一把鐵做的雙刃劍——在壓力應(yīng)激中的隨機(jī)應(yīng)變

       鐵是造血和各種關(guān)鍵細(xì)胞功能所必需的礦物質(zhì)。在許多疾病和失調(diào)癥中，人們越來越多地觀察到鐵代謝的改變，但對鐵代謝受損對細(xì)胞的影響仍缺乏全面的機(jī)理認(rèn)識。本文中，作者研究鐵過載或缺鐵對細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)和自噬的影響，它們可調(diào)控細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和存活。研究結(jié)果顯示急性鐵負(fù)荷導(dǎo)致線粒體ROS（mtROS）的產(chǎn)生和損傷增加、脂質(zhì)過氧化、自噬通量受損和鐵死亡。鐵誘導(dǎo)的mROS過度產(chǎn)生是脂質(zhì)過氧化增加、自噬功能受損和誘導(dǎo)鐵死亡的機(jī)制。鐵過量誘導(dǎo)的鐵死亡依賴于細(xì)胞類型，并受激活轉(zhuǎn)錄因子4（ATF4）的調(diào)控。上調(diào)ATF4可減輕鐵誘導(dǎo)的自噬功能障礙和鐵死亡，而沉默ATF4表達(dá)則會損害自噬功能，導(dǎo)致mtROS生成增加和鐵死亡。利用自噬缺陷的肝細(xì)胞和不同的自噬抑制劑，發(fā)現(xiàn)自噬損傷使細(xì)胞對鐵誘導(dǎo)的鐵死亡更敏感。相反，缺鐵會激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）應(yīng)激反應(yīng)，減少自噬并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。缺鐵相關(guān)的自噬減少是由于ER應(yīng)激，表現(xiàn)為使用4-PBA降低ER應(yīng)激反應(yīng)可改善自噬通量。缺鐵導(dǎo)致自噬減少的機(jī)制是由于溶酶體膜蛋白翻譯后成熟受損導(dǎo)致溶酶體生物發(fā)生紊亂?？傊F過量和缺鐵失會導(dǎo)致不同形式的細(xì)胞應(yīng)激和死亡，部分是通過自噬功能受損這一共同機(jī)制造成的。本文于2022年7月發(fā)表在《Redox Biology》IF:11.8期刊上。

技術(shù)路線

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
1、過量的鐵誘導(dǎo)氧化反應(yīng)和自噬的變化但不影響ER應(yīng)激蛋白
       由于細(xì)胞對鐵含量改變的反應(yīng)不同，作者確定了鐵過量對多種細(xì)胞類型的影響，包括人肝癌細(xì)胞系HepG2、非轉(zhuǎn)化的小鼠肝細(xì)胞系A(chǔ)ML12和小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7，以及原代細(xì)胞P-Hepa和人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞HAECs（圖1）。之所以選擇這些細(xì)胞類型，是因?yàn)楦渭?xì)胞和巨噬細(xì)胞在鐵的儲存和再循環(huán)中起著關(guān)鍵作用，血管內(nèi)皮細(xì)胞是鐵超載介導(dǎo)損傷的主要靶點(diǎn)之一。
       所有的細(xì)胞都顯示NRF2表達(dá)升高以響應(yīng)FAC鐵過載誘導(dǎo)，與HepG2和RAW264.7細(xì)胞相比，AML12細(xì)胞對NRF2的誘導(dǎo)更為急性和強(qiáng)烈（圖1A）。ATF4在AML12和RAW264.7細(xì)胞中的誘導(dǎo)作用明顯大于HepG2細(xì)胞（圖1A）。HepG2和AML12細(xì)胞中沒有誘導(dǎo)包括CHOP、Grp78和P-PERK在內(nèi)的ER應(yīng)激標(biāo)志物，只有RAW264.7細(xì)胞中CHOP表達(dá)增加，總體上表明過量鐵不誘導(dǎo)ER應(yīng)激（圖1A）。HepG2細(xì)胞中LC3B-II、活性亞型和p62的表達(dá)增加，相反，在AML12和RAW264.7細(xì)胞中LC3B的表達(dá)無明顯改變（圖1A）。盡管在AML12細(xì)胞中，F(xiàn)TH1在較早的時(shí)間點(diǎn)被強(qiáng)烈誘導(dǎo)，但細(xì)胞環(huán)境依賴性的自噬調(diào)節(jié)并不是由于基于FTH1誘導(dǎo)的鐵負(fù)荷的大小（圖1A）。在原代培養(yǎng)細(xì)胞HAECs和P-Hepa中進(jìn)一步檢測過量鐵對NRF2、ATF4和自噬因子表達(dá)的影響。兩種細(xì)胞類型NRF2、p62和LC3B-II的表達(dá)均增加，但ATF4的表達(dá)未增加（圖1B）。與細(xì)胞系相比，鐵負(fù)荷對原代細(xì)胞中自噬標(biāo)志物L(fēng)C3B-II和p62的影響更強(qiáng)。通過使用FeDex處理WT小鼠，在肝臟（過量鐵沉積的主要部位）中測定了急性鐵負(fù)荷對氧化和自噬標(biāo)志物表達(dá)的體內(nèi)影響。FeDex注射顯著增加FTH1的表達(dá)，同樣，NRF2、LC3B和p62的表達(dá)顯著增加，但ATF4的表達(dá)沒有變化（圖1C）。總之，結(jié)果表明，急性鐵超載會誘導(dǎo)氧化反應(yīng)和自噬蛋白表達(dá)的改變，但不會引起ER應(yīng)激反應(yīng)。

