心肌梗死后心功能障礙竟然有“乳酸化”的影子

背景
       心肌梗死(MI)是由心臟或冠狀動脈持續(xù)缺血引起的常見表現(xiàn)，并與高死亡率相關。心肌纖維化是病理性細胞外基質重塑和成纖維細胞活化的過程，是包括心肌梗死在內的大多數(shù)心臟損傷不可避免的事件。乳酸已被證明可誘導肌成纖維細胞分化并促進肺纖維化。研究發(fā)現(xiàn)糖酵解衍生的乳酸通過在組蛋白賴氨酸(K)殘基上添加乳酸基直接改變組蛋白，這一過程被稱為“乳酸化”，最終影響基因轉錄。然而，乳酸是否會誘導心肌缺血損傷后的乳酸化和心肌纖維化尚不清楚。
       內皮向間充質轉化(EndoMT)是內皮細胞經(jīng)歷的一個過程，在這個過程中，一系列細胞和分子的變化導致間充質細胞(如肌成纖維細胞)表型的改變。心肌梗死后的心臟缺氧會促進EndoMT，從而導致心臟纖維化，從而導致心功能障礙。
       在這里，作者觀察到乳酸水平的增加通過誘導心肌EndoMT而強烈地增強心肌纖維化和心功能障礙。在體外，作者發(fā)現(xiàn)乳酸促進缺氧誘導的內皮細胞EndoMT和TGF-β/ Smad2信號的激活。在機制上，作者證明了乳酸在缺氧/心肌梗死后上調Snail1核易位和乳酸化。抑制Snail1可改善心肌梗死后乳酸誘導的心功能障礙，抑制乳酸刺激的EndoMT、Snail1的乳酸化和TGF-β/Smad2信號的激活。這些發(fā)現(xiàn)增強了作者對乳酸鹽在心肌梗死后EndoMT中的作用的理解，并將成為開發(fā)改善心肌梗死后心臟重塑和功能的創(chuàng)新療法的基礎。本文于2023年2月發(fā)表于《SCIENCE ADVANCES》，IF=13.6。

技術路線

結果

1.減少乳酸可改善心肌梗死后的心功能和心肌纖維化

       臨床研究表明，高乳酸水平在心力衰竭患者中普遍存在，并與心力衰竭的死亡率相關。在本研究中，作者研究了心肌梗死是否會增加循環(huán)乳酸水平。如圖1 (A至F)所示，術后7天，心肌梗死顯著提高血清和心臟乳酸水平，同時心功能下降。為了確定乳酸的減少是否會改善心肌梗死后心功能障礙和心肌纖維化過程，作者通過腹腔注射糖酵解抑制劑2-脫氧-d -葡萄糖(2-DG)來降低乳酸水平。2 dg抑制血清和心肌乳酸水平引起的心肌梗死(圖1 A和B),感興趣的射血分數(shù)(EF %)和部分縮短(FS %) 2 dg MI老鼠的水平高于汽車MI老鼠(圖1C和D)。左心室舒張末期容積(LVEDV)、左室收縮末期容積(LVESV)值比汽車低2 dg MI小鼠心肌梗死小鼠(圖1,E和F),表明抑制乳酸生產(chǎn)改善心肌梗死后心臟功能。此外,馬森三色染色顯示，2-DG給藥導致心肌梗死后心肌纖維化減少(圖1G)。這些數(shù)據(jù)表明乳酸生成增加可能參與了MI誘導的纖維化和心功能障礙。

圖1. 心肌梗死后乳酸水平升高導致心功能障礙加重和心肌纖維化增加

2.心肌梗死后乳酸生成增加，加重心功能障礙和心肌纖維化

       為了證實乳酸在心肌梗死后心功能障礙和纖維化中的作用，作者在心肌梗死誘導后3小時給小鼠補充乳酸，并在心肌梗死后1周和4周用超聲心動圖評估心功能。圖1H顯示，腹腔注射乳酸(0.5 g/kg體重)7天后血清乳酸濃度恢復到正常水平。因此，乳酸鹽每7天腹腔注射一次。與假手術組相比，心肌梗死顯著下調了EF%和FS%的值(圖1、I和J)。作者觀察到，與心肌梗死組相比，乳酸治療進一步降低了EF%(7天下降14.0%，28天下降19.5%)和FS%(7天下降15.8%，28天下降21.6%)的值(圖1I和J)。與此同時，乳酸治療增加了心肌梗死后LVEDV和LVESV的水平(圖1I和J)。作者還使用滲透性微型泵來持續(xù)維持小鼠血清乳酸水平的穩(wěn)定。乳酸水平的升高顯著下調了心肌梗死后EF%和FS%的水平(圖B和C)，上調了LVEDV和LVESV的值(圖D和E)。馬松三色染色證明，乳酸給藥可顯著誘導心肌梗死小鼠的心臟纖維化(圖1M)。

