MiR-297通過(guò)靶向PTBP3抑制肝癌腫瘤進(jìn)展

       盡管越來(lái)越多的證據(jù)表明miR-297有助于腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展，但miR-297在肝細(xì)胞癌(HCC)中的作用及其潛在的分子機(jī)制仍不清楚。在這里，我們報(bào)道了在人羊膜上皮細(xì)胞(hAECs)條件培養(yǎng)基處理后，miR-297在hepG2細(xì)胞中的表達(dá)顯著增加。而過(guò)表達(dá)miR-297在體外可抑制HCC細(xì)胞系的細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，在體內(nèi)可抑制HCC的發(fā)生。PTBP3在HCC細(xì)胞系中被鑒定為miR-297的直接靶基因，并介導(dǎo)miR-297在HCC細(xì)胞中的功能。臨床樣本中miR-297水平有降低的趨勢(shì)。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，過(guò)表達(dá)miR-297可通過(guò)下調(diào)PTBP3表達(dá)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路，從而抑制HCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。綜上所述，我們的研究結(jié)果表明，miR-297可以下調(diào)PTBP3的表達(dá)，抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的激活，從而阻止HCC的生長(zhǎng)、遷移和侵襲。本文于2023年8月發(fā)表于“Cell Death Disease”（IF=9.0）上。
技術(shù)路線

結(jié)果
1）經(jīng)hAEC-CM處理后，HepG2細(xì)胞中miR-297的表達(dá)升高
       通過(guò)CCK-8和創(chuàng)傷愈合試驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞增殖和遷移能力。用hAEC-CM處理可顯著抑制HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移(圖1A, B)。為了確定生長(zhǎng)抑制的機(jī)制，我們通過(guò)miRNA陣列和RT-qPCR驗(yàn)證了miRNA的差異表達(dá)(圖1C)。通過(guò)miRNA陣列(圖1D)和RT-qPCR(圖1E)分別檢測(cè)和驗(yàn)證了miR-297在hepG2中的表達(dá)，miRNA陣列的結(jié)果顯示，miR-297的表達(dá)與對(duì)照組相比明顯增加(圖1D)，我們通過(guò)RT-qPCR驗(yàn)證了hAEC-CM處理72 h后，miR-297在hepG2中的差異表達(dá)。RT-qPCR結(jié)果顯示，hAEC-CM處理HepG2細(xì)胞72 h后，miR297的表達(dá)顯著升高(圖1E)。

2）MiR-297在體外抑制HCC細(xì)胞系的增殖、遷移和侵襲
       為了確定miR-297對(duì)肝癌細(xì)胞體外生長(zhǎng)的影響，我們將miR-297模擬物、抑制劑和陰性對(duì)照引入肝癌細(xì)胞，包括HepG2和Huh7細(xì)胞。與陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-297模擬物后，肝癌細(xì)胞系中miR-297的表達(dá)顯著升高，而抑制劑處理的肝癌細(xì)胞中miR-297的表達(dá)顯著降低(圖2B)。細(xì)胞增殖能力通過(guò)CCK-8、菌落形成、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡檢測(cè)進(jìn)行評(píng)價(jià)。過(guò)表達(dá)miR-297顯著抑制了HepG2和Huh7細(xì)胞的生長(zhǎng)(圖2A)。轉(zhuǎn)染miR-297的細(xì)胞在G0/G1期的比例顯著高于對(duì)照組(圖2C)，表明miR-297通過(guò)抑制G2到S細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)變，在G0/G2期阻滯了細(xì)胞周期。此外，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染組形成的菌落數(shù)量顯著減少(圖2D)。我們的結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組(miR-297 mimic)和陰性對(duì)照組(miR-NC)之間的細(xì)胞凋亡沒(méi)有顯著差異(圖2F)。轉(zhuǎn)染后，HepG2和Huh7細(xì)胞的遷移和侵襲能力降低(圖2E, G)。這些結(jié)果證實(shí)了miR-297在體外抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