圖1 過量的鐵誘導(dǎo)應(yīng)激和自噬蛋白的差異表達(dá)

2、鐵過量引起自噬通量的損害，從而增強(qiáng)鐵凋亡
       LC3B-II表達(dá)升高可提示自噬刺激或自噬通量受損。通過使用自噬抑制劑BafA1或Chlq，確定P-Hepa、HepG2細(xì)胞和HAECs中LC3B-II表達(dá)的增加是否是自噬通量降低的結(jié)果。FAC誘導(dǎo)P-Hepa中p62和LC3B-II的表達(dá)在8 h和24 h時(shí)間點(diǎn)均顯著增加；與BafA1單獨(dú)處理相比，F(xiàn)AC/BafA1共處理并未進(jìn)一步增加p62或LC3B-II水平（圖2A）。FAC處理誘導(dǎo)P-Hepa中LC3B陽性點(diǎn)狀細(xì)胞大量聚集；一些鐵處理的P-Hepa顯示強(qiáng)而彌漫性的LC3B染色(箭頭)貫穿整個(gè)細(xì)胞質(zhì)以及細(xì)胞核的收縮；高倍鏡下，這些細(xì)胞含有大空泡，完整性完全喪失（圖2B），表明細(xì)胞死亡。重要的是，鐵誘導(dǎo)的LC3B-II積累可被Fer-1阻斷（圖2C）。這些結(jié)果表明，過量的鐵誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化依賴性鐵死亡，而清除脂質(zhì)過氧化物可挽救鐵誘導(dǎo)的自噬流抑制。

圖2鐵過量誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化依賴性自噬損傷

       鑒于過量的鐵只在自噬功能障礙的細(xì)胞中誘導(dǎo)鐵死亡，而自噬在清除氧化分子和受損細(xì)胞器方面起著關(guān)鍵作用，所有作者利用P-Hepa 細(xì)胞模型想知道自噬功能受損是否是鐵過量誘導(dǎo)鐵死亡的原因。與單獨(dú)使用FAC相比，F(xiàn)AC/Chlq共處理導(dǎo)致PI+細(xì)胞的百分比增加約3.7倍（圖3A）。同樣，與單獨(dú)使用FAC相比，F(xiàn)AC和自噬抑制劑E64d/epstatin A共處理導(dǎo)致PI陽性細(xì)胞的百分比增加2.6倍（圖3B）。沒有利用BafA1來確定鐵誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，因?yàn)樗ㄟ^提高核內(nèi)體和溶酶體的pH值來干擾細(xì)胞內(nèi)鐵的活動。用4-OHT處理P-Hepa敲除Atg5（ATG5^Δhep）（圖3C）。與上述自噬通量受損的情況相一致，自噬缺陷也增強(qiáng)FAC誘導(dǎo)的鐵死亡，表現(xiàn)為ATG5^Δhep細(xì)胞中PI陽性細(xì)胞的死亡率高于對照細(xì)胞（圖3D）。這些發(fā)現(xiàn)表明，至少在鐵過量的情況下，自噬功能障礙會增強(qiáng)鐵死亡。

