心肌梗死后，乳酸誘導(dǎo)Snail1乳酸化促進內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化

       高乳酸水平與心臟病患者的預(yù)后和死亡率呈正相關(guān)。內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EndoMT）在心臟纖維化中起著重要作用。本研究中，作者報告了乳酸的新功能，即在心肌梗死（MI）后，通過促進EndoMT增加心臟纖維化并加劇心功能不全。機制上，乳酸能上調(diào)缺氧/ MI后Snail1的核轉(zhuǎn)位和乳酸化。抑制Snail1可改善MI后乳酸誘導(dǎo)的心臟功能障礙，抑制乳酸刺激的EndoMT、Snail1的乳酸化和TGF-β/Smad2信號的激活。該研究于2023年2月發(fā)表在《Science Advances》，IF：13.6。
技術(shù)路線

主要研究結(jié)果
1. 減少乳酸改善MI后的心功能和心臟纖維化
       腹腔注射糖酵解抑制劑2-脫氧-D-葡萄糖（2-DG）降低乳酸水平。2-DG 抑制MI引起的血清和心臟乳酸水平（圖1A、B）。值得注意的是，2-DG MI 小鼠的射血分數(shù)（EF%）和縮短分數(shù)（FS%）水平高于對照組MI小鼠（圖1C、D）。2-DG MI小鼠的左心室舒張末期容積（LVEDV）和左心室收縮末期容積（LVESV）值低于對照MI小鼠（圖E、F）這表明抑制乳酸生成改善MI后的心臟功能。此外，Masson三色染色顯示給予2-DG減少MI后的心臟纖維化（圖 1G）。這些數(shù)據(jù)表明乳酸的產(chǎn)生促進MI誘發(fā)的纖維化和心功能不全。
2. 增加乳酸生成加劇MI后的心功能不全和心臟纖維化
       在誘導(dǎo)MI3小時后給小鼠補充乳酸，在MI1周和4周后用超聲心動圖評估心臟功能。圖1H顯示，腹腔注射乳酸（0.5 g/kg體重7天后，血清乳酸濃度恢復(fù)到正常水平。與假手術(shù)組相比，MI 顯著降EF% 和FS% 的值（圖1I 、J）與 MI 組相比，注射乳酸進一步降低EF%（7 天時降低14.0%，28 天時降低19.5%）和FS%（7 天時降低15.8%，28 天時降低21.6%）的值（圖1I、J）。同樣，乳酸處理也增加MI后LVEDV和LVESV的水平（圖1K、L）這些數(shù)據(jù)共同表明，乳酸水平升高加重MI后的心臟功能障礙。Masson三色染色表明乳酸給藥顯著誘導(dǎo)MI小鼠的心臟纖維化（圖1M）。

圖1. 乳酸水平升高導(dǎo)致MI后心臟功能障礙惡化和心臟纖維化增加

3. 抑制乳酸生成減輕MI后的心臟EndoMT
       與假手術(shù)組相比，MI誘導(dǎo)內(nèi)皮標志物CD31和VE-cadherin（VE-鈣粘蛋白）表達（圖 2A）以及間充質(zhì)標志物成纖維細胞特異性蛋白1（FSP1）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）和Collagen1a1 表達（圖 2A）明顯增加。施用2-DG抑制乳酸產(chǎn)生提高 CD31和VE-cadherin的表達，同時消除MI誘導(dǎo)的 Collagen1a1、α-SMA和FSP1 的減少（圖2A）。同樣，用2-DG 處理上調(diào)內(nèi)皮標志物Cdh5和Kdr的mRNA水平（圖2B）。相反，2-DG下調(diào)間質(zhì)標志物Atca2、Col1a1、Fn1和S100a4的mRNA 表達（圖2B）?？傊@些數(shù)據(jù)表明抑制乳酸減弱MI后的EndoMT進程。在添加或不添加2-DG的內(nèi)皮細胞特異性綠色熒光蛋白（GFP）標記小鼠（TIE2GFP）中誘導(dǎo)MI，并用抗GF（綠色）和抗FSP1（紅色）抗體對心臟組織進行免疫熒光染色。如圖2C所示，與假手術(shù)組相比，MI 誘導(dǎo)GFP與FSP1的共定位。與此相反，2-DG抑制乳酸產(chǎn)生減輕MI誘導(dǎo)的GFP與FSP1的共定位，表明2-DG減少MI刺激的心肌EndoMT。此外，在MI或假手術(shù)后7天，從獲得的心臟中分離出內(nèi)皮細胞，流式細胞術(shù)檢測分化成肌成纖維細胞的內(nèi)皮細胞百分比。如圖2D所示，從假手術(shù)組小鼠體內(nèi)分離的內(nèi)皮細胞顯示，抗 CD31 和抗 CD114（內(nèi)皮細胞標記物）抗體染色的GFP細胞最多，幾乎檢測不到Gp38（心臟成纖維細胞標記物）染色（圖2E）。然而，MI明顯增加GFP標記的內(nèi)皮細胞中Gp38陽性染色細胞的數(shù)量和百分比。相反，用2-DG處理可抑制MI 誘導(dǎo)的Gp38陽性內(nèi)皮細胞。