3.抑制乳酸生成可減弱心肌梗死后心肌EndoMT

       EndoMT是內皮細胞失去其內皮特性并向成纖維細胞樣表型過渡的過程，在心肌梗死后的心臟纖維化中起關鍵作用。為了研究乳酸如何增加心肌梗死后心肌纖維化，作者接下來評估了乳酸與心肌梗死后心肌EndoMT之間是否存在關聯(lián)。心肌梗死誘導內皮標記物CD31和VE-cadherin表達(圖2A)以及間充質標記物成纖維細胞特異性蛋白1 (FSP1)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和膠原1a1表達(圖2A)顯著增加。然而，通過給藥2-DG抑制乳酸生成可提高CD31和VE-cadherin的表達，同時消除心肌梗死誘導的膠原1a1、α-SMA和FSP1的增加(圖2A)。與此一致，2-DG處理上調內皮標志物Cdh5和Kdr的mRNA水平(圖2B)。相反，2-DG下調了間充質標志物Atca2、Col1a1、Fn1和S100a4 mRNA的表達(圖2B)。為了證實作者的觀察，作者在內皮細胞特異性綠色熒光蛋白(GFP)標記的小鼠(TIE2GFP)中添加或不添加2-DG誘導心肌梗死，并在心臟組織中使用抗GFP(綠色)和抗fsp1(紅色)抗體進行免疫熒光染色。如圖2C所示，與假對照組相比，MI誘導GFP與FSP1共定位。相反，2-DG對乳酸生成的抑制減弱了MI誘導的GFP和FSP1之間的共定位，表明2-DG減少了MI刺激的心肌EndoMT。此外，在心肌梗死或假手術后7天，作者從收獲的心臟中分離內皮細胞，并通過流式細胞術檢測內皮細胞分化為肌成纖維細胞的百分比。如圖2D所示，從假對照小鼠分離的內皮細胞顯示，大多數(shù)GFP細胞被抗cd31和抗cd114(內皮細胞標記物)抗體染色。Gp38是一個被廣泛接受的心臟成纖維細胞群體標記。圖2E顯示，假對照心臟內皮細胞中幾乎沒有檢測到Gp38染色。然而，心肌梗死顯著提高了gfp標記的內皮細胞中gp38陽性染色細胞的數(shù)量和百分比。相反，2-DG處理抑制了MI誘導的gp38陽性內皮細胞如圖2D所示，從假對照小鼠分離的內皮細胞顯示，大多數(shù)GFP細胞被抗cd31和抗cd114(內皮細胞標記物)抗體染色。Gp38是一個被廣泛接受的心臟成纖維細胞群體標記。圖2E顯示，假對照心臟內皮細胞中幾乎沒有檢測到Gp38染色。然而，心肌梗死顯著提高了gfp標記的內皮細胞中gp38陽性染色細胞的數(shù)量和百分比。相反，2-DG處理抑制了MI誘導的gp38陽性內皮細胞。

圖2. 2-DG可減弱mi誘導的EndoMT

4.高水平的乳酸促進心肌梗死后心肌的EndoMT

       然后，作者研究了補充乳酸是否能促進心肌梗死后EndoMT的轉變。Western blot顯示，與心肌梗死組相比，補充乳酸降低了心肌梗死小鼠內皮細胞標志物(CD31和VE-cadherin)的水平，并促進了間充質標志物(FSP1、α-SMA和Collagen1a1)的表達(圖3A)。定量實時聚合酶鏈反應(qRT-PCR)一致顯示，乳酸水平升高導致心肌梗死后Cdh5和Kdr mRNA水平降低(圖3B和C)，并誘導Col1a1、Fn1和S100a4 mRNA水平(圖3、D至F)，表明乳酸誘導心肌梗死后EndoMT。接下來，TIE2GFP小鼠接受心肌梗死或假手術，然后給藥乳酸?？笹FP(綠色)和抗FSP1(紅色)抗體的免疫熒光染色顯示，與假小鼠相比，心肌梗死誘導了GFP和FSP1的共定位(圖3G)。具有重要意義的是，乳酸處理導致心肌梗死后GFP和FSP1的共定位明顯增加(圖3G)，表明乳酸處理后內皮細胞分化為成纖維細胞的數(shù)量增加。同樣，流式細胞術顯示，乳酸處理進一步上調心肌梗死后GFP+gp38+細胞的數(shù)量(圖3H)，表明乳酸促進心肌梗死后的EndoMT。為了進一步闡明乳酸在心肌梗死后EndoMT中的作用，作者從心肌梗死或假手術小鼠心臟組織中分離內皮細胞。如圖5a所示，心肌梗死可促進心臟內皮細胞中膠原1a1、α-SMA和FSP1的表達。乳酸處理進一步刺激心肌梗死后這些間充質標志物的表達。相反，2-DG強烈阻斷心肌梗死誘導的膠原1a1、α-SMA和FSP1的表達。