圖3 受損的自噬增強(qiáng)鐵誘導(dǎo)的鐵死亡

3、鐵誘導(dǎo)的mtROS產(chǎn)生是脂質(zhì)過氧化依賴性鐵死亡的基礎(chǔ)
       鐵催化的ROS破壞細(xì)胞器。TEM成像顯示，經(jīng)FAC處理的P-Hepa細(xì)胞的線粒體破裂，嵴（箭頭）缺失，這是鐵死亡的一個(gè)重要特征（圖4A）。作者推測鐵在線粒體中的負(fù)載催化了介導(dǎo)線粒體損傷的mtROS的產(chǎn)生。為探討這種可能性，用Mito-FerroGreen染色Fe²⁺，并用MitoSOX檢測mtROS。在FAC處理6小時(shí)后，觀察到線粒體Fe²⁺和ROS的強(qiáng)烈疊加（圖4B）。通過使用熒光探針JC-1檢測發(fā)現(xiàn)FAC處理導(dǎo)致MMP減少，紅色熒光強(qiáng)度明顯降低（圖4C）。這些發(fā)現(xiàn)表明，線粒體中的急性鐵負(fù)荷會導(dǎo)致mtROS生成過多和MMP 損失，從而導(dǎo)致線粒體損傷。

圖4鐵離子被裝載在線粒體中，誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生、MMP的丟失和線粒體損傷

       上述研究結(jié)果表明，過量產(chǎn)生的線粒體ROS可能是FAC誘導(dǎo)鐵死亡的原因。作者研究了常用的線粒體靶向ROS清除劑MitoTEMPO（MT）是否能挽救鐵誘導(dǎo)的鐵死亡。重要的是，在P-Hepa中，MT和Fer-1都能消除FAC誘導(dǎo)的鐵死亡（圖5A）。熒光探針BODIPY 581/591在氧化時(shí)會變成綠色，通過對其染色，證明MT阻斷鐵介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化的效果與鐵氧化抑制劑Fer-1不相上下（圖5B）。MT還能阻止鐵誘導(dǎo)的LC3B-II和p62的積累（圖5C），這表明自噬通量得到了改善。這些數(shù)據(jù)表明，mtROS的過度產(chǎn)生增加了脂質(zhì)過氧化，這是鐵誘導(dǎo)鐵變態(tài)反應(yīng)的基本機(jī)制。
       魚藤酮（Rotenone）是線粒體復(fù)合物I的選擇性抑制劑，在高濃度下可誘導(dǎo)mtROS生成并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。作者探究低劑量的魚藤酮與無毒的FAC濃度相結(jié)合誘導(dǎo)的mtROS升高是否會使肝細(xì)胞對鐵依賴性鐵死亡敏感。結(jié)果顯示單獨(dú)使用魚藤酮不會誘導(dǎo)PI陽性，而20μM的FAC只導(dǎo)致少量PI陽性細(xì)胞（圖5D）。與此相反，當(dāng)FAC和魚藤酮一起處理P-Hepa時(shí)，會導(dǎo)致大量PI 染色，這表明在mtROS產(chǎn)生水平較低的情況下，即使線粒體鐵的少量增加也會引發(fā)鐵死亡。

圖5 mtROS的過度生成在鐵誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化、自噬功能障礙和鐵死亡中必不可少

4、誘導(dǎo)ATF4保護(hù)自噬和細(xì)胞存活免受鐵毒性
       前面研究結(jié)果表明，ATF4可維持自噬和細(xì)胞存活，抵御鐵的毒性。為測試ATF4的潛在作用，利用293 T細(xì)胞確定沉默ATF4是否會導(dǎo)致自噬和細(xì)胞存活失去對鐵毒性的保護(hù)。用shATF4質(zhì)粒構(gòu)轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)ATF4的敲除（圖6A）。黃色點(diǎn)相對于總數(shù)的百分比增加表明自噬通量受損。在對照細(xì)胞中，對照條件下黃色點(diǎn)僅占總點(diǎn)數(shù)的7%，用FAC處理也沒有引起顯著變化（圖6B）。與此相反，在對照條件下，ATF4基因敲除會降低自噬通量，黃色點(diǎn)的比例為25%，經(jīng)FAC處理后顯著增加至43%，表明自噬通量進(jìn)一步降低（圖6B）。同樣，與對照細(xì)胞相比，ATF4缺陷細(xì)胞會引起LC3B-II的積累，而FAC會增強(qiáng)LC3B-II 的積累（圖6C）。此外，敲除ATF4導(dǎo)致FAC誘導(dǎo)的mtROS生成明顯增加（圖6D）。與對照細(xì)胞相比，shATF4細(xì)胞對FAC誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡敏感，而鐵死亡抑制劑Fer-1可減輕這種敏感性（圖6E）?？傊?，結(jié)果表明ATF4在維持自噬功能和防止鐵誘導(dǎo)的mtROS介導(dǎo)的鐵死亡中的作用。