3）過(guò)表達(dá)miR-297可抑制HepG2細(xì)胞的體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)
       由于miR-297在體外抑制HepG2和Huh7細(xì)胞的生長(zhǎng)，我們進(jìn)行了體內(nèi)腫瘤形成實(shí)驗(yàn)。我們通過(guò)裸鼠皮下注射HepG2-miR-297細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞來(lái)評(píng)估m(xù)iR-297的體內(nèi)抗腫瘤功效。每周測(cè)量腫瘤體積，腫瘤植入后6周處死小鼠。從第21天開(kāi)始，miR-297組的腫瘤體積明顯低于對(duì)照組(圖3A)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，miR-297組的腫瘤平均重量明顯低于對(duì)照組(圖3B、C)。Ki67的表達(dá)弱于對(duì)照組的腫瘤(圖3D)。這些結(jié)果表明miR-397在體內(nèi)顯著抑制腫瘤發(fā)生。

4）miR-297在人肝癌患者組織中的表達(dá)
       為了研究miR-297在肝癌患者組織中的表達(dá)模式，我們進(jìn)行了組織微陣列。結(jié)果顯示，miR-297水平在癌組織中與非癌組織相比有降低的趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4A, B)。并比較四組miR-297表達(dá)比例。結(jié)果顯示四組癌變組織與非癌變組織的比例無(wú)顯著差異(圖4C)。根據(jù)p53的表達(dá)水平，將70例肝癌患者樣本分為p53陽(yáng)性組和p53陰性組。我們比較了兩組，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性組的miR-297水平較低(圖4D)。

5）MiR-297靶向并下調(diào)PTBP3，抑制PI3K/AKT信號(hào)通路
       接下來(lái)，我們檢索了四個(gè)在線miRNA靶點(diǎn)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)(TargetScan、PicTar、miRWalk和miRanda)，以確定miR-297的候選靶基因。最初，在所有四個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中預(yù)測(cè)了miR-297的13個(gè)潛在基因(圖5A)。所有四個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)都預(yù)測(cè)PTBP3是miR-297的直接靶點(diǎn)。在PTBP3 mRNA的3 ' -UTR中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)互補(bǔ)的miR-297序列(圖5B)。過(guò)表達(dá)miR-297可下調(diào)HepG2細(xì)胞中PTBP3 mRNA和蛋白水平(圖5C, D)。為了驗(yàn)證PTBP3是miR-297的真正下游靶點(diǎn)，我們進(jìn)行了雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miR-297模擬物顯著降低PTBP3熒光素酶報(bào)告基因活性(圖5E)，而miR-297抑制劑具有相反的效果(圖5F)。然而，當(dāng)與突變的PTBP3報(bào)告基因共轉(zhuǎn)染時(shí)，miR-297模擬物并沒(méi)有抑制PTBP3的熒光素酶活性。結(jié)果強(qiáng)調(diào)了miR-297與PTBP3-3 ' -UTR的結(jié)合。
       先前的報(bào)道表明，PTBP3在HCC中的作用很可能與Akt的磷酸化有關(guān)。為了驗(yàn)證，通過(guò)western blotting檢測(cè)AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)miR-297模擬處理導(dǎo)致miR-297升高，但降低PTBP3、p-PI3K、AKT和p-AKT的表達(dá)以及p-AKT/ AKT比值；轉(zhuǎn)染PTBP3質(zhì)粒后，PTBP3、p-PI3K、AKT、p-AKT表達(dá)增加，p-AKT/AKT比值增加。相對(duì)于miR-297 mimic處理，miR-297 mimic+PTBP3質(zhì)粒處理對(duì)miR-297的表達(dá)沒(méi)有影響，但增加了PTBP3、p-PI3K和p-AKT的表達(dá)以及p-AKT/AKT比值(圖5D)。這些結(jié)果表明miR-297可以特異性結(jié)合PTBP3-3 ' -UTR下調(diào)PTBP3表達(dá)，從而抑制PI3K/AKT信號(hào)通路。我們還對(duì)EMT相關(guān)基因進(jìn)行了western-blot分析。我們發(fā)現(xiàn)miR-297過(guò)表達(dá)下調(diào)PTBP3、間質(zhì)標(biāo)記物(N-cadherin和Vimentin)，但增強(qiáng)上皮標(biāo)記物(E-cadherin)，而PTBP3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染導(dǎo)致PTBP3、N-cadherin和Vimentin表達(dá)增加，但降低E-cadherin表達(dá)(圖5D)。MiR-297模擬物+PTBP3質(zhì)粒處理恢復(fù)了EMT相關(guān)水平。綜上所述，PTBP3過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)HepG2和Huh7細(xì)胞發(fā)生EMT。miR-297在HCC細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)可以通過(guò)下調(diào)PTBP3的表達(dá)來(lái)抑制EMT。

