鐵死亡抑制劑可治療大小鼠的糖尿病視網膜病

       糖尿病視網膜?。―R）是導致全球失明的主要原因之一，及時預防和治療非常重要。此前，作者發(fā)現(xiàn)一種神經退行性因子膠質細胞成熟因子-β（GMFB）在糖尿病早期就在玻璃體內上調，這可能在發(fā)病機制中起著重要作用。在這里，作者發(fā)現(xiàn)在高糖環(huán)境下，玻璃體內可分泌大量GMFB蛋白，它可將ATPase ATP6V1A 從溶酶體中轉移出來，阻止其組裝，并使視網膜色素上皮細胞（RPE）溶酶體堿化。ACSL4蛋白可被伴侶蛋白介導的自噬受體HSC70識別，并最終在溶酶體中被消化。自噬-溶酶體降解過程的異常會導致其積累，從而催化產生致命的過氧化脂質，最終誘發(fā)RPE細胞的鐵死亡。GMFB抗體、溶酶體激活劑NKH477、CMA激活劑QX77和鐵氧化酶抑制劑Liproxstatin-1都能有效預防早期DR，維持正常視功能，具有很強的臨床應用價值。本研究拓寬了人們對自噬與鐵蛋白沉積之間關系的認識，為治療DR提供新的治療靶點。本文于2022年7月發(fā)表在《Redox Biology》IF: 11.4期刊上。
技術路線

主要實驗結果
1、玻璃體中高濃度的GMFB會損害視網膜和RPE細胞的功能
       作者此前的研究結果表明，在糖尿病大鼠模型構建過程中，早在STZ注射后1天，玻璃體中GMFB就迅速增加（圖1A）。為驗證Müller細胞是否能在高葡萄糖刺激下分泌GMFB，作者用25 mM葡萄糖處理大鼠Müller細胞系，并在超濾離心后檢測培養(yǎng)液中的GMFB含量。正如設想的那樣，在高糖處理12小時后，培養(yǎng)基中的GMFB濃度明顯增加（圖1B）。為研究GMFB在體內的影響，將0.2 μg重組GMFB蛋白或等體積的PBS注入SD大鼠的玻璃體內，持續(xù)2/4 周。注射GMFB會明顯破壞視網膜的生理功能并誘導神經變性（圖1C-E），但不會激活神經膠質細胞（圖1F-G）。鑒于已發(fā)現(xiàn)GMFB 可影響多種神經細胞的凋亡和氧化應激，作者還檢測了注射GMFB后視網膜中的ROS水平，發(fā)現(xiàn)RPE細胞層是主要的作用部位（圖1H）。
       為在體外檢測其影響，在GMFB處理ARPE19細胞后，檢測ZO-1和RPE65 的表達模式以及TEER。如假設的一致，細胞相互作用或連接以及RPE65蛋白表達在暴露后有效減少（圖1I-K）。總之，這些結果表明玻璃體內高濃度的GMFB會損害視網膜的生理功能，尤其是RPE細胞。

圖1玻璃體中高濃度的GMFB會損害視網膜和RPE細胞的功能

2、細胞外GMFB誘導RPE細胞鐵死亡
       為確定與細胞外GMFB相關的基因組特征和機制，用GMFB處理ARPE19細胞4小時，并進行了基于RNA-seq表達的GSEA分析。意想不到的是，許多與鐵死亡相關的通路在GMFB處理后的差異表達基因中得到了富集（圖2A）。通過透射電子顯微鏡（TEM），觀察到處理過的細胞中線粒體的形態(tài)特征明顯變小，膜密度增加（圖2B，紅色箭頭標記的線粒體），有報道稱這種現(xiàn)象發(fā)生在鐵死亡的細胞中。為進一步研究這一發(fā)現(xiàn)，檢測細胞活力和兩個公認標記物（ACSL4和GPX4）的蛋白表達水平，它們在GMFB處理后都發(fā)生顯著變化（圖2C-D）。
       鐵死亡的核心代謝機制是脂質過氧化和鐵平衡失調。細胞外GMFB增加脂質過氧化、誘導GSH缺乏和線粒體活性降低（圖2E-G）。與此同時，在注射GMFB的視網膜中也發(fā)現(xiàn)有毒的脂質過氧化產物4-HNE的積累（圖2H）。為進一步研究GMFB是否通過脂質過氧化誘導的鐵死亡影響細胞功能，用抑制劑鐵死亡liproxstatin-1 (LX-1)預處理ARPE19細胞。LX-1阻止GMFB誘導的脂質過氧化、GSH缺乏和細胞死亡（圖2C和4G），并對細胞連接有顯著的保護作用（圖2I-J）。這些結果表明，細胞外GMFB可誘導RPE細胞發(fā)生鐵死亡反應，主要表現(xiàn)為脂質過氧化，并最終損害細胞的生理功能。

