單細(xì)胞測(cè)序揭示特應(yīng)性皮炎中的多細(xì)胞形態(tài)和互作
欄目：最新研究動(dòng)態(tài)
發(fā)布時(shí)間：2023-12-13
本研究發(fā)現(xiàn)IL19+IGFL1+KCs可能參與了皮膚屏障的破壞、Th2和Th17炎癥反應(yīng)的連接和放大以及皮膚瘙癢的介導(dǎo)......
特應(yīng)性皮炎（AD）是一種慢性、復(fù)發(fā)性炎癥性皮膚病，以劇烈瘙癢和濕疹為特征。據(jù)報(bào)道，不同種族群體的特應(yīng)性皮炎在臨床、分子和遺傳方面存在差異。本研究旨在對(duì)中國人群中的AD進(jìn)行深入的轉(zhuǎn)錄組分析。ScRNA-seq共分析了 87,853個(gè)細(xì)胞，其中AD 中的角質(zhì)細(xì)胞（KCs）表現(xiàn)出高表達(dá)的角質(zhì)細(xì)胞活化和促炎癥基因。KCs表現(xiàn)出一種新的IL19 + IGFL1 +亞群，在AD病變中有所增加。炎性細(xì)胞因子IFNG、IL13、IL26和IL22在AD病變中高表達(dá)。在體外，IL19直接下調(diào)HaCaT細(xì)胞中的KRT10和LOR，并激活HaCaT細(xì)胞產(chǎn)生TSLP。因此，IL19+IGFL1+KCs可能參與了皮膚屏障的破壞、Th2和Th17炎癥反應(yīng)的連接和放大以及皮膚瘙癢的介導(dǎo)。此外，在AD慢性病灶中會(huì)出現(xiàn)以2型炎癥反應(yīng)為主的多種免疫軸的進(jìn)行性激活。本文于2023年6月發(fā)表在《Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology》IF：9.2期刊上。
技術(shù)路線
主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1、AD和健康（HC）皮膚活檢樣本的scRNA-seq檢測(cè)皮膚細(xì)胞類型
本文scRNA-seq的程序流程如圖1a所示。使用降維分析展示了scRNA-seq檢測(cè)到的9種細(xì)胞cluster和10種細(xì)胞類型（圖1b）。頂端上調(diào)基因（根據(jù)平均log2(FC)和FDR）證實(shí)了細(xì)胞類型對(duì)特定簇的分配（圖1c）。經(jīng)典marker基因也證實(shí)了細(xì)胞類型的注釋（圖1d）。比較了AD組和HC組的細(xì)胞組成，發(fā)現(xiàn)在AD慢性病變中，基礎(chǔ)KC的比例顯著降低，而增殖KC的比例顯著升高，符合AD的表皮過度增生和異常分化的本質(zhì)，與此同時(shí)，AD慢性病變中黑素細(xì)胞的比例大幅下降（圖1e,f）。
圖1在AD和健康對(duì)照皮膚活檢中的細(xì)胞類型
2、AD和HC中的角質(zhì)細(xì)胞的分化
在兩組中，所有四種KC簇都存在（圖2a），并表現(xiàn)出相似的結(jié)構(gòu)和增殖標(biāo)記的表達(dá)。比較scRNA-seq數(shù)據(jù)中AD和HC組的差異表達(dá)基因（DEGs），發(fā)現(xiàn)低表達(dá)干細(xì)胞和基礎(chǔ)角質(zhì)形成細(xì)胞基因（KRT15, COL17A1），但高表達(dá)干擾素響應(yīng)基因（IFI27, IFITM1）和基因SERPINB13，這些基因參與AD基礎(chǔ)KC的角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和分化（圖2b）。AD 基底上層KC的炎癥轉(zhuǎn)錄本進(jìn)一步明顯上調(diào)，包括alarmins（S100A7、S100A8 和 S100A9）和Th 誘導(dǎo)基因SERPINB4；調(diào)節(jié)有絲分裂后細(xì)胞向分化的TXNIP6AD病變中的表達(dá)下降（圖2c）。在增殖的 KC 中，AD患者的角朊細(xì)胞活化標(biāo)志物KRT6A、KRT6B、KRT6C和KRT16以及趨化因子CCL2均顯著上調(diào)（圖2d）。在AD的晚期分化KC中，大量下調(diào)的基因包括編碼屏障分子（FLG、LOR）和緊密連接復(fù)合體（CLDN1、OCLN）的基因。另一方面，參與局部炎癥反應(yīng)的IL36信號(hào)系統(tǒng)基因IL36RN、IL36G在AD晚分化KC中上調(diào)（圖2e）。KCs DEGs的GO富集分析表明，主要的生物學(xué)過程包括先天免疫反應(yīng)、激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、髓細(xì)胞分化、上皮細(xì)胞增殖、抗原加工和遞呈、淋巴細(xì)胞分化（圖2f）。