圖3. 補充乳酸可促進心肌梗死后的EndoMT

5.乳酸刺激內皮細胞遷移，降低VE-cadherin表達，促進缺氧后的EndoMT

       為了確定乳酸促進EndoMT過程的機制，作者使用缺氧刺激的內皮細胞進行了體外實驗。眾所周知，內皮細胞的遷移和增殖與EndoMT過程有關。因此，作者進行了傷口愈合試驗和5-乙基-2-脫氧尿苷(EdU)摻入試驗，以觀察乳酸是否會改變內皮細胞的遷移和增殖。圖4A顯示，與正常缺氧對照組相比，缺氧加速了內皮細胞的遷移。此外，在10 mM而不是5 mM處施用乳酸顯著增強了缺氧誘導的傷口愈合(圖4A)，表明乳酸誘導內皮細胞在缺氧刺激后遷移。同樣，EdU摻入實驗顯示乳酸可以促進缺氧刺激的內皮細胞增殖(圖4B)。接下來，作者檢測了遷移細胞中ve -鈣粘蛋白的水平，以揭示乳酸是否會在缺氧后刺激內皮細胞遷移后改變其表型。VE-cadherin免疫熒光染色顯示，缺氧72小時后VE-cadherin的完整性受到抑制(圖4D)。缺氧后，用10 mM乳酸處理進一步破壞內皮細胞表面ve -鈣粘蛋白的完整性(圖4D)。此外，Western blot和qRT-PCR分析也顯示乳酸處理顯著降低了VE-cadherin的水平與低氧組相比(圖4C和圖5C)，表明乳酸可能改變低氧條件下內皮細胞的表型。為了說明乳酸是否可以誘導缺氧后內皮細胞的EndoMT，作者用乳酸處理內皮細胞，并檢測缺氧后EndoMT的標志物。如圖5A所示，缺氧72小時后內皮細胞形態(tài)由典型形態(tài)變?yōu)榧氶L的紡錘形。與低氧對照相比，乳酸處理導致了更大的細胞形態(tài)變化。此外，細長的細胞FSP1染色呈陽性，CD31染色呈陰性(圖5B)。圖5C顯示，低氧刺激后，乳酸降低VE-cadherin表達，誘導α-SMA表達。為了研究乳酸促進的EndoMT是否會誘導內皮細胞功能障礙，作者進行了一項基于matrigel的內皮細胞血管生成實驗，發(fā)現(xiàn)乳酸可以抑制缺氧誘導的管形成(圖5D)。此外，通過膠原凝膠收縮實驗，作者證實乳酸處理的內皮細胞在缺氧刺激后表現(xiàn)出間充質樣功能，膠原凝膠大小減小，收縮性增加(圖5E)。這些數(shù)據(jù)表明，乳酸誘導缺氧后的EndoMT。

圖4. 乳酸誘導內皮細胞遷移，降低缺氧后VE-cadherin的表達

圖5. 乳酸促進缺氧后內皮細胞的EndoMT

6.乳酸激活缺氧后TGF-β/Smad2信號

       為了確定乳酸誘導缺氧后EndoMT的機制，作者評估了TGF-β和Smad2/3的表達，這兩個已知參與調節(jié)EndoMT。在體內，qRT-PCR顯示，乳酸顯著加速心肌梗死后Tgfb1和Smad2 mRNA的表達(圖6A和B)，但未改變Smad3 mRNA的表達水平(圖6C)。此外，
       2-DG抑制乳酸生成減輕了MI誘導的Tgfb1和Smad2 mRNA的表達(圖6D和E)。體外研究還顯示，乳酸促進了缺氧刺激下的人臍帶內皮細胞(HUVECs)和HCMECs中Tgfb1和Smad2 mRNA的表達(圖6F和G)。與基因表達水平一致，乳酸處理上調Smad2的磷酸化和TGF-β的表達，但不影響缺氧刺激后Smad3的磷酸化(圖6H)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明乳酸誘導的TGF-β/Smad2激活可能有助于缺氧后的EndoMT。