圖6 ATF4缺乏導(dǎo)致鐵依賴性自噬功能障礙、mtROS產(chǎn)生和鐵死亡

5、缺鐵誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬減少
       為比較鐵增加和減少的影響，測定缺鐵對不同細(xì)胞物種的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)和自噬的影響。鐵缺乏是由去鐵胺（DFO）誘導(dǎo)的，并再次測量FTH1的表達(dá)，以顯示細(xì)胞內(nèi)的鐵儲存。之前研究表明，AML12和RAW264.7細(xì)胞在自噬和細(xì)胞存活變化方面對鐵超載不敏感。相反，這兩種細(xì)胞系都對缺鐵敏感，表現(xiàn)出ER應(yīng)激反應(yīng)，表現(xiàn)為磷酸化ERK、ATF4和CHOP的表達(dá)增加以及LC3B的表達(dá)增加（圖7A）。這些效應(yīng)也出現(xiàn)在P-Hepa細(xì)胞中，但不出現(xiàn)在HepG2細(xì)胞中（圖7B）。氧化應(yīng)激標(biāo)志物NRF2的表達(dá)在長期缺鐵的情況下有所下降（圖7A）。在AML12細(xì)胞中使用自噬抑制劑Chlq，繼續(xù)評估缺鐵如何調(diào)控自噬通量。DFO再次誘導(dǎo)LC3B-II表達(dá)的顯著增加，但與單獨(dú)使用Chlq相比，DFO/Chlq聯(lián)合處理并沒有進(jìn)一步增加LC3B-II（圖7C），這表明缺鐵時(shí)自噬通量減少。此外，DFO處理的AML12細(xì)胞中裂解的Caspase-3（CC3）表達(dá)增加，表明長期缺鐵導(dǎo)致細(xì)胞凋亡（圖7D）。

圖7鐵缺乏可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)并降低自噬通量

       通過使用腸上皮特異性鐵輸出蛋白（Fpn）基因敲除小鼠（Fpn^ΔIEC）確定體內(nèi)缺鐵對肝臟ER應(yīng)激反應(yīng)和自噬的影響。與之前的報(bào)道一致，F(xiàn)pn^ΔIEC小鼠在Fpn基因敲除6周后出現(xiàn)生長遲緩和明顯貧血（腳趾呈灰色）（圖8A）表現(xiàn)為FTH1的表達(dá)明顯降低（圖8B）。與對照組Fpn^f/f小鼠相比，F(xiàn)pn^ΔIEC小鼠p-ERK和CHOP的表達(dá)明顯升高（圖8B），表明ER壓力增加。缺鐵肝臟中CC3的表達(dá)也增加（圖8B）。同樣，熒光染色顯示Fpn^ΔIEC小鼠肝臟中Grp78和CC3的表達(dá)增加（圖8C）。與DFO誘導(dǎo)的培養(yǎng)細(xì)胞急性缺鐵不同，長期缺鐵的Fpn^ΔIEC肝臟中p62和LC3B蛋白表達(dá)量顯著下降（圖8B）。文獻(xiàn)表明ER應(yīng)激可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄重編程，導(dǎo)致許多基因的轉(zhuǎn)錄抑制。事實(shí)上，F(xiàn)pn^ΔIEC肝臟中的LC3和p62轉(zhuǎn)錄本明顯減少（圖8D），這也是LC3B和p62蛋白減少的原因。此外，Chlq使對照組肝臟中的 LC3B-II 表達(dá)量明顯增加了65%，但在Fpn^ΔIEC肝臟中卻沒有引起任何明顯變化（圖8E）。同樣，Chlq可使對照組肝臟中p62的表達(dá)增加90%，但在Fpn^ΔIEC肝臟中僅增加43%。LC3B-II和p62在Chlq作用下的積累減少表明缺鐵肝臟的自噬通量下降。
       缺鐵誘導(dǎo)的ER應(yīng)激可通過TEM分析再現(xiàn)，在Fpn^ΔIEC肝細(xì)胞中可看到輕微擴(kuò)張的ER（圖8F）。在Fpn^ΔIEC 肝細(xì)胞中看到糖原（紅色箭頭）和脂滴（藍(lán)色箭頭）堆積增加（圖8F）。與之前的報(bào)告一致，缺鐵的Fpn^ΔIEC肝細(xì)胞中線粒體明顯增大（圖8G），引人注目的是，與野生型肝細(xì)胞相比，F(xiàn)pn^ΔIEC 肝細(xì)胞中溶酶體的數(shù)量明顯減少（圖8H），這至少是自噬通量減少的部分原因。

