腫瘤相關巨噬細胞分泌外泌體LINC01232誘導腫瘤免疫逃逸
腫瘤相關巨噬細胞(TAM)浸潤促進膠質(zhì)瘤惡化，但其機制尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)TAMs分泌外泌體LINC01232誘導腫瘤免疫逃逸。機制上，LINC01232直接結(jié)合E2F2并促進E2F2進入細胞核，兩者協(xié)同促進NBR1的轉(zhuǎn)錄。NBR1通過泛素結(jié)構(gòu)域與泛素化的MHC-I蛋白結(jié)合增加，導致自噬溶酶體中MHC-I的降解增加以及腫瘤細胞表面MHC-I的表達減少，進而導致腫瘤細胞逃避CD8+ CTL的免疫攻擊。該研究于2023年4月發(fā)表在《Advance Science》，IF：15.1。
技術路線
主要研究結(jié)果
1. M2-TAM衍生的外泌體促進膠質(zhì)瘤免疫逃逸
為模擬TAMs，作者將THP1細胞極化為M2-TAMs。細胞共培養(yǎng)實驗表明，與M0-Exos相比，M2-Exos顯著抑制T細胞介導的腫瘤細胞殺傷(圖1a)。流式細胞術和qRT-PCR結(jié)果顯示，與M2-Exos培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細胞共培養(yǎng)后，CD8+ T細胞的增殖能力和IFN-γ、TNF-α、Gzmb的表達均降低(圖1b-e)。建立裸鼠顱內(nèi)原位移植瘤模型：將U-87MG/U-251細胞植入裸鼠腦內(nèi)。12 d后，將小鼠分為兩組，每3 d腫瘤內(nèi)注射M0/M2-Exos。從健康人外周血中分離出活化的CD8+ T細胞，經(jīng)尾靜脈注射。結(jié)果顯示，與注射M0-Exos的小鼠相比，注射M2-Exos的小鼠腫瘤體積顯著增加。動物移植瘤標本中CD8+的IHC分析表明，與M0-Exos組相比，M2-Exos組CD8+的表達顯著降低(圖1f，g)。這些數(shù)據(jù)表明，體外分離的M2-TAMs來源的外泌體顯著促進膠質(zhì)瘤細胞逃避CD8+ CTL細胞介導的抗腫瘤免疫反應。
圖1. M2-TAM衍生的外泌體促進膠質(zhì)瘤免疫逃逸
2. M2-TAMs分泌的LINC01232被轉(zhuǎn)移到膠質(zhì)瘤細胞
使用M0-Exos和M2-Exos組成的lncRNA陣列鑒定TAMs中外泌體相關的lncRNA。層次聚類分析顯示LINC01232是最主要的非編碼RNAs之一(圖2a)。使用透射電子顯微鏡(TEM)、納米顆粒跟蹤分析(NTA)和蛋白質(zhì)印跡法(WB)測量外泌體的形態(tài)、大小和表面標志物，驗證它們存在于TAM培養(yǎng)基中(圖2b)。下一步檢測細胞外LINC01232。在條件培養(yǎng)基(CM)中，單獨用RNase A處理M2-TAMs，LINC01232的水平?jīng)]有變化。然而，經(jīng)RNase A和Triton X-100處理后，CM中的LINC01232水平降低(圖2c)。此外，外泌體與CM中的的LINC01232水平相似(圖2d)。這些結(jié)果證明，外泌體是細胞外LINC01232的主要載體。
此外，通過FISH和亞細胞分割研究LINC01232的亞細胞定位，結(jié)果顯示LINC01232定位于細胞核和細胞質(zhì)，并且主要定位于膠質(zhì)瘤細胞的細胞核(圖2e,f)。隨后，將鬼筆環(huán)肽標記的U-87MG細胞與pkh26標記的M2外泌體孵育。IF結(jié)果顯示，鬼筆環(huán)肽脂質(zhì)染料與PKH26熒光在孵育的U-87MG細胞中共定位，表明外泌體被細胞有效吸收(圖2g)。這些結(jié)果表明，外泌體可以將M2分泌的LINC01232轉(zhuǎn)運到膠質(zhì)瘤細胞。
圖2. M2-TAMs分泌的LINC01232被轉(zhuǎn)移到膠質(zhì)瘤細胞
3. M2-TAM衍生的外泌體LINC01232誘導腫瘤免疫逃逸
使用含有不同siRNAs和兩個shRNAs的慢病毒載體敲低LINC01232基因。在加入外泌體抑制劑Annexin V或敲低LINC01232后，M2-Exos抑制T細胞介導的腫瘤細胞殺傷能力顯著降低(圖3a)。流式細胞術和實時定量PCR結(jié)果顯示，與M2-Exos培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細胞共培養(yǎng)的CD8+ T細胞增殖能力和IFN-γ、TNF-α、Gzmb的表達均降低。然而，在加入外泌體抑制劑Annexin V或敲低LINC01232后，這一現(xiàn)象被逆轉(zhuǎn)(圖3b-e)。
