USP13去泛素化并穩(wěn)定細胞周期蛋白D1，促進胃癌細胞周期進程和細胞增殖

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       蛋白質(zhì)泛素化和去泛素化的可逆翻譯后修飾在細胞穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用。去泛素化酶（DUBs）負責(zé)從蛋白質(zhì)底物中去除泛素。DUBs的失調(diào)可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。在本研究中，我們通過對TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫中的胃癌（gastric cancer，GC）數(shù)據(jù)進行分析，發(fā)現(xiàn)泛素特異性蛋白酶USP13在GC樣本中顯著上調(diào)。USP13的高表達與GC患者更差的預(yù)后和更短的總生存期（OS）相關(guān)。在GC細胞中過表達USP13以酶促依賴的方式促進細胞周期進程和細胞增殖。相反，抑制USP13導(dǎo)致GC細胞周期阻滯在G1期，細胞增殖受到抑制。裸鼠實驗表明，在GC細胞中敲除USP13可以顯著抑制體內(nèi)腫瘤的生長。在機制上，USP13與cyclin D1的N端結(jié)構(gòu)域物理結(jié)合，并去除其K48 -而不是K63 -連接的多聚泛素化鏈，從而穩(wěn)定和增加cyclin D1。此外，cyclin D1的重新表達部分逆轉(zhuǎn)了USP13缺失引起的GC細胞周期阻滯和細胞增殖抑制。此外，在人GC組織中，USP13蛋白豐度與cyclin D1蛋白水平呈正相關(guān)。綜上所述，我們的數(shù)據(jù)表明USP13去泛素化并穩(wěn)定細胞周期蛋白D1，從而促進GC細胞周期進程和細胞增殖。這些發(fā)現(xiàn)表明USP13可能是治療GC的一個有前途的治療靶點。本研究于2023年6月發(fā)表在期刊《ONCOGENE》上，IF：8。

技術(shù)路線

主要研究結(jié)果
1、USP13在GC組織中高表達
       首先，我們利用癌癥基因組學(xué)圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫調(diào)查了USP13在不同腫瘤組織中的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)USP13在包括GC在內(nèi)的大多數(shù)消化系統(tǒng)腫瘤中表達上調(diào)（圖1A）。GEO數(shù)據(jù)集（GSE27342）也顯示USP13在GC組織中表達上調(diào)（圖1B）。然后我們分析了USP13在不同GC分級和亞型中的表達情況。結(jié)果表明，USP13的表達與腫瘤分級呈正相關(guān)（圖1C）。與正常相比，USP13在四種不同GC亞型中的表達均顯著升高，其中在EBV（epstein-barr virus）亞型中平均表達值最高，在GS（genomeally stable）亞型中表達最低（圖1D）。我們進一步用western blot檢測了32對GC及癌旁組織中USP13的蛋白水平，發(fā)現(xiàn)65.6%（21/32）的GC組織中USP13的蛋白水平升高（圖1E）。使用ImageJ軟件對蛋白條帶進行定量，采用配對t檢驗對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果顯示，USP13的蛋白水平在GC組織（p < 0.01）中顯著升高（圖1F）。此外，我們利用Kaplan-Meier繪圖機數(shù)據(jù)庫分析USP13表達與GC患者總生存期（overall survival，OS）的相關(guān)性。由于Kaplan-Meier繪圖機數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)集GSE62254包含了與其他所有數(shù)據(jù)集明顯不同的特征，因此我們將GSE62254從混合分析中剔除，單獨對GSE62254進行分析。3個不同的Affymetrix探針（205356_at、227788_at、226902_at）的結(jié)果也顯示了類似的趨勢，即在不包括GSE62254的合并分析中（圖1G）和在單獨分析GSE62254（附圖S1）中，USP13在GC組織中的高表達導(dǎo)致GC患者的總生存期（overall survival，OS）縮短。

圖1 USP13在GC組織中的表達水平升高，且USP13的高表達與GC患者總生存期（OS）縮短相關(guān)