圖2 AD與健康對(duì)照的角質(zhì)細(xì)胞分化
所有單細(xì)胞的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)使作者得以解構(gòu)KCs的時(shí)空分布。在HC中，作者發(fā)現(xiàn)了從干細(xì)胞基因（KRT15、COL17A1）富集的基底型KC到表達(dá)CDSN、FLG和LOR的晚分化型KC的雙重推斷分化軌跡（圖3a,b），這與之前的報(bào)道一致。為了深入了解基因表達(dá)沿軌跡的動(dòng)態(tài)變化，分析了基因的表達(dá)變化，觀察到六大類轉(zhuǎn)錄基因簇的特征模式。Cluster 2的基因（如連接蛋白基因LAD1、皮膚屏障功能基因TMEM79和縫隙連接基因GJA1）表達(dá)上調(diào)并維持在高表達(dá)水平直至最后階段，主要參與調(diào)控 "皮膚屏障的建立、膽固醇代謝過程、脫絨毛組織 "等生物學(xué)過程（圖3c,d）。值得注意的是，在AD病變中，發(fā)現(xiàn)了KCs的多種分化軌跡（圖3e,f）。盡管發(fā)現(xiàn)cluster 4中的炎癥和過度增殖基因（SPRR1、SPRR2、S100A7 和 S100A8）也表現(xiàn)出了持續(xù)的高表達(dá)模式，在GO術(shù)語"中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的免疫，粒細(xì)胞趨化的正向調(diào)節(jié)，肥大細(xì)胞趨化"中也有表達(dá)（圖3g,h）。
圖3 角質(zhì)細(xì)胞分化軌跡
3、AD病變中新型炎癥分化的IL19+IGFL1+KC亞群
作者聚焦于基底層KC，聚類后使用t-SNE 進(jìn)行可視化降維描繪了14個(gè)細(xì)胞簇（圖4a），其中基底層KC cluster 5主要包含病變的AD細(xì)胞（圖4b），其IL19和IGFL1高表達(dá)（圖4c,d），這在之前的健康KC研究中沒有報(bào)道過。同時(shí)，IL19+IGFL1+KC主要存在于AD病灶中（圖4e）。為驗(yàn)證并確定這些IL19+IGFL1+KC的解剖位置，對(duì)代表性標(biāo)記物進(jìn)行了多重免疫組化。IL19和IGFL1雙重染色細(xì)胞在棘層中最為顯著（圖4f），在AD病變中明顯多于HC（圖4g）。接下來，探討了IL19在體外的表達(dá)和功能。將HaCaT細(xì)胞與Der p（100 μg/mL）共培養(yǎng)24小時(shí)。通過RT-qPCR，發(fā)現(xiàn)Der p可誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞產(chǎn)生IL19（圖4h）。與PBS相比，在IL19（40 ng/mL）處理的HaCaT細(xì)胞中檢測(cè)到了更高的TSLP mRNA水平（圖4i）；然而，KRT10和LOR mRNA水平則出現(xiàn)了下調(diào)（圖4j,k）。對(duì)IL19+IGFL1+KC的DEGs分析顯示，Th17軸相關(guān)基因（S100A12、DEFB4A和PI3）、高增殖基因（KRT6A、KRT16、NTRK1和EPGN）和S100基因（S100A7、S100A8）高度表達(dá)。此外，分析表明，與HCs相比，AD病變中組胺受體（HRH1、HRH2）、allikin釋放酶KLK7和整合素相關(guān)基因CD47的基因表達(dá)大幅上調(diào)，而KRT15、CLDN1則下調(diào)（圖4l）。IL19+IGFL1+KC的DEGs的GO分析顯示主要涉及調(diào)控凋亡和表皮生長因子受體信號(hào)通路，角質(zhì)形成細(xì)胞增殖，髓樣細(xì)胞和淋巴細(xì)胞分化（圖4m）。