建立裸鼠顱內(nèi)原位移植瘤模型。12 d后，將小鼠分為4組，每3 d腫瘤內(nèi)注射M2- Exos、M2- Exos +Annexin V、M2/sh-NC-Exos和M2/sh-1232#1-Exos。從健康人外周血中分離出活化的CD8+ T細胞，經(jīng)尾靜脈注射。結(jié)果表明，與單純注射M2-Exos或M2/sh-NC-Exos相比，M2-Exos +Annexin V或M2/sh-1232#1-Exos顯著降低腫瘤體積。動物移植瘤標本中CD8+的IHC顯示，與單獨注射M2- Exos或M2/sh-NC-Exos的小鼠相比，M2-Exos +Annexin V或M2/sh-1232#1-Exos組的CD8+表達顯著增加(圖3f，g)。這些實驗結(jié)果表明，M2-Exos衍生的LINC01232誘導腫瘤免疫逃逸。相反，使用AnnexinV處理或敲低LINC01232的外泌體均不能促進這些過程。
圖3. M2-TAM衍生的外泌體LINC01232誘導腫瘤免疫逃逸
4. M2-TAM衍生的LINC01232通過調(diào)節(jié)自噬-溶酶體途徑介導MHC-I的表達
與M0-Exos相比，M2-Exos對膠質(zhì)瘤細胞中MHC-I的mRNA水平和mRNA穩(wěn)定性沒有顯著影響，但卻顯著降低MHC-I的蛋白水平和蛋白穩(wěn)定性(圖4a，b)。使用M0/M2-Exos處理膠質(zhì)瘤細胞，然后同時使用蛋白酶體抑制劑MG132和溶酶體抑制劑leupeptin處理。結(jié)果表明，只有溶酶體抑制劑消除M2-Exos對MHC-I蛋白的抑制作用(圖4c)。正如預期的那樣，在CHX追逐試驗中，MHC-I在過表達(OE) LINC01232的細胞中具有較短的半衰期。同樣，在下調(diào)LINC01232的細胞中，MHC-I的半衰期較長(圖4d，e)。這些數(shù)據(jù)表明，M2-Exos衍生的LINC01232通過調(diào)節(jié)自噬-溶酶體途徑介導膠質(zhì)瘤細胞中MHC-I的表達，從而誘導腫瘤免疫逃逸。
圖4. M2-TAM衍生的LINC01232通過調(diào)節(jié)自噬-溶酶體途徑介導MHC-I的表達
5. LINC01232與E2F2結(jié)合并加速E2F2的核轉(zhuǎn)位
采用RNA pull-down確定與LINC01232相互作用的蛋白E2F2 (圖5a)。RIP檢測結(jié)果表明，LINC01232在E2F2-免疫沉淀復合物中特異性富集(圖5b)。從LINC01232下拉實驗中提取的蛋白質(zhì)表明，E2F2特異性地結(jié)合正義鏈而不是反義鏈(圖5c)。此外，LINC01232可以調(diào)節(jié)E2F2的整體水平和細胞核內(nèi)的水平。在U-87MG陰性對照細胞中，E2F2主要定位于細胞質(zhì)，少量定位于細胞核。在敲低LINC01232細胞的細胞核中幾乎檢測不到E2F2。相比之下，在過表達LINC01232細胞的細胞核中有相當水平的E2F2(圖5d)。與核裂解液相比，U-87MG細胞質(zhì)裂解液中E2F2蛋白表達最多。沉默LINC01232后，U-87MG細胞中E2F2在細胞核和細胞質(zhì)中的數(shù)量明顯減少，然而，異位表達LINC01232后，細胞核相關的E2F2含量增加，與IF結(jié)果一致(圖5e)。co-IP測試LINC01232是否可以介導E2F2和NBR1的相互結(jié)合。正如預期的那樣，過表達LINC01232增強這種結(jié)合，而敲低則減弱這種結(jié)合(圖5f)。這些結(jié)果表明LINC01232與E2F2結(jié)合并促進其轉(zhuǎn)運到細胞核中。
圖5. LINC01232與E2F2結(jié)合并加速E2F2的核轉(zhuǎn)位
6. LINC01232促進E2F2介導的NBR1轉(zhuǎn)錄
使用JASPAR數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)E2F2可能與NBR1啟動子區(qū)域結(jié)合。構(gòu)建由野生型(WT)或突變型(mut) NBR1啟動子組成的熒光素酶載體，轉(zhuǎn)染U-87MG和U-251細胞(圖6a)。熒光素酶實驗表明，過表達E2F2刺激野生型NBR1啟動子的活性，表現(xiàn)為熒光素酶活性的增加，但過表達對mut型NBR1啟動子活性無影響。此外，LINC01232增強E2F2誘導的熒光素酶活性的增加(圖6b)。ChIP實驗結(jié)果顯示E2F2與NBR1啟動子結(jié)合，并且這種相互作用被LINC01232增強(圖6c)。此外，增強E2F2表達顯著上調(diào)NBR1 mRNA和蛋白水平，LINC01232進一步促進NBR1 mRNA和蛋白水平(圖6d)。這些結(jié)果表明，E2F2直接結(jié)合到NBR1的啟動子區(qū)域激活其轉(zhuǎn)錄，而LINC01232促進這一過程。