圖2. 2-DG減弱MI誘導(dǎo)的EndoMT

4. 高水平乳酸促進MI后心肌中的EndoMT
       WB顯示，對MI小鼠補充乳酸降低內(nèi)皮細胞標記物（CD31和VE-cadherin）的水平，促進間充質(zhì)標記物（FSP1、α-SMA和Collagen1a1）的表達（圖3A）qRT-PCR顯示，乳酸水平升高導(dǎo)致MI后Cdh5和Kdr mRNA水平降低（圖3B、C），并誘導(dǎo)Col1a1、Fn1和S100a4 mRNA水平升高（圖3D- F），表明乳酸誘導(dǎo)MI 后的EndoMT。用抗 GFP（綠色）和抗 FSP1（紅色）抗體進行免疫熒光染色顯示，與假手術(shù)組小鼠相比，MI 誘導(dǎo)GFP和FSP1的共定位（圖3G），這表明乳酸鹽處理后有更多的內(nèi)皮細胞分化成成纖維細胞。同樣，流式細胞術(shù)顯示，MI 后乳酸鹽處理進一步上調(diào)GFP⁺gp38⁺ 細胞的數(shù)量（圖3H），表明乳酸鹽促進MI后的EndoMT。

圖3. 補充乳酸鹽促進MI后的EndoMT

5. 缺氧后，乳酸鹽刺激內(nèi)皮細胞遷移、降低VE-cadherin的表達，并促EndoMT
       進行傷口愈合試驗和EdU摻入試驗，圖4A顯示，與常氧對照組相比，缺氧加速內(nèi)皮細胞的遷移。此外，10 mM（而非5 mM）的乳酸顯著促進缺氧誘導(dǎo)的傷口愈合（圖4A），表明乳酸鹽能誘導(dǎo)缺氧挑戰(zhàn)下的內(nèi)皮細胞遷移。同樣，EdU摻入試驗再次證明乳酸鹽能促進缺氧刺激的內(nèi)皮細胞增殖（圖4B）。VE-cadherin的免疫熒光染色顯示，缺氧72小時后，VE-cadherin的完整性受到破壞（圖4D）。缺氧后，用10 mM乳酸鹽處理進一步破壞內(nèi)皮細胞表面的VE-cadherin完整性（圖4D）。此外，WB和 qRT-PCR 分析顯示，與缺氧組相比，乳酸處理顯著降低VE-cadherin的水平（圖4C、5C），表明乳酸改變?nèi)毖跆魬?zhàn)下內(nèi)皮細胞的表型。用乳酸處理內(nèi)皮細胞，檢測缺氧后EndoMT的標記物。如圖5A所示，缺氧72小時后，內(nèi)皮細胞的形態(tài)從典型形狀變?yōu)槔L的紡錘形外觀。與缺氧對照組相比，乳酸處理導(dǎo)致細胞形態(tài)發(fā)生更大變化。此外，拉長細胞的FSP1染色呈陽性，CD31 染色呈陰性（圖5B）。圖5C顯示，缺氧挑戰(zhàn)后，乳酸減少VE-cadherin的表達并誘導(dǎo)α-SMA的釋放。進行基于Matrigel的內(nèi)皮細胞血管生成試驗，發(fā)現(xiàn)乳酸的施用抑制缺氧誘導(dǎo)的血管生成（圖5D）。此外，利用膠原凝膠收縮試驗，證實乳酸處理的內(nèi)皮細胞在缺氧刺激后表現(xiàn)出類似間充質(zhì)的功能，這表現(xiàn)在膠原凝膠體積減小和收縮力增強（圖5E）?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明缺氧后乳酸誘導(dǎo)EndoMT。

圖4. 缺氧后，乳酸誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞遷移并減少VE-cadherin的表達