圖4 AD病變中新型炎癥分化的IL19 + IGFL1 + KC亞群
4、免疫細(xì)胞激活促進(jìn)免疫微環(huán)境重塑
在AD慢性病變中，2型和22型細(xì)胞因子IL13、IL22的表達(dá)進(jìn)一步升高，1型和17型細(xì)胞因子IFNG、IL26的表達(dá)進(jìn)一步升高。在病變T細(xì)胞中，KC分泌分子IL25、IL19和IGFL1的受體分子IL17RB、IL20RB和IGFLR1表達(dá)較高（圖5a）。GO富集分析顯示，T細(xì)胞分化增殖、Th1型免疫應(yīng)答和Th17型免疫應(yīng)答在病變T細(xì)胞中富集（圖5b）。因此，scRNA-seq數(shù)據(jù)證實(shí)了記憶/效應(yīng)1型、2型、17型和22型T細(xì)胞在AD慢性病變中的活躍擴(kuò)增。
在AD病變中，髓系細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞的招募和極化起著至關(guān)重要的作用。根據(jù)先前的研究，AD特異性DCs包括CD1A、FCER1A和MRC1陽性的炎性樹突狀表皮細(xì)胞（IDEC）亞群和一個(gè)少量但重要的表達(dá)LAMP3（成熟DCs的標(biāo)記）的細(xì)胞亞群，后者以CCL19受體CCR7的強(qiáng)表達(dá)而與之區(qū)分（圖5c）。同樣，AD標(biāo)志性趨化因子CCL17、CCL2222以及TSLP受體成分IL7R也出現(xiàn)了上調(diào)（圖5d）。GO富集分析表明，DEGs在抗原處理和表達(dá)、T細(xì)胞分化、活化和遷移方面有顯著富集（圖5e）?？傊庖呒?xì)胞顯示出多個(gè)炎癥基因的失調(diào)，并促進(jìn)了AD病變中免疫微環(huán)境的重塑。
圖5 AD病變中的免疫細(xì)胞激活
5、細(xì)胞類型簇中潛在配體-受體相互作用分析
scRNA-seq數(shù)據(jù)提供了一個(gè)獨(dú)特的機(jī)會(huì)用來研究由配體-受體相互作用介導(dǎo)的潛在細(xì)胞-細(xì)胞通訊。在所有細(xì)胞的網(wǎng)絡(luò)圖中觀察到，KC細(xì)胞、T細(xì)胞和類髓鞘細(xì)胞之間的相互作用最為豐富，這表明KCs和免疫細(xì)胞之間的相互作用信號(hào)在AD中的重要性（圖6a, b）。接下來確定了配體-受體對(duì)。AD病變中，IFNG IFNG、IL13、IL26、IL22與各自受體之間的相互作用在T細(xì)胞和KC之間的相互作用明顯增強(qiáng)。值得注意的是，血管內(nèi)皮生長因子信號(hào)，如VEGFA-KDR、VEGFA-FLT1和NRP2-VEGFA在KCs、骨髓細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞之間發(fā)生了改變。配體-受體相互作用分析還預(yù)測(cè)髓系細(xì)胞上的CXCL8和CCL17與血管內(nèi)皮細(xì)胞上的ACKR1有顯著的富集相互作用，而ACKR1能介導(dǎo)免疫細(xì)胞的遷移，這與之前的研究結(jié)果相當(dāng)一致。AD中髓系細(xì)胞與T細(xì)胞之間的配體-受體相互作用增強(qiáng)，如CD28-CD86和CTLA4-CD80（圖6c,d）。
圖6 細(xì)胞類型簇中潛在配體-受體相互作用分析
實(shí)驗(yàn)方法
采集臨床樣本，細(xì)胞培養(yǎng)和刺激，單細(xì)胞樣本懸浮液制備，單細(xì)胞測(cè)序（scRNA-seq）和生信分析，多色免疫組化，RT- qPCR，
參考文獻(xiàn)
Zhou J, Liang G, Liu L, Feng S, Zheng Z, Wu Y, Chen X, Li X, Wang L, Wang L, Song Z. Single-cell RNA-seq reveals abnormal differentiation of keratinocytes and increased inflammatory differentiated keratinocytes in atopic dermatitis. J Eur Acad Dermatol Venereol. 2023 Jun 16. doi: 10.1111/jdv.19256.