圖6. LINC01232促進E2F2介導的NBR1轉(zhuǎn)錄
7. LINC01232通過調(diào)節(jié)NBR1促進神經(jīng)膠質(zhì)瘤免疫逃逸
在膠質(zhì)瘤細胞株U-87MG和U-251中敲低NBR1，同時過表達LINC01232。細胞共培養(yǎng)結(jié)果顯示，與vector相比，LINC01232-OE/U-87MG/U251細胞顯著抑制T細胞介導的腫瘤細胞殺傷。然而，敲低NBR1過表達LINC01232可以逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象(圖7a)。流式細胞術和實時定量PCR結(jié)果顯示，與LINC01232-OE膠質(zhì)瘤細胞共培養(yǎng)的CD8+ T細胞增殖能力和IFN-γ、TNF-α、Gzmb的表達均較低;然而，敲低NBR1同時過表達LINC01232可以逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象(圖7b - e)。建立裸鼠顱內(nèi)原位移植瘤模型:Vector/LINC01232-OE/LINC01232-OE+NBR1-KD U-87MG/U-251細胞原位移植入小鼠腦內(nèi)。12 d后，從健康人外周血中分離出活化的CD8+ T細胞經(jīng)尾靜脈注射。結(jié)果顯示，與注射vector的小鼠相比，LINC01232-OE組小鼠腫瘤體積顯著增加。動物移植瘤標本中CD8+的免疫組化結(jié)果顯示，與vector組小鼠相比，LINC01232-OE組小鼠CD8+的表達明顯降低。敲低NBR1同時過表達LINC01232可以逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象(圖7f，g)。這些結(jié)果進一步說明LINC01232通過調(diào)節(jié)NBR1促進膠質(zhì)瘤免疫逃逸。
圖7. LINC01232通過調(diào)節(jié)NBR1促進神經(jīng)膠質(zhì)瘤免疫逃逸
8. LINC01232/E2F2/NBR1/MHC-I軸與臨床進展的相關性
比較正常腦組織(NBT)、低級別膠質(zhì)瘤組織(LGG)、高級別膠質(zhì)瘤組織(HGG)中LINC01232/E2F2/NBR1/MHC-I的表達水平。與NBT相比，LINC01232/E2F2/NBR1在腫瘤組織中表達水平較高，尤其是在HGG中。然而，MHC-I的表達呈現(xiàn)相反的趨勢(圖8a-d)。此外，LINC01232/E2F2/NBR1信號軸成員之間的表達水平成正比。然而，MHC-I的表達與LINC01232/E2F2/NBR1的表達成反比(圖8e-i)。此外，F(xiàn)ISH、IF和IHC結(jié)果顯示，LINC01232水平與E2F2/NBR1信號通路呈正相關。然而，MHC-I與LINC01232/E2F2/NBR1的表達成反比(圖8j)。以上數(shù)據(jù)表明，LINC01232/E2F2/NBR1軸可以通過自噬-溶酶體途徑調(diào)節(jié)MHC-I的表達。
圖8. LINC01232/E2F2/NBR1/MHC-I軸與臨床進展的相關性
結(jié)論
綜上所述，本研究揭示了TAMs與膠質(zhì)瘤之間存在關鍵的分子交流，即TAMs分泌富含LINC01232的外泌體進入腫瘤細胞，通過LINC01232/E2F2/NBR1/MHC-I軸支持惡性腫瘤的生長，誘導腫瘤免疫逃逸，表明靶向該軸可能具有治療潛力。
實驗方法
細胞培養(yǎng)，質(zhì)粒和siRNA轉(zhuǎn)染，WB，qRT-PCR，生信分析，外泌體的分離與鑒定，ChIP，雙熒光素酶報告實驗，亞細胞分離分析，F(xiàn)ISH，免疫熒光，免疫組化，免疫共沉淀，鄰位連接技術（PLA），RNA pull-down，RIP，腦異種原位移植。
參考文獻
Li J, Wang K, Yang C, Zhu K, Jiang C, Wang M, Zhou Z, Tang N, Wang Q, Wang S, Shu P, Yuan H, Xiong Z, Li J, Liang T, Rao J, Wang X, Jiang X. Tumor-Associated Macrophage-Derived Exosomal LINC01232 Induces the Immune Escape in Glioma by Decreasing Surface MHC-I Expression. Adv Sci (Weinh). 2023 Jun;10(17):e2207067. doi: 10.1002/advs.202207067. Epub 2023 Apr 25. PMID: 37097629; PMCID: PMC10265094.