圖2細胞外GMFB誘導RPE細胞鐵死亡

3、細胞外GMFB誘導RPE細胞溶酶體功能障礙和自噬阻斷
       除線粒體受損外，還意外地在經GMFB處理的ARPE19細胞中用TEM觀察到大量自噬空泡（圖3A）。自噬降解脫落的感光細胞外節(jié)是RPE細胞最重要的功能之一。自噬體數量和P62蛋白表達的增加驗證了GMFB對自噬通量的影響（圖3B-C）。與體外實驗結果一致，注射GMFB后，視網膜尤其是RPE層積累了大量自噬相關蛋白（圖3D-F）。
       鑒于P62的降解標志著自噬的正常功能，GMFB可能會影響ARPE19細胞自噬的后期階段，包括自噬體-溶酶體融合和溶酶體功能。免疫熒光共定位結果未顯示自噬體與溶酶體融合過程中的異?，F(xiàn)象。然而，溶酶體追蹤紅染色結果表明，GMFB處理會破壞溶酶體的酸化和活性（圖3G）。維持高酸性pH值對溶酶體的正常消化功能至關重要，而高酸性pH值主要由液泡H+-ATPase（V-ATPase）復合物產生。令人驚訝的是，經GMFB處理后，膜上亞基ATP6V1A的表達比例明顯下降（圖3H）。此外，ATPase激活 NKH47 增加了溶酶體的酸度，從而抑制了P62 的積累（圖3G和4F）。這些數據共同表明，細胞外GMFB通過損傷RPE細胞溶酶體功能影響自噬通量。

圖3細胞外GMFB誘導RPE細胞溶酶體功能障礙和自噬阻斷

4、GMFB誘導的溶酶體功能障礙通過ACSL4積累導致鐵死亡
       為確定溶酶體失效是否能誘導RPE細胞的鐵死亡反應，直接用ATPase抑制劑BafA1處理細胞，它能特異性抑制溶酶體活性并誘導P62的積累（圖4A）。如圖4B-E所示，BafA1處理會顯著降低細胞活力和GSH濃度，以時間依賴的方式增加ACSL4表達和MDA水平，并破壞RPE細胞的線粒體，所有這些都是鐵死亡反應的特征。相反，ATPase激活劑NKH477增加溶酶體的酸度和活性，保護自噬通量，從而抑制P62和ACSL4的積累（圖4F）。與假設類似，NKH477還能阻止GMFB誘導的細胞死亡、MDA生成和GSH缺乏，防止活性線粒體和細胞緊密連接的減少（圖4G-K）。這些結果標志著溶酶體平衡在抵抗鐵死亡反應中的重要性，并證明細胞外GMFB通過阻礙自噬-溶酶體降解誘導RPE細胞鐵死亡反應。
       假設溶酶體功能障礙通過上調ACSL4誘導鐵死亡反應。令人驚訝的是，轉染ACSL4-siRNA的細胞比對照組具有明顯更高的活性和更低的MDA水平，即使在正常狀態(tài)下，這些細胞也能抵抗GMFB或BafA1誘導的鐵死亡反應（圖4L-O）。這些結果表明，GMFB誘導的溶酶體失效通過上調ACSL4導致ARPE19細胞的鐵死亡。

圖4 GMFB誘導的溶酶體功能障礙通過ACSL4積累導致鐵死亡

5、ACSL4是伴侶蛋白介導自噬（CMA）的底物
       GMFB對ACSL4蛋白表達的影響不是通過激活轉錄實現(xiàn)的（圖5A），這表明GMFB可能是通過損害溶酶體中的降解過程來上調ACSL4的。為驗證這一點，用蛋白酶體或溶酶體抑制劑檢測CHX處理后的蛋白表達（圖5B）。然而，正如之前的假設，溶酶體抑制劑CQ也能抑制其降解（圖5B）。這與之前研究的差異可能是由于細胞特異性或不同的疾病背景造成的。
       自噬有三種形式：大自噬、微自噬和CMA，它們都在溶酶體中降解底物。在ARPE19細胞中，ACSL4沒有與選擇性大自噬所需的受體P62共定位（圖5C）。然而，ACSL4與CMA受體LAMP2或HSC70之間存在明顯的共定位，GMFB處理后這種共定位也增加了（圖5D-E）。為研究ACSL4是否能被CMA降解，用不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)液或含有QX77的完全培養(yǎng)液處理ARPE19細胞，QX77能通過增加LAMP2的表達激活CMA。與假設類似，這兩種方法都促進了ACSL4的降解（圖5F）。構建重組質粒ACSL4-Flag和HA-HSC70，通過免疫沉淀直接檢測兩者的結合。在ARPE19細胞的Flag-IP裂解中發(fā)現(xiàn)了HA-tag的表達，HSC70的加入也促進了ACSL4蛋白的降解（圖5G-H）。在HEK293T細胞中也觀察到了同樣的結果（圖5I）。
       CMA只能降解與HSC70結合的、帶有KFERQ樣基序的可溶性蛋白質，而在ACSL4蛋白序列中可能有六個KFERQ樣基序（圖5J）。為了從功能上確定最重要的識別和降解基序，作者生成了在假定的CMA基團上有2-aa突變的ACSL4突變體：³⁰²QCERI³⁰⁶突變成³⁰²AAERI³⁰⁶，³⁵¹QSSKI³⁵⁵突變成³⁵¹AASKI³⁵⁵，⁴⁰⁷KLEQI⁴¹¹突變成⁴⁰⁷KLEAA⁴¹¹，⁵⁶⁶QIIDR⁵⁷⁰突變成⁵⁶⁶AAIDR⁵⁷⁰，⁵⁷⁴LVKLQ⁵⁷⁸突變成⁵⁷⁴LVKAA⁵⁷⁸，⁶²⁹QKGVE⁶³³突變成⁶²⁹AAGVE⁶³³。具有³⁰²QCERI³⁰⁶，⁵⁶⁶QIIDR⁵⁷⁰，⁵⁷⁴LVKLQ⁵⁷⁸的突變基序的ACSL4對HCC誘導的降解的抵抗性增強（圖5K）。綜上所述，ACSL4是伴侶蛋白介導的自噬的底物，可被受體HSC70識別并在溶酶體中降解。