圖5. 缺氧后，乳酸促進內(nèi)皮細胞中EndoMT

6. 缺氧后乳酸激活TGF-β/Smad2信號傳導(dǎo)
       qRT-PCR顯示，在體內(nèi)乳酸顯著加速MI后心肌中Tgfb1和Smad2 mRNA的表達（圖6A、B）。然而，乳酸鹽并沒有改變Smad3的mRNA水平（圖6C）。此外，2-DG抑制乳酸的產(chǎn)生降低MI誘導(dǎo)的Tgfb1和Smad2 mRNA表達（圖6D、E）。體外研究也表明，乳酸促進缺氧挑戰(zhàn)下的人臍帶內(nèi)皮細胞（HUVECs）和HCMECs中TGFB1和SMAD2 mRNA 的表達（圖6F、G）。與基因表達水平一致，乳酸處理上調(diào)缺氧挑戰(zhàn)后Smad2的磷酸化和TGF-β的表達，但不影響 Smad3的磷酸化（圖6H）。這些數(shù)據(jù)綜合表明，乳酸誘導(dǎo)的TGF-β/Smad2激活有助于缺氧后的EndoMT。
                   

圖6. MI/缺氧后，乳酸刺激TGF-β/Smad2信號傳導(dǎo)

7. 抑制細胞內(nèi)乳酸減輕缺氧誘導(dǎo)的EndoMT
       CHC[單羧酸鹽轉(zhuǎn)運體（MCT）抑制劑α-氰基-4-羥基肉桂酸鹽]降低乳酸處理誘導(dǎo)的細胞內(nèi)乳酸水平（圖7A），表明細胞外乳酸是通過MCT 轉(zhuǎn)運到內(nèi)皮細胞的。此外，服用CHC改善缺氧后乳酸促進的內(nèi)皮細胞遷移（圖7B）。免疫熒光染色顯示，CHC阻乳酸處理導(dǎo)致的VE-cadherin表達減少（圖7C），而血管形成試驗表明，CHC促進缺氧后的血管生成（圖7D）。此外，CHC還緩解乳酸誘導(dǎo)的內(nèi)皮標志物PECAM1、CDH5和KDR mRNA水平的降低（圖7E-G）以及間充質(zhì)標志物ACTA2、FN1和COL1A1 mRNA水平的升高（圖7H-J）。用CHC處理抑制乳酸誘導(dǎo)的TGFB1和SMAD2 mRNA的表達（圖7K、L）。

 
圖7. 抑制細胞內(nèi)乳酸減弱缺氧誘導(dǎo)的EndoMT

8. 缺氧后乳酸促進Snail1的核轉(zhuǎn)位
       如圖8A所示，單獨缺氧不會改變Snail1的胞漿表達。然而，與常氧狀態(tài)相比，缺氧后Snail1的核表達明顯加快。乳酸處理進一步上調(diào)Snail1的核轉(zhuǎn)位。免疫熒光染色顯示，缺氧后Snail1核表達的陽性率更高，而乳酸進一步誘導(dǎo)Snail1核表達（圖8B），表明Snail1的核轉(zhuǎn)位在乳酸促進的EndoMT中發(fā)揮重要作用。用抗Snail1抗體進行染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實驗，圖8C顯示，在缺氧挑戰(zhàn)的細胞中，Snail1與TGFB1 基因一起被大量招募。然而在乳酸處理的缺氧挑戰(zhàn)細胞中，TGFB1基因和Snail1蛋白之間的相互作用明顯大于缺氧細胞（圖8C）。這些數(shù)據(jù)表明，乳酸促進Snail1蛋白和TGFB1基因的相互作用，從而有助于TGF-β/Smad2介導(dǎo)的EndoMT。
9. 缺氧后乳酸誘導(dǎo)Snail1乳酸化
       使用抗Snail1抗體進行免疫沉淀，然后使用抗泛乙酰賴氨酸（Kac）或抗泛乳酸賴氨酸（Kla）抗體進行免疫印跡，結(jié)果顯示缺氧誘導(dǎo)Snail1的乙?；腿樗峄?。給予乳酸進一步上調(diào)Snail1的乙?；腿樗峄▓D8D）。Snail1和CBP/p300之間存在相互作用，缺氧后乳酸處理促進它們之間的相互作用（圖8D）。然而，給予CHC抑制細胞內(nèi)乳酸可減輕乳酸促進的Snail1和CBP/p300之間的相互作用，以及Snail1的乙?；腿樗峄▓D8E）。反過來，與缺氧組相比，乳酸處理也顯著增加抗CBP抗體、抗p300抗體、抗pan-Kla抗體和抗pan-Kac抗體免疫沉淀中Snail1的表達（圖8F）。相比之下，給予CHC可減少Snail1與CBP/p300 之間的相互作用以及Snail1的乳酸化和乙酰化（圖8F）。