2、USP63敲低顯著抑制GC中細胞周期進程和細胞增殖
       已發(fā)表的GC隊列的基因富集分析（GSEA）中展示了USP13與細胞周期顯著相關(guān)（圖2A）。因此，我們研究了USP13對GC細胞周期進程和細胞增殖的影響。我們使用攜帶陰性對照shRNA或USP13 shRNA的慢病毒感染AGS和MKN-45細胞。qRT-PCR和western blot結(jié)果證實，攜帶USP13 shRNA的慢病毒感染GC細胞后，USP13的表達水平明顯降低（圖2B、C）。隨后，我們利用流式細胞儀檢測細胞周期分布，發(fā)現(xiàn)USP13的缺失導(dǎo)致細胞周期阻滯在G1期（圖2D）?？寺⌒纬蓪嶒灲Y(jié)果顯示，USP13的缺失明顯降低GC細胞的克隆形成能力（圖2E、F）。為進一步驗證USP13對GC細胞的作用，我們設(shè)計了兩條特異性靶向USP13的小干擾RNA（siRNA）并轉(zhuǎn)染GC細胞。通過qRT-PCR和western blot驗證USP13在轉(zhuǎn)染的GC細胞中的有效敲低（圖2G、H）。EdU和CCK-8法檢測細胞增殖能力。結(jié)果表明，USP13敲低顯著抑制GC細胞的增殖和克隆形成能力（圖2I-K）。

圖2 敲低USP13誘導(dǎo)GC細胞周期阻滯于G1期，抑制細胞增殖和集落形成能力

3、USP13過表達以DUB酶活性依賴的方式促進細胞周期進程和細胞增殖
       為進一步研究USP13過表達是否具有相反的作用，我們將USP13過表達載體轉(zhuǎn)染到GC細胞（附圖S3A、B）中。流式細胞術(shù)檢測細胞周期分布，EdU和CCK-8法檢測細胞增殖能力。結(jié)果顯示，過表達USP13導(dǎo)致GC細胞（附圖S3C）的G1期細胞數(shù)量減少，GC細胞（附圖S3D-F）的細胞增殖能力增強。
       我們接著詢問USP13的DUB活性是否對其生物學(xué)功能至關(guān)重要。我們分別將WT-USP13載體和催化失活突變體USP13-C345A轉(zhuǎn)染GC細胞。驗證轉(zhuǎn)染效率（圖3A）。然后測定細胞周期分布、細胞增殖能力和克隆形成能力。我們的結(jié)果顯示，過表達WT-USP13載體顯著促進細胞周期進程（圖3B）、細胞增殖能力（圖3C-E）和克隆形成能力（圖3F-G），而過表達USP13-C345A幾乎消除了WT-USP13載體轉(zhuǎn)染介導(dǎo)的細胞增殖和克隆形成能力。這些結(jié)果表明USP13的DUB活性對其功能至關(guān)重要。

附圖3 USP13的過表達促進了GC細胞的細胞周期進程和細胞增殖能力

圖3 在GC細胞中過表達野生型USP13，而不表達USP13突變體C345A，促進細胞周期進程和細胞增殖能力。

4、USP13增加GC細胞中cyclin D1的穩(wěn)定性
       在明確了USP13在GC中的生物學(xué)作用后，我們進一步研究了其潛在的調(diào)控機制。由于USP13的功能與細胞周期進程相關(guān)，我們研究了USP13對cyclin D1和一系列其他細胞周期相關(guān)蛋白的影響，包括cyclin D2、cyclin D3、cyclin E、CDK2、CDK4、p21和p27。如Fig 4A、B所示，USP13 siRNAs顯著降低了cyclin D1蛋白水平，而對其他細胞周期相關(guān)蛋白無明顯影響。相反，USP13的增強表達以劑量依賴的方式增加了cyclin D1的蛋白水平（圖4C），而失去酶活性的突變USP13-C345A對cyclin D1的表達無明顯影響（圖4D）。
       在GC細胞（附圖S4A , B）中，USP13敲低或過表達均不改變cyclin D1 mRNA水平。為進一步證實USP13調(diào)控內(nèi)源性cyclin D1的穩(wěn)定性，我們用USP13 siRNA或表達載體轉(zhuǎn)染GC細胞，然后用蛋白合成抑制劑CHX處理細胞不同時間。我們的結(jié)果顯示，在GC細胞中，敲低USP13降低了cyclin D1的半衰期，促進了cyclin D1的降解，而過表達WT USP13，但不影響USP13 -的表達（圖4E、F）。C345A突變體延長了cyclin D1的半衰期，延緩了其降解（圖4G、H）。為進一步探究蛋白酶體降解途徑是否參與USP13介導(dǎo)的細胞周期蛋白D1的穩(wěn)定，我們用蛋白酶體抑制劑MG132處理轉(zhuǎn)染細胞，發(fā)現(xiàn)MG132緩解了USP13 siRNA誘導(dǎo)的細胞周期蛋白D1下調(diào)（圖4I）?？偟膩碚f，這些結(jié)果表明USP13通過抑制其蛋白酶體降解途徑穩(wěn)定cyclin D1。此外，我們測定了34個GC樣品中USP13和cyclin D1的蛋白豐度，發(fā)現(xiàn)這些GC組織中USP13與cyclin D1呈正相關(guān)（圖4J、K）。

