TNFAIP2通過(guò)KEAP1/NRF2信號(hào)傳導(dǎo)賦予頭頸部鱗狀細(xì)胞癌順鉑耐藥

       耐藥限制了順鉑類化療在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(HNSCC)中的治療效果，其潛在機(jī)制尚不完全清楚。本研究的目的是探討HNSCC順鉑耐藥的原因。在本研究中，TNFAIP2的高表達(dá)與HNSCC的不良預(yù)后、順鉑耐藥和低活性氧(ROS)水平相關(guān)。具體來(lái)說(shuō)，它通過(guò)抑制ROS介導(dǎo)的c-JUN N-末端激酶(JNK)磷酸化，保護(hù)癌細(xì)胞免受順鉑誘導(dǎo)的凋亡。機(jī)制上，TNFAIP2中包含的DLG基序通過(guò)直接結(jié)合KEAP1的Kelch結(jié)構(gòu)域與NRF2競(jìng)爭(zhēng)，從而阻止NRF2進(jìn)行泛素蛋白酶體介導(dǎo)的降解。這導(dǎo)致NRF2的積累并產(chǎn)生順鉑耐藥性。在HNSCC標(biāo)本中證實(shí)了TNFAIP2蛋白水平與NRF2及其下游靶基因之間的正相關(guān)。我們的研究結(jié)果揭示了TNFAIP2/KEAP1/NRF2/ JNK軸在HNSCC中的抗氧化和順鉑耐藥調(diào)節(jié)作用，提示TNFAIP2可能是改善順鉑治療效果的潛在靶點(diǎn)，特別是對(duì)于順鉑耐藥患者。本文于2023年8月發(fā)表于“Journal of Experimental & Clinical Cancer Research”（IF=11.3）上。
技術(shù)路線

結(jié)果
1）TNFAIP2高表達(dá)的HNSCC患者易出現(xiàn)順鉑治療失敗
       我們對(duì)178例HNSCC患者進(jìn)行了免疫組化染色。我們發(fā)現(xiàn)TNFAIP2在晚期患者中表達(dá)上調(diào)，提示其腫瘤促進(jìn)作用(圖1a和b)。TNFAIP2高表達(dá)表明總生存率較差(圖1c)。我們觀察到TPF化療在TNFAIP2低表達(dá)組中取得了更好的治療效果(圖1 -f)。在另一個(gè)HNSCC患者單獨(dú)接受TPF治療的隊(duì)列(n = 20)中，TNFAIP2在TPF治療耐藥患者中顯著上調(diào)(圖1g)。表達(dá)水平有效地區(qū)分了TPF治療的合適候選者(圖1h)。我們進(jìn)一步研究了10個(gè)HNSCC細(xì)胞系中TNFAIP2 mRNA水平與紫杉醇、順鉑和5-氟尿嘧啶半IC50之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示，順鉑IC50與TNFAIP2表達(dá)呈正相關(guān)(圖1i、j)。此外，IC50結(jié)果證實(shí)，TNFAIP2過(guò)表達(dá)增加了順鉑耐藥性，而其敲低則降低了順鉑耐藥性(圖1k、l)。隨后，我們通過(guò)將FADU皮下接種到BALB/c裸鼠中，并給予指示治療(圖1m)，建立了異種移植腫瘤模型。結(jié)果顯示，TNFAIP2過(guò)表達(dá)對(duì)腫瘤重量和體積均無(wú)影響，但明顯降低了順鉑的治療效果(圖1n)。Ki67染色在體內(nèi)證實(shí)了這種作用(圖1o)。綜上所述，上述結(jié)果揭示了TNFAIP2在順鉑治療HNSCC中的不良作用。