6）PTBP3表達(dá)降低可阻斷PI3K/AKT信號(hào)通路，抑制肝癌細(xì)胞系體外增殖、遷移和侵襲
       在確認(rèn)PTBP3是HepG2細(xì)胞中miR-297的直接靶點(diǎn)后，我們進(jìn)一步探討了miR-297介導(dǎo)的PTBP3在HCC生物學(xué)功能中與PI3K/AKT信號(hào)通路的關(guān)系。我們首先將si-PTBP3和陰性對(duì)照(si-NC)轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，以確定PTBP3的減少是否能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染si-PTBP3可抑制HepG2細(xì)胞的增殖(圖6A)、遷移(圖6C)和侵襲(圖6D)。細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期(圖6B)。為了進(jìn)一步證實(shí)PTBP3在miR-297對(duì)HepG2細(xì)胞抑制作用中的作用，我們將miR-297模擬物和PTBP3質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HepG2細(xì)胞中，以確定PTBP3過(guò)表達(dá)是否可以逆轉(zhuǎn)miR-297過(guò)表達(dá)對(duì)HepG2細(xì)胞進(jìn)展的抑制作用。結(jié)果表明，PTBP3過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-297過(guò)表達(dá)對(duì)HepG2細(xì)胞增殖(圖6E)、遷移(圖6G)和侵襲(圖6H)以及細(xì)胞周期阻滯效應(yīng)(圖6F)的抑制作用。
       此外，miR-297 mimic處理后，HepG2和Huh7細(xì)胞中p-PI3K、p-AKT和PTBP3的表達(dá)以及p-AKT/AKT比值均降低，而在miR-297抑制劑處理的HCC細(xì)胞中觀察到相反的趨勢(shì)。此外，相對(duì)于miR-297抑制劑治療，進(jìn)一步LY294002治療不影響PTBP3表達(dá)，但導(dǎo)致HepG2和Huh7細(xì)胞中p-PI3K和p-AKT表達(dá)以及pAKT/AKT比值下降，而miR-297抑制劑+ si-PTBP3治療導(dǎo)致p-PI3K、p-AKT和PTBP3表達(dá)降低(圖6I)。CCK-8檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在第3天和第4天，miR-297抑制劑誘導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)，而LY294002或miR-297模擬治療導(dǎo)致相反的趨勢(shì)；與抑制劑處理相比，miR-297抑制劑+ si-PTBP3或miR-297抑制劑+ LY294002處理抑制了HCC細(xì)胞系的細(xì)胞增殖(圖6J)。此外，miR-297抑制劑誘導(dǎo)HCC細(xì)胞的侵襲和遷移，而LY294002或miR-297 mimic轉(zhuǎn)染則導(dǎo)致相反的趨勢(shì)；相對(duì)于miR-297抑制劑治療，miR-297抑制劑+ si-PTBP3或miR-297抑制劑+ LY294002治療抑制HCC細(xì)胞的侵襲和遷移(圖6K, L)。綜上所述，這些結(jié)果支持miR-297過(guò)表達(dá)通過(guò)降低PTBP3，抑制PI3K/AKT信號(hào)通路，從而抑制HCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

結(jié)論
       我們證明過(guò)表達(dá)miR-297在體外抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，在體內(nèi)抑制肝癌細(xì)胞的腫瘤發(fā)生。在肝癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)PTBP3是miR-297的直接靶基因。MiR-297可直接靶向PTBP3，滅活PI3K/AKT信號(hào)通路，抑制HCC細(xì)胞系的生長(zhǎng)、遷移和侵襲。因此，miR-297可能是一個(gè)有效的潛在肝癌治療靶點(diǎn)。

實(shí)驗(yàn)方法
RT-qPCR，Western blotting，熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)，CCK-8，克隆形成實(shí)驗(yàn)，流式，傷口愈合及侵襲試驗(yàn)，裸鼠體內(nèi)腫瘤發(fā)生實(shí)驗(yàn)，miR-297原位雜交，免疫組織化學(xué)染色，miRNA芯片分析。
參考文獻(xiàn)
Lu N, Min J, Peng L, Huang S, Chai X, Wang S, Wang J. MiR-297 inhibits tumour progression of liver cancer by targeting PTBP3. Cell Death Dis. 2023 Aug 26;14(8):564. doi: 10.1038/s41419-023-06097-0.