圖8. 缺氧后，乳酸促進Snail1的核轉(zhuǎn)位和乳酸化

10. 沉默Snail1減弱缺氧后的EndoMT和TGF-β/Smad2激活
       通過轉(zhuǎn)染特異性siRNA沉默Snail1逆轉(zhuǎn)缺氧后乳酸誘導(dǎo)的CD31和VE-cadherin下調(diào)（圖9A）。相反，抑制Snail1阻止乳酸促進的間充質(zhì)標志物α-SMA 和FSP1的表達（圖9A）、SMAD2磷酸化和TGF-β激活（圖9H）。qRT-PCR觀察到在乳酸處理下，敲除Snail1提高PECAM1、KDR和CDH5的mRNA水平（圖9B-D），降低ACTA2、COL1A1和S100A4的mRNA水平（圖9E-G）。此外，沉默Snail1降低乳酸誘導(dǎo)的SMAD2和TGFB1 mRNA水平（圖9I、J）。

圖9. 沉默Snail1減輕缺氧后的EndoMT和TGF-β/Smad2的激活

11. 沉默Snail1改善MI后的心臟功能并減弱EndoMT
       如圖10（A和B）所示，與假手術(shù)組相比，MI顯著促進Snail1的乳酸化和乙?；约癝nail1與CBP/p300之間的相互作用。乳酸給藥進一步誘導(dǎo)它們之間的相互作用（圖10A）。用2-DG處理減輕MI誘導(dǎo)的Snail1與CBP或p300之間的相互作用，并減少Snail1乙?；腿樗峄▓D10B）。轉(zhuǎn)染特異性Snail1 siRNA，WB和免疫熒光染色證實，施用siSnai1顯著降低Snail1在心臟中的表達（圖10C、D）。然而，沉默Snail1逆轉(zhuǎn)乳酸降低的EF%和FS%水平（圖10E、F），并防止MI后乳酸誘導(dǎo)的LVEDV和LVESV水平升高（圖10G、H），表明Snail1的缺失改善乳酸誘導(dǎo)的心臟功能障礙。此外，與MI后乳酸處理相比，沉默Snail1提高Cdh5和Kdr mRNA的表達（圖10I、J），降低Acta2、Fn1和S100a4 mRNA的表達（圖10K-M），表明Snail1有助于MI后乳酸誘導(dǎo)的EndoMT。這些數(shù)據(jù)表明，Snail1通過激活TGF-β/Smad2信號在乳酸促進的EndoMT中發(fā)揮重要作用（圖10N）。        

圖10. 沉默Snail1減輕MI后Snail1的乳酸化和EndoMT

結(jié)論
       綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)乳酸發(fā)揮一種以前未知的功能，即在MI及缺氧后，乳酸通過激活TGF-β/ Smad2通路誘導(dǎo)EndoMT增加心臟纖維化并加劇心功能不全。這些發(fā)現(xiàn)加深了我們對乳酸在MI后EndoMT中作用的理解，并將成為開發(fā)創(chuàng)新療法以改善MI后心臟重塑和功能的基礎(chǔ)。

實驗方法
siRNA體內(nèi)轉(zhuǎn)染，Masson三色染色，2,3,5-三苯基氯化四氮唑染色，2,3,5-三苯基氯細胞凋亡檢測，乳酸測定，流式細胞術(shù)，小鼠心臟內(nèi)皮細胞的分離，細胞培養(yǎng)，增殖測定，血管生成試驗，膠原凝膠收縮實驗，免疫熒光，WB，qRT-PCR，免疫沉淀，ChIP-qPCR
參考文獻
Fan M, Yang K, Wang X, Chen L, Gill PS, Ha T, Liu L, Lewis NH, Williams DL, Li C. Lactate promotes endothelial-to-mesenchymal transition via Snail1 lactylation after myocardial infarction. Sci Adv. 2023 Feb 3; 9 (5): eadc9465. doi: 10.1126/ sciadv. adc9465. Epub 2023 Feb 3. PMID: 36735787; PMCID: PMC9897666.