圖6. 乳酸刺激心肌梗死/缺氧后TGF-β/Smad2信號傳導

7.細胞內乳酸抑制減弱缺氧誘導的EndoMT

       單羧酸轉運蛋白(mct)是跨質膜轉運乳酸的雙向轉運蛋白。通過在給藥前使用MCT抑制劑α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHC)，作者觀察到CHC降低了乳酸處理誘導的細胞內乳酸水平(圖7A)，表明細胞外乳酸通過MCT轉運到內皮細胞中。此外，給藥CHC改善了缺氧后乳酸促進的內皮細胞遷移(圖7B)。免疫熒光染色顯示，CHC阻止乳酸處理降低VE-cadherin表達(圖7C)，而成管實驗顯示，CHC促進缺氧后血管生成(圖7D)。此外，CHC減輕了乳酸誘導的內皮標志物PECAM1、CDH5和KDR mRNA水平的下降(圖7,E至G)以及間質標志物ACTA2、FN1和COL1A1 mRNA水平的升高(圖7,H至J)。伴隨著這些變化，CHC治療也抑制了乳酸誘導的TGFB1和SMAD2 mRNA的表達(圖7,K和L)?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)表明細胞外乳酸促進的EndoMT是由mct依賴機制介導的。

圖7. 抑制細胞內乳酸可減弱缺氧誘導的EndoMT

8.乳酸促進缺氧后Snail1核易位

       Snail1是TGF-β的轉錄因子，在調節(jié)上皮-間質轉化(epithelial-to-mesenchymal transition, EndoMT)中起重要作用。接下來，作者通過TGF-β/ smad2依賴性信號通路研究了Snail1在乳酸誘導的EndoMT中的作用。如圖8A所示，單獨缺氧不會改變Snail1的細胞質表達。而低氧條件下Snail1核表達明顯加快。乳酸處理進一步上調Snail1的核易位。因此，免疫熒光染色顯示，低氧刺激后Snail1核染色更加陽性，乳酸可進一步誘導低氧刺激(圖8B)，表明Snail1核易位可能在乳酸促進的EndoMT中發(fā)揮重要作用。然后，作者探討了Snail1核易位的增加是否與乳酸激活的TGF-β信號傳導有關。作者使用抗snail1抗體進行染色質免疫沉淀(ChIP)實驗，并檢測TGFB1基因是否可以在抗snail1抗體的免疫沉淀中檢測到。圖8C顯示，在缺氧挑戰(zhàn)的細胞中，具有TGFB1基因的Snail1大量募集。然而TGFB1基因與Snail1蛋白之間的相互作用在乳酸處理的缺氧挑戰(zhàn)細胞中明顯大于缺氧細胞(圖8C)。這些數(shù)據(jù)表明，乳酸促進Snail1蛋白和TGFB1基因相互作用，從而促進TGF-β/ smad2介導的EndoMT。

圖8. 乳酸促進缺氧后Snail1核易位和乳酸化

9.缺氧后乳酸誘導Snail1乳酸化

       表觀遺傳學在TGF-β相關的EndoMT中起重要作用。最近的一項研究表明，乳酸可以通過在組蛋白賴氨酸(K)殘基上添加一個乳酸基來誘導乳酸化過程，從而調節(jié)基因轉錄。用抗Snail1抗體免疫沉淀，再用抗泛乙酰賴氨酸(Kac)或抗泛乙酰賴氨酸(Kla)抗體免疫印跡顯示，缺氧誘導Snail1乙?；腿樗峄Ｈ樗徇M一步上調Snail1乙?；腿樗峄?圖8D)。先前的研究發(fā)現(xiàn)，Snail能夠與CREB(腺苷3 '，5 ' -單磷酸反應元件結合蛋白)-結合蛋白(CBP)/p300相互作用，誘導其乙?；?。作者觀察到Snail1和CBP/p300之間存在相互作用，并且乳酸處理促進了它們在缺氧后的相互作用(圖8D)。然而，CHC對細胞內乳酸的抑制減弱了乳酸促進的Snail1與CBP/p300之間的相互作用，以及Snail1的乙?；腿樗峄?圖8E)。相反，與缺氧組相比，乳酸處理也顯著增加了Snail1在含有抗cbp抗體、抗p300抗體、抗pan- kla抗體和抗pan- kac抗體的免疫沉淀中的表達(圖8F)。相反，CHC降低了Snail1與CBP/p300之間的相互作用，以及Snail1的乙酰化和乳酸化(圖8F)。

