沒跑了，TP53?R249S突變增加患癌風(fēng)險(xiǎn)——人肝臟類器官權(quán)威驗(yàn)證

??
       如今，肝細(xì)胞癌（HCC）的主要基因組驅(qū)動(dòng)因素已得到廣泛認(rèn)可，但建立它們在人類HCC發(fā)生過程中的作用模型仍然很少。本文作者利用人肝臟類器官作為實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，從TP53缺失和L3環(huán)R249S突變的遺傳病變中模擬人類肝癌發(fā)生的早期階段。此外，HCC細(xì)胞系的染色質(zhì)免疫沉淀測序（ChIP-seq）揭示了TP53缺失導(dǎo)致的抑瘤功能喪失和p53突變導(dǎo)致的功能增益活動(dòng)引發(fā)HCC的重要功能。本文于2023年9月發(fā)表在《Hepatology》IF:13.5期刊上。

技術(shù)路線

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1、ChIP-seq揭示L3突變體在染色質(zhì)重塑和應(yīng)激反應(yīng)中的功能獲得作用
       在HCC中，TP53經(jīng)常因錯(cuò)義突變而發(fā)生改變，占突變病例的一半以上（圖1A），且大多集中在DNA結(jié)合域（DBD）Loops 1-3 內(nèi)（圖1B）。在TCGA數(shù)據(jù)集中所有攜帶TP53突變的HCC中，約60%同時(shí)攜帶TP53缺失和一個(gè)額外的改變蛋白質(zhì)的錯(cuò)義突變（TP53^missense/-）（圖1C）。為系統(tǒng)評(píng)估HCC中TP53錯(cuò)義突變對(duì)轉(zhuǎn)錄激活的潛在增益，通過ChIP-seq實(shí)驗(yàn)，對(duì)四個(gè)TP53突變體（包括兩個(gè)L3環(huán)突變（TP53^R249S/-和TP53^S241F/-）和兩個(gè)非L3環(huán)突變（TP53^L145R/-和TP53^H168R/-）的TP53結(jié)合和賴氨酸H3K27ac的全基因組模式進(jìn)行了數(shù)據(jù)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論TP53突變位點(diǎn)如何，WT TP53的全基因組結(jié)合在這4種突變體中大部分都喪失了，這意味著TP53錯(cuò)義突變的腫瘤中普遍喪失了傳統(tǒng)的TP53轉(zhuǎn)錄活性（圖1D）。值得注意的是，與WT TP53和其他兩個(gè)非L3環(huán)突變體相比，一組TP53 結(jié)合峰僅在L3環(huán)突變體中被發(fā)現(xiàn)（圖1E）。此外，還觀察到R249S突變體特有的啟動(dòng)子近端TP53結(jié)合峰，這提供了其他轉(zhuǎn)錄調(diào)控特性的可能性（圖1E）。相反，在非L3環(huán)突變體中觀察到了罕見的獨(dú)特結(jié)合峰。富集的H3K27ac信號(hào)在 L3環(huán)突變體結(jié)合區(qū)域的共定位進(jìn)一步表明這些峰與活躍的轉(zhuǎn)錄有關(guān)（圖1E）。此外，為說明潛在的轉(zhuǎn)錄因子，作者在內(nèi)源性TP53^R249S/-和TP53^S241F/-細(xì)胞中定義了紅細(xì)胞轉(zhuǎn)化特異性和堿性螺旋-環(huán)-螺旋家族的核心結(jié)合基序（圖1F）。
       為確定這些TP53突變體的功能，使用靠近這三組TP53結(jié)合峰的基因進(jìn)行通路富集分析。如預(yù)期的，WT-TP53主要參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期和DNA損傷的調(diào)節(jié)（圖1Gi），這支持TP53在HCC中的抑瘤作用。L3環(huán)突變體與染色質(zhì)重塑和生物合成過程相關(guān)的基因結(jié)合（圖1Gii），而在TP53^R249S/-中發(fā)現(xiàn)的獨(dú)特結(jié)合峰則富集于其他通路，包括應(yīng)激反應(yīng)和蛋白質(zhì)修飾（圖1Giii）。