2）TNFAIP2通過(guò)抑制ROS/JNK信號(hào)保護(hù)HNSCC細(xì)胞免受順鉑誘導(dǎo)的凋亡
       根據(jù)以往的報(bào)道，惡性腫瘤通過(guò)多種機(jī)制逃避順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)TNFAIP2過(guò)表達(dá)時(shí)，ROS水平降低(圖2a和b)。此外，GSH/GSSG比值以及SOD活性也增加，表明氧化應(yīng)激減輕(圖2c)。ROS清除劑NAC恢復(fù)了TNFAIP2敲低誘導(dǎo)的順鉑耐藥(圖2d-g)。大量證據(jù)表明，過(guò)量的ROS通過(guò)持續(xù)激活JNK通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。我們假設(shè)TNFAIP2以ROS/JNK途徑抑制的方式保護(hù)癌細(xì)胞免受順鉑細(xì)胞毒性(圖2h)。結(jié)果，JNK抑制劑(SP600125)逆轉(zhuǎn)了TNFAIP2敲低誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率和順鉑敏感性的增加(圖2i和j)。Western blot分析顯示，當(dāng)TNFAIP2過(guò)表達(dá)時(shí)，順鉑誘導(dǎo)的JNK磷酸化和順鉑誘導(dǎo)的caspase 9和caspase 3的激活持續(xù)被抑制(圖2k)。NAC逆轉(zhuǎn)TNFAIP2敲低誘導(dǎo)的信號(hào)增強(qiáng)(圖21)，表明TNFAIP2通過(guò)抑制ROS/JNK途徑保護(hù)HNSCC細(xì)胞免受順鉑誘導(dǎo)的凋亡。

3）TNFAIP2通過(guò)抑制NRF2的泛素化和降解來(lái)穩(wěn)定NRF2蛋白
       基于TCGA和GEO (GSE39366)數(shù)據(jù)的進(jìn)一步富集分析顯示，NRF2信號(hào)在TNFAIP2高表達(dá)的組織中顯著上調(diào)(圖3a)。我們認(rèn)為TNFAIP2的抗氧化作用是由NRF2介導(dǎo)的。正如預(yù)期的那樣，當(dāng)NRF2被敲除時(shí)，TNFAIP2過(guò)表達(dá)不影響ROS水平(圖3b和c)，而促進(jìn)順鉑耐藥的能力也消失了(圖3d和e)。此外，一組NRF2靶基因，包括HO1、NQO1、GCLC、CAT和SOD2，在mRNA和蛋白水平上與TNFAIP2一起發(fā)生改變(圖3f和g)。這些結(jié)果表明TNFAIP2的抗氧化和順鉑耐藥功能是由NRF2介導(dǎo)的。然后，我們發(fā)現(xiàn)TNFAIP2影響的是NRF2的蛋白水平而不是mRNA水平(圖3 h和i)，表明這種調(diào)控作用發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后階段。經(jīng)環(huán)己亞胺(CHX)處理后，TNFAIP2敲低組NRF2降解更快(圖3j)，表明TNFAIP2抑制NRF2蛋白降解，但不促進(jìn)其合成。隨后，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)TNFAIP2被敲低時(shí)，蛋白酶體抑制劑MG132或類泛素化修飾抑制劑MLN4924可阻斷NRF2的降解(圖3k)。此外，免疫共沉淀(Co-IP)實(shí)驗(yàn)顯示，當(dāng)TNFAIP2被敲除時(shí)，泛素結(jié)合的NRF2增加，這可以通過(guò)TNFAIP2過(guò)表達(dá)來(lái)恢復(fù)(圖31)?？傊琓NFAIP2通過(guò)促進(jìn)NRF2蛋白穩(wěn)定表現(xiàn)出抗氧化和順鉑耐藥功能。

4）TNFAIP2與KEAP1相互作用以穩(wěn)定NRF2
       為了確定TNFAIP2穩(wěn)定NRF2的機(jī)制，我們使用Co-IP/MS進(jìn)行了高通量篩選。結(jié)果顯示TNFAIP2和KEAP1之間存在廣泛的結(jié)合關(guān)系(圖4a)， Co-IP驗(yàn)證了這一點(diǎn)(圖4b)。我們推測(cè)KEAP1可能介導(dǎo)TNFAIP2的氧化應(yīng)激抑制和順鉑耐藥促進(jìn)作用。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，我們敲低了KEAP1，發(fā)現(xiàn)TNFAIP2過(guò)表達(dá)不會(huì)導(dǎo)致ROS減少(圖4c)、IC50升高(圖4d和e)、NRF2蛋白積累(圖4f)。Co-IP實(shí)驗(yàn)顯示，當(dāng)TNFAIP2被敲除時(shí)，KEAP1結(jié)合了更多的NRF2(圖4g)。相反，當(dāng)TNFAIP2以濃度梯度過(guò)表達(dá)時(shí)，KEAP1沉淀的NRF2量逐漸減少(圖4h)。