10.Snail1沉默可減弱缺氧后EndoMT和TGF-β/Smad2的激活

       此外，作者揭示了乳酸是否通過Snail1激活促進EndoMT和TGF-β/Smad2的激活。
       通過轉染Snail1的特異性siRNA使其沉默，逆轉了乳酸在缺氧后誘導的CD31和VE-cadherin的下調(圖9A)。相反，Snail1抑制可阻止乳酸加速間充質標志物α-SMA和FSP1表達(圖9A)、SMAD2磷酸化和TGF-β激活(圖9H)。作者還進行了qRT-PCR，觀察到在乳酸處理下，Snail1的敲低提高了PECAM1、KDR和CDH5的mRNA水平(圖9B至D)，降低了ACTA2、COL1A1和S100A4的mRNA水平(圖9E至G)。此外，沉默Snail1也減弱了乳酸誘導的SMAD2和TGFB1 mRNA水平(圖9I和J)。

圖9. Snail1的沉默會減弱缺氧后EndoMT和TGF-β/Smad2的激活

11.Snail1沉默可改善心肌梗死后的心功能，降低心肌梗死后的EndoMT

       為了闡明Snail1在體內是否在EndoMT中發(fā)揮作用，作者評估了心肌梗死后Snail1的乳酸化。如圖10 (A和B)所示，與假手術組相比，心肌梗死顯著促進了Snail1的乳酸化和乙酰化，以及Snail1與CBP/p300之間的相互作用。乳酸給藥進一步誘導它們相互作用(圖10A)。然而，2-DG處理減弱了MI誘導的Snail1與CBP或p300之間的相互作用，并降低了Snail1的乙?；腿樗峄?圖10B)。然后，作者轉染Snail1特異性siRNA，敲低Snail1在心肌中的表達，并研究其是否能改善心功能。免疫印跡和siSnai1 immunofluorescent染色證實,政府會明顯降低Snail1表達心中(圖10C和D)。手術后7天,
       作者觀察到擊倒Snail1沒有對心臟功能的影響,EndoMT虛假的老鼠(無花果。S10, I)。然而,Snail1沉默逆轉lactate-decreased EF %和FS %的水平(圖10E和F)和阻止LVEDV LVESV乳酸水平引起的心肌梗死后(圖10 G和H),這表明缺乏Snail1可以改善乳酸促進的心功能障礙。此外，與心肌梗死后的乳酸處理相比，Snail1沉默提高了Cdh5和Kdr mRNA的表達(圖10I和J)，降低了Acta2, Fn1和S100a4 mRNA的表達(圖10,K至M)，這表明Snail1可能有助于心肌梗死后乳酸誘導的EndoMT?？傊髡叩臄?shù)據(jù)表明Snail1通過激活TGF-β/Smad2信號在乳酸促進的EndoMT中發(fā)揮重要作用(圖10N)。

圖10. Snail1的沉默會減弱心肌梗死后Snail1的乳酸化和EndoMT

       總之，作者的研究揭示了之前未被認識到的乳酸在心肌梗死/缺氧后促進EndoMT的作用。乳酸誘導Snail1的乳酸化和核易位，從而通過激活TGF-β/Smad2信號通路調節(jié)EndoMT。這一發(fā)現(xiàn)提供了以前未知的見解，即乳酸發(fā)揮重要的生物學功能，有助于心肌纖維化的增加和心功能障礙的惡化。

實驗方法
心梗模型的誘導、超聲心動圖、細胞轉染、Masson三色染色法、2,3,5-氯化三苯基四氮唑染色、凋亡實驗、乳酸測定、流式細胞術、細胞遷移實驗、增殖實驗、血管生成實驗、膠原凝膠收縮試驗、免疫熒光染色、WB、RT-PCR、免疫沉淀反應、ChIP-qPCR
參考文獻
Fan M, Yang K, Wang X, Chen L, Gill PS, Ha T, Liu L, Lewis NH, Williams DL, Li C. Lactate promotes endothelial-to-mesenchymal transition via Snail1 lactylation after myocardial infarction. Sci Adv. 2023 Feb 3;9(5):eadc9465. doi: 10.1126/sciadv.adc9465. Epub 2023 Feb 3. PMID: 36735787; PMCID: PMC9897666.