圖8鐵缺乏誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并通過減少體內(nèi)肝臟溶酶體生物發(fā)生而降低自噬

6、鐵缺乏引起的自噬通量降低依賴于ER應(yīng)激的誘導(dǎo)
       作者試圖確定與缺鐵相關(guān)的ER平衡紊亂是如何導(dǎo)致自噬通量下降的。LAMP1是一種糖基化蛋白質(zhì)，是溶酶體生物生成和自噬不可或缺的組成部分。結(jié)果顯示ER應(yīng)激的DFO和曲卡霉素，兩種通過抑制蛋白N-糖基化的自噬誘導(dǎo)劑，都降低LAMP1的成熟（圖9A）。4-PBA能幫助蛋白質(zhì)折疊并抑制ER應(yīng)激，它能抑制DFO誘導(dǎo)的Grp78表達(dá)并改善LAMP1的成熟（圖9B）。重要的是，4-PBA可減輕DFO誘導(dǎo)的LC3B-II的積累。
       作者推測溶酶體蛋白的成熟缺陷會損害溶酶體的生物生成。對溶酶體蛋白酶 Cathepsin B進(jìn)行染色[50]，以檢測溶酶體數(shù)量的潛在變化。LysoTracker沒有被使用，因?yàn)樗饶軜?biāo)記溶酶體，也能標(biāo)記晚期核內(nèi)體。DFO處理導(dǎo)致cathepsin B 陽性點(diǎn)的數(shù)量明顯減少，而與4-PBA聯(lián)合處理可部分緩解這一現(xiàn)象（圖9C）。通過使用自噬通量報(bào)告基因GFP-LC3-RFP，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，DFO誘導(dǎo)的黃色點(diǎn)狀突起的百分比顯著增加，而與4-PBA共同處理后，黃色點(diǎn)狀突起的百分比顯著減少（圖9D），這表明蛋白質(zhì)成熟的恢復(fù)和ER應(yīng)激的抑制改善了自噬通量。值得注意的是，與未處理的對照組相比，4-PBA 本身也會導(dǎo)致黃色點(diǎn)的百分比輕微但顯著地增加?？傊?，結(jié)果表明，缺鐵供應(yīng)擾亂了ER平衡和蛋白質(zhì)成熟，至少是溶酶體生物生成受損和自噬減少的部分原因。

圖9缺鐵導(dǎo)致的自噬減少與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)

       總之，本研究表明，一方面鐵過量會誘導(dǎo)產(chǎn)生mtROS，從而引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)依賴性鐵死亡和自噬通量抑制。自噬的減少進(jìn)一步加強(qiáng)了鐵過量誘導(dǎo)的鐵死亡。ATF4的上調(diào)以及使用mtROS清除劑MT或過氧化脂質(zhì)清除劑Fer-1可阻礙脂質(zhì)過氧化和自噬通量的受損，從而阻止鐵過量誘導(dǎo)的鐵死亡。另一方面，缺鐵會損害蛋白質(zhì)折疊和成熟，導(dǎo)致ER應(yīng)激和溶酶體生物生成減少，共同導(dǎo)致自噬通量下降。4-PBA可改善蛋白質(zhì)的成熟并減輕ER壓力，從而挽救溶酶體的生物生成和自噬通量。推測ER應(yīng)激和自噬通量受損都有助于誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

圖10 鐵過載和鐵缺乏對細(xì)胞壓力響應(yīng)，自噬，細(xì)胞存活影響的示意圖

實(shí)驗(yàn)方法
qRT-PCR，WB，PI染色檢測細(xì)胞死亡，共聚焦免疫熒光，ROS，F(xiàn)e²⁺，線粒體膜電位，脂質(zhì)過氧化實(shí)驗(yàn)，透射電子顯微鏡，自噬通量
參考文獻(xiàn)
Wang Y, Wang M, Liu Y, Tao H, Banerjee S, Srinivasan S, Nemeth E, Czaja MJ, He P. Integrated regulation of stress responses, autophagy and survival by altered intracellular iron stores. Redox Biol. 2022 Jul 14;55:102407. doi: 10.1016/j.redox.2022.102407. 

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