查點(diǎn)。
圖5. Siglece基因缺失導(dǎo)致免疫細(xì)胞浸潤、巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞活化增強(qiáng)。
9. Siglece-/-與T細(xì)胞合作抑制腫瘤生長
使用抗體特異性地清除WT小鼠和Siglece-/-小鼠皮下腫瘤中的CD4+或CD8+T細(xì)胞。Siglece-/-小鼠中消耗CD4+T細(xì)胞明顯降低腫瘤生長抑制作用，導(dǎo)致腫瘤生長率與WT小鼠相似（圖6a）。在Siglece-/-或WT小鼠中消耗CD8+T細(xì)胞導(dǎo)致Siglece缺失型小鼠無法抑制腫瘤生長，而與WT小鼠相比加速腫瘤生長，這表明Siglec-E可能以CD8+T細(xì)胞細(xì)胞毒性依賴的方式介導(dǎo)腫瘤排斥反應(yīng)（圖6b）。這些結(jié)果表明，靶向Siglece減輕Siglece+TAMs的免疫抑制屬性，而這種屬性是由CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的。
10. SIGLEC9+TAMs直接與GBM中的T細(xì)胞相互作用
將WT或Siglece-/-BMDMs共同培養(yǎng)并評(píng)估T細(xì)胞遷移（圖6c）。與WT BMDMs相比，Siglece-/- BMDMs顯著增強(qiáng)CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的遷移（圖6d）。這些結(jié)果表明，SIGLEC9+/Siglece+巨噬細(xì)胞直接招募T細(xì)胞。對(duì)ST 數(shù)據(jù)中CD68+SIGLEC9+細(xì)胞與T細(xì)胞特征的共定位分析表明，應(yīng)答者樣本中的 TH1和共刺激特征有所增加（圖6e、f）。多重IHC顯示，與非應(yīng)答者樣本相比，應(yīng)答者樣本中CD68+Siglec-9+細(xì)胞與CD8+PD-1+T細(xì)胞的空間距離更近（圖6g,h）。scRNA-seq數(shù)據(jù)顯示，SIGLEC9+TAMs通過各種基因?qū)εcT細(xì)胞廣泛相互作用，如CCL4-CCR5、CCL3-CCR5、SPP1-CD44、SPP1-CC8、CD40-CD40LG和4-1BBL-4-1BB（圖6j）。在小鼠GBM中也發(fā)現(xiàn)了這些相互作用，而且Siglece 缺失會(huì)增強(qiáng)這些相互作用，支持它們是Siglec-9/Siglec-E依賴性相互作用的觀點(diǎn)（圖6k）。
圖6. 靶向Siglece+巨噬細(xì)胞與T細(xì)胞合作抑制腫瘤生長，且Siglece+/SIGLEC9+巨噬細(xì)胞與T細(xì)胞在空間上相關(guān)
11. Siglece基因缺失提高抗PD-1/PD-L1療法的療效
WT或Siglece -/-小鼠顱內(nèi)接種CT2A膠質(zhì)瘤細(xì)胞，用抗PD-1或抗PD-L1抗體治療（圖7a）。與不進(jìn)行治療、單獨(dú)進(jìn)行Siglece基因缺失和單獨(dú)進(jìn)行PD-1/PD-L1阻斷治療相比，Siglece基因缺失與抗PD-1或抗PD-L1抗體相結(jié)合可顯著延長生存期（圖7b,c）。用由Siglec-E細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域與小鼠IgG2a Fc結(jié)構(gòu)域融合而成的重組蛋白（Siglec-E-Fc）治療顱內(nèi)腫瘤小鼠，與IgG治療相比，小鼠存活時(shí)間延長（圖7d,e）。Siglec-E-Fc可與腫瘤細(xì)胞膜上的唾液酸化蛋白或游離的唾液酸化蛋白結(jié)合，從而與巨噬細(xì)胞上的內(nèi)源性Siglec-E競爭，阻斷Siglec-E信號(hào)傳導(dǎo)（圖7f）。
圖7. Siglece缺失增強(qiáng)ICB療法的療效，Siglece是治療GBM的潛在治療靶點(diǎn)
結(jié)論
綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Siglec-9是一種新穎的巨噬細(xì)胞免疫檢查點(diǎn)分子，可以作為靶點(diǎn)提高抗PD-1/PD-L1治療GBM的療效，為GBM的治療提供了新的思路。
實(shí)驗(yàn)方法
小鼠GBM模型構(gòu)建，ICB處理，治療性Siglec-E-Fc競爭實(shí)驗(yàn)，流式細(xì)胞術(shù)，胞內(nèi)細(xì)胞因子染色，細(xì)胞培養(yǎng)，Transwell，RT-qPCR，人體組織芯片免疫染色和分析，多重免疫熒光，scRNA-seq文庫構(gòu)建，差異基因表達(dá)（DGE）分析，基因本體（GO）分析，單細(xì)胞熵值分析，單細(xì)胞軌跡構(gòu)建，細(xì)胞互作評(píng)估，拷貝數(shù)變異（CNV）檢測，細(xì)胞亞群的組織富集，空間轉(zhuǎn)錄組文庫制備，bulk RNA-seq
參考文獻(xiàn)
Mei Y, Wang X, Zhang J, Liu D, He J, Huang C, Liao J, Wang Y, Feng Y, Li H, Liu X, Chen L, Yi W, Chen X, Bai HM, Wang X, Li Y, Wang L, Liang Z, Ren X, Qiu L, Hui Y, Zhang Q, Leng Q, Chen J, Jia G. Siglec-9 acts as an immune-checkpoint molecule on macrophages in glioblastoma, restricting T-cell priming and immunotherapy response. Nat Cancer. 2023 Jul 17. doi: 10.1038/s43018-023-00598-9. Epub ahead of print. PMID: 37460871.