圖1 TP53基因型的ChIP測序

       為證實(shí)ChIP-seq發(fā)現(xiàn)的L3突變體新的結(jié)合位點(diǎn)，在HepG2（TP53^WT/WT）、HKCIC2（TP53^S241F/-）和HKCI11（TP53^R249S/-）細(xì)胞中進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀-qPCR，以驗(yàn)證TP53突變體與富集靶標(biāo)的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）區(qū)域的直接結(jié)合。首先，為確認(rèn)TP53 L3突變體的功能缺失特性，測試了與內(nèi)在凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的靶標(biāo)EDA2R、PHLDA3和CDKN1A。TP53^R249S/-和TP53^S241F/-似乎不與這些基因結(jié)合，而HepG2 TP53^WT/WT則顯示出與TSS區(qū)域的富集結(jié)合（圖2Ai、Aii）。接下來，在TP53^R249S/-突變體和TP53^S241F/-突變體中發(fā)現(xiàn)，參與染色體組織調(diào)控的L3相關(guān)靶標(biāo)RCOR3和UBE2I顯示出很強(qiáng)的TSS占有率，而在TP53^WT/WT突變體中則沒有發(fā)現(xiàn)（圖2B）。此外，R249S顯性靶標(biāo)的功能還包括應(yīng)激反應(yīng)、CLTC和PSMF1、紡錘體組織SUN2以及染色質(zhì)重塑BPTF在TP53^R249S/-與TSS區(qū)的結(jié)合均顯示出顯著的富集，與TP53^S241F/-和TP53^WT/WT 相比（圖2C）。
       為證實(shí)L3突變體增強(qiáng)了基因表達(dá)，作者在配對(duì)的HCC和鄰近非腫瘤肝臟的獨(dú)立原發(fā)性隊(duì)列中進(jìn)行驗(yàn)證。這些標(biāo)本根據(jù)目標(biāo)捕獲測序或Sanger 測序驗(yàn)證的TP53狀態(tài)進(jìn)行分組，包括WT（TP53^WT/WT）、無效（TP53^-/-）、TP53^R249S、L3 環(huán)內(nèi)的TP53錯(cuò)義突變（其他L3）和L3環(huán)外的錯(cuò)義突變（non-L3）。除TP53^WT/WT 外，所有組的功能缺失靶點(diǎn)都明顯減少（圖2D）。在TP53 L3環(huán)突變的標(biāo)本中，L3環(huán)靶點(diǎn)明顯升高（圖2E）。值得注意的是，與TP53^WT 和其他突變組相比，TP53^R249S病例中6個(gè)R249S顯性靶標(biāo)明顯升高（圖2F）。

圖2 功能喪失(LOF)，回路L3和R249S富集靶標(biāo)的驗(yàn)證

2、TP53 KO和R249S產(chǎn)生原發(fā)性肝類器官和致瘤誘導(dǎo)
       為了解TP53^KO和TP53^R249S在HCC中的致癌作用，作者從新鮮的非腫瘤肝組織中培養(yǎng)了三個(gè)肝臟器官模型，即肝臟類器官模型1（Liver.Org 1）、肝臟類器官模型2（Liver.Org 2）和肝臟類器官模型3（圖3A）。為模擬TP53^R249S/-基因型，首先應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)的兩個(gè)single‐guided RNA在三個(gè)肝臟器官組織中 KO TP53（圖3B）。隨后通過pLV-Hygro-TP53^R249S慢病毒進(jìn)行相應(yīng)的TP53 ^R249S 過表達(dá)（圖3B）。TP53蛋白的丟失和獲得被WB所證實(shí)（圖3C）。從形態(tài)上看，WT（TP53^WT）肝臟類器官的明視野成像和組織學(xué)染色都保持了單層分區(qū)的一致性（圖3D）。相比之下，TP53^KO和R249S過表達(dá)（TP53^R249S）的類器官出現(xiàn)了不同的形態(tài)，可見增厚的管壁侵入管腔，并呈現(xiàn)多形性惡性特征，包括發(fā)育不良、色素沉著、不典型和頻繁的有絲分裂、極性喪失和核與細(xì)胞質(zhì)比率增加（圖3D）。對(duì)Liver.Org 1的延時(shí)成像進(jìn)一步驗(yàn)證了TP53^KO和TP53^R249S類器官中出現(xiàn)的生長模式變化的異常形態(tài)特征。與TP53^WT對(duì)照組有機(jī)體的導(dǎo)管結(jié)構(gòu)（圖3E）相比，觀察到TP53蛋白缺失后形成的緊湊有機(jī)體簇（圖3E）。有趣的是，R249S過表達(dá)的類器官表現(xiàn)出非典型生長，類器官表面有大量芽狀突起（圖3E），這與HCC類器官的生長模式非常相似。通過高通量成像檢測，量化了不同TP53狀態(tài)下的形態(tài)差異。與組織學(xué)一致，單層有機