5）DLG基序和kelch結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)TNFAIP2與KEAP1的相互作用
       我們構(gòu)建了一系列的截短質(zhì)粒來(lái)探索TNFAIP2和KEAP1之間特異的相互作用位點(diǎn)(圖5a)。首先，將flag標(biāo)記的TNFAIP2全長(zhǎng)和his標(biāo)記的KEAP1片段質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中。co-IP分析顯示，只有含有Kelch結(jié)構(gòu)域的片段才能與TNFAIP2相互作用(圖5b)。同樣，TNFAIP2的全長(zhǎng)(N1-654)和其他兩個(gè)片段(N328-654和N328-520)也被KEAP1沉淀，這意味著TNFAIP2通過(guò)N328-520片段與KEAP1相互作用(圖5c)。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)DLG基序恰好位于TNFAIP2的N328-520片段中，該片段在不同物種中高度保守(圖5d)。此外，我們構(gòu)建了一個(gè)DLG缺失(ΔDLG)和兩個(gè)突變體flag標(biāo)記的質(zhì)粒(圖5a)。正如預(yù)期的那樣，三者都不能與KEAP1相互作用(圖5e)。與野生型TNFAIP2組相比，三個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的NRF2泛素化水平均未降低(圖5f)。此外，我們還進(jìn)行了一系列的拯救實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證DLG基序的作用。我們發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)的N328-520片段逆轉(zhuǎn)了由TNFAIP2干擾引起的ROS水平升高、順鉑敏感性升高和NRF2豐度降低(圖5g-j)。這些結(jié)果表明，DLG基序和Kelch結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)了TNFAIP2與KEAP1的相互作用和順鉑耐藥的發(fā)展。

6）靶向Tnfaip2可促進(jìn)體內(nèi)順鉑治療效果
       為了探索抑制TNFAIP2對(duì)順鉑治療的促進(jìn)作用，我們建立了4NQO誘導(dǎo)的HNSCC小鼠模型(圖6a)。在Tnfaip2敲低組中，腫瘤病變面積減少，但當(dāng)Tnfaip2過(guò)表達(dá)時(shí)，這種效果不顯著。此外，si-Tnfaip2與順鉑聯(lián)合使用的腫瘤抑制和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)效果最為顯著(圖6b-d)。同時(shí)，腫瘤侵襲性明顯受到抑制(圖6e)。GSH/GSSG比值和SOD活性持續(xù)下降，表明敲低Tnfaip2會(huì)加重腫瘤內(nèi)氧化應(yīng)激(圖6f)。免疫組化染色表明當(dāng)Tnfaip2被抑制時(shí)，NRF2及其靶基因在蛋白水平上有效減少(圖6g和h)。以上結(jié)果證實(shí)了Tnfaip2特異性siRNA可以通過(guò)抑制HNSCC中的NRF2信號(hào)改善順鉑治療效果。

7）HNSCC患者TNFAIP2表達(dá)與NRF2表達(dá)呈正相關(guān)
       為了驗(yàn)證TNFAIP2和NRF2在HNSCC中的表達(dá)水平及其相關(guān)性，我們首先使用western blotting檢測(cè)了20對(duì)HNSCC組織中TNFAIP2和NRF2的表達(dá)。與鄰近正常組織相比，TNFAIP2和NRF2在HNSCC組織中的表達(dá)更高(圖7a)。在TNFAIP2低表達(dá)的組織中，NRF2也下調(diào)(圖7 b)。免疫組化染色顯示TNFAIP2與NRF2、HO1和NQO1呈正相關(guān)(圖7c和d)，這表明TNFAIP2可能在HNSCC中作為NRF2信號(hào)啟動(dòng)子。

結(jié)論
       TNFAIP2可以通過(guò)與KEAP1的競(jìng)爭(zhēng)性相互作用來(lái)穩(wěn)定NRF2，從而抑制順鉑誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致順鉑耐藥。TNFAIP2可能是改善HNSCC化療治療效果的潛在治療靶點(diǎn)。

實(shí)驗(yàn)方法
WB，Co-IP/MS，RT?qPCR，CCK-8，克隆形成實(shí)驗(yàn)，流式，ROS和抗氧化能力檢測(cè)，免疫組化，TUNEL染色，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。
參考文獻(xiàn)
Xu T, Yang Y, Chen Z, Wang J, Wang X, Zheng Y, Wang C, Wang Y, Zhu Z, Ding X, Zhou J, Li G, Zhang H, Zhang W, Wu Y, Song X. TNFAIP2 confers cisplatin resistance in head and neck squamous cell carcinoma via KEAP1/NRF2 signaling. J Exp Clin Cancer Res. 2023 Aug 1;42(1):190. doi: 10.1186/s13046-023-02775-1.