圖4 USP13增加cyclin D1表達，維持其蛋白穩(wěn)定性

5、在GC細胞中，USP13直接與cyclin D1相互作用
       為深入了解USP13對cyclin D1的調(diào)控作用，我們檢測了USP13是否與cyclin D1存在相互作用。我們將帶有Myc標(biāo)簽的cyclin D1（Myc-cyclin D1）和帶有Flag標(biāo)簽的USP13（Flag-USP13）轉(zhuǎn)染到HEK293T或不同的GC細胞中，并進行外源性Co-IP實驗。如圖5A所示，在轉(zhuǎn)染了Myccyclin D1和Flag-USP13的細胞中，用抗FLAG抗體免疫沉淀的Flag-USP13中可以檢測到Myc-cyclin D1。與此一致的是，F(xiàn)lag-USP13可以被帶有抗Myc抗體的Myc-cyclin D1下調(diào)（圖5B）。隨后我們檢測了內(nèi)源性相互作用，發(fā)現(xiàn)cyclin D1可以被USP13抗體下調(diào)（圖5C），而cyclin D2和cyclin D3不能被USP13抗體下調(diào)，USP13也可以被cyclin D1抗體下調(diào)（圖5D）。為檢測USP13與cyclin D1的直接相互作用，我們用GST-USP13重組蛋白進行GST-pulldown實驗。結(jié)果顯示，純化的GST-USP13蛋白可以將cyclin D1蛋白拉下來（圖5E）。此外，免疫熒光實驗結(jié)果顯示，USP13可以與GC細胞中的cyclin D1共定位（圖5F）。
       為確定cyclin D1的哪個區(qū)域是與USP13相互作用的關(guān)鍵區(qū)域，我們構(gòu)建了兩個cyclin D1缺失突變體（圖5G），并進行了Co-IP實驗。結(jié)果表明，cyclin D1的N端可以與USP13相互作用，而C端不能與USP13相互作用（圖5H）。USP13由一個UBP（泛素特異性加工蛋白酶）型鋅指、一個USP和兩個UBA（泛素相關(guān)/翻譯延伸因子EF1B ,氨基端）結(jié)構(gòu)域組成。我們構(gòu)建了5個USP13截短突變體（圖5G），并將Myc-cyclin D1與不同F(xiàn)lag標(biāo)簽的USP13突變體共同轉(zhuǎn)染HEK293T細胞。如圖5I所示，USP13 UBA結(jié)構(gòu)域的缺失破壞了USP13與cyclin D1的相互作用，含有UBA結(jié)構(gòu)域的突變體能夠與Myc-cyclin D1相互作用，但不含USP和UBP結(jié)構(gòu)域，說明UBA結(jié)構(gòu)域?qū)τ谂ccyclin D1的相互作用至關(guān)重要。出乎意料的是，與全長USP13相比，UBP結(jié)構(gòu)域的缺失明顯降低了與cyclin D1的相互作用，表明UBP結(jié)構(gòu)域可能在USP13與cyclin D1的相互作用中發(fā)揮了一定的積極作用。