圖5 ACSL4是伴侶蛋白介導自噬（CMA）的底物

6、CMA激活劑QX77或鐵死亡抑制劑LX-1可挽救GMFB誘導的視網膜功能障礙
       為證實CMA和鐵突變在GMFB誘導的視網膜病變中的作用，將GMFB與 CMA激活劑QX77和鐵死亡抑制劑LX-1一起注入玻璃體內。這兩種藥物都能減少神經變性，并對視網膜的生理功能有顯著的保護作用（圖6A-B）。治療后視網膜中4HNE的濃度和ACSL4蛋白的表達也有所下降（圖6C-D）。意想不到的是，在注射GMFB組中，GPX4 的水平也有顯著增加，而GPX4是一種抗氧化酶，在將有毒的脂質氫過氧化物轉化為無毒的醇類方面起著關鍵作用。這可能是因為GPX4也可以通過CMA在溶酶體中降解，也可能是因為在復雜的視網膜結構中出現(xiàn)了代償效應。
       總之，本研究發(fā)現(xiàn)在高糖環(huán)境下，玻璃體內會分泌大量的GMFB蛋白，它能將ATPase ATP6V1A從溶酶體中轉移出來，阻止ATPase ATP6V1A的組裝，并使溶酶體堿化。ACSL4蛋白可被CMA受體HSC70識別，并最終在溶酶體中被消化。然而，降解過程的異常會導致其積累，從而促進脂質過氧化，最終誘發(fā)RPE細胞的鐵死亡（圖6E）。

圖6 CMA激活劑QX77或鐵死亡抑制劑LX-1可挽救GMFB誘導的視網膜功能障礙

       為驗證上述機制并探索治療早期DR的新方法，作者建立了一個為期兩周的糖尿病大鼠模型，并在檢測到高血糖的第一天向玻璃體內注射GMFB抗體、溶酶體激活劑NKH477、CMA激活劑QX77或鐵死亡抑制劑LX-1。令人驚訝的是，所有藥物都能顯著恢復視網膜的生理功能，使A波和B波幾乎增加到正常水平（圖7A-B）。此外，在注射藥物組中，RPE-Bruch's膜-絨毛膜復合體（RBCC）中ACSL4的表達以及視網膜中的MDA水平均有所下降（圖7C-D）。注射藥物后，有報道稱在糖尿病視網膜中積累的毒性脂質過氧化物4HNE也減少（圖7E）。
       此外，還通過免疫熒光染色P62和LC3來測量RPE層的自噬通量。包括LX-1在內的所有藥物都顯著減少自噬體的數量，這表明LX-1可能通過類似的途徑抑制鐵死亡（圖7F）。GMFB抗體、NKH477、QX77和LX-1都能有效預防早期糖尿病視網膜病變，保護視網膜的正常功能。

圖7 GMFB抗體、QX77、NKH477和LX-1對DR有保護作用

實驗方法
糖尿病小鼠建模和藥物處理，ELISA，免疫熒光，TUNEL，ERG檢測視網膜功能，細胞培養(yǎng)，透射電鏡，上皮電阻（TEER）測量，RNA測序，CCK8，脂質過氧化MDA實驗，GSH實驗，線粒體膜電位檢測，溶酶體酸度檢測，WB，mRFP-GFP-LC3細胞構建，siRNA基因敲除，質粒轉染和位點突變，RT-qPCR
參考文獻
Liu C, Sun W, Zhu T, Shi S, Zhang J, Wang J, Gao F, Ou Q, Jin C, Li J, Xu JY, Zhang J, Tian H, Xu GT, Lu L. Glia maturation factor-β induces ferroptosis by impairing chaperone-mediated autophagic degradation of ACSL4 in early diabetic retinopathy. Redox Biol. 2022 Jun;52:102292. doi: 10.1016/j.redox.2022.102292. Epub 2022 Mar 18. PMID: 35325805; PMCID: PMC8942824.