圖5 在GC細胞中，USP13直接與cyclin D1相互作用

6、USP13去除K48連接的Cyclin多泛素化鏈D1
       為進一步確定USP13是否去泛素化cyclin D1，我們將USP13 siRNAs或陰性對照siRNA與Myc-cyclin D1和HA-Ub共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，并進行Co-IP實驗。如圖6A所示，在HEK293T細胞中，用siRNA敲低USP13增加cyclin D1的泛素化水平。相反，過表達Flag-USP13降低了HEK293T細胞和GC細胞中cyclin D1的泛素化水平（圖6B）。為進一步研究USP13的去泛素化酶活性是否對該效應(yīng)至關(guān)重要，我們將WT-USP13或USP13-C345A突變體與Myc-cyclin D1和HA-Ub共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞和GC細胞。Co-IP實驗結(jié)果顯示，突變體USP13-C345A不能降低cyclin D1的泛素化水平（圖6C），表明USP13的DUB活性對于cyclin D1的去泛素化是必不可少的。為確定USP13對cyclin D1的去泛素化類型，我們將Myc-cyclin D1與HA-Ub K48或K63突變體共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，將除第48或63位賴氨酸外的所有賴氨酸殘基替換為精氨酸，同時或不與Flag-USP13共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞。如圖6D所示，在WT和K48-Ub突變體存在的情況下，USP13降低了cyclin D1的泛素化水平，而在K63-Ub突變體存在的情況下，USP13并沒有降低cyclin D1的泛素化水平，說明USP13主要鑒于USP13與cyclin D1的N端結(jié)構(gòu)域存在相互作用。
       我們推測USP13可能去除了cyclin D1 N端結(jié)構(gòu)域中與賴氨酸（K）殘基相連的多聚泛素化鏈。細胞周期蛋白D1的N端（aa1 ~ 153）有12個賴氨酸殘基。根據(jù)之前的報道，在這些賴氨酸殘基中，有5個不同的賴氨酸（K33、K46、K50、K112、K114）被檢測為潛在的泛素化位點。我們將這五個位點的每個賴氨酸殘基突變?yōu)榫彼幔≧）。我們轉(zhuǎn)染了Myc標(biāo)記的WT-cyclinD1或不同的突變體 HEK293T細胞及HA-Ub、Flag-USP13。圖6E顯示，突變體K46R和K50R取消了USP13介導(dǎo)的去泛素化，表明USP13主要在K46和K50處去除了cyclin D1的多聚泛素化鏈。去除cyclin D1上K48連接的多聚泛素化鏈。

圖6 USP13去泛素化細胞周期蛋白D1

7、USP13基因敲低可抑制GC細胞在體內(nèi)的腫瘤發(fā)生
       為研究USP13敲低是否抑制GC細胞的體內(nèi)成瘤能力，我們將穩(wěn)定敲低USP13的MKN-45GC細胞（shUSP13）或陰性對照（shNC）注射到裸鼠皮下。結(jié)果顯示，與shNC組（圖7A-C）相比，shUSP13組的腫瘤體積和腫瘤重量明顯更小、更輕。HE染色證實所有腫瘤均為實體腫瘤（圖7D）。Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，shUSP13組腫瘤中USP13和cyclin D1蛋白表達降低（圖7E），而cyclin D1 mRNA水平無明顯變化（圖7F）。免疫組化（IHC）分析顯示，shUSP13組（圖7G , H）細胞核相關(guān)抗原（Ki67）表達顯著降低。

圖7 USP13敲低抑制體內(nèi)腫瘤生長

8、USP13通過cyclin D1調(diào)控GC細胞周期進程和細胞增殖
       為進一步研究cyclin D1是否參與USP13介導(dǎo)的GC細胞生物學(xué)功能，我們進行了挽救實驗。我們將USP13 siRNA和cyclin D1表達載體共轉(zhuǎn)染GC細胞（圖8A），以確定USP13 siRNA介導(dǎo)的生物學(xué)作用是否可以被cyclin D1所阻斷。集落形成、CCK-8和EdU實驗結(jié)果顯示，cyclin D1可部分逆轉(zhuǎn)USP13 siRNA介導(dǎo)的抑制集落形成能力（圖8B、C）和細胞增殖能力（圖8D-F）的作用。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，cyclin D1可部分逆轉(zhuǎn)USP13 siRNA介導(dǎo)的細胞周期G1期阻滯（圖8G）。

圖8 Cyclin D1參與USP13介導(dǎo)的生物學(xué)功能。

實驗方法
TCGA數(shù)據(jù)庫挖掘，siRNAs及過表達質(zhì)粒，RNA提取、反轉(zhuǎn)錄，qRT-PCR，Western Blot，免疫共沉淀（Co-IP），GST pull-down實驗，免疫熒光，細胞周期分析，細胞增殖，克隆形成，慢病毒感染，BALB/c裸鼠，異種移植瘤實驗
參考文獻
Ma C, Wang D, Tian Z, Gao W, Zang Y, Qian L, Xu X, Jia J, Liu Z. USP13 deubiquitinates and stabilizes cyclin D1 to promote gastric cancer cell cycle progression and cell proliferation. Oncogene. 2023 Jul;42（29）:2249-2262. doi: 10.1038/s41388-023-02739-x. Epub 2023 Jun 13. PMID: 37311811; PMCID: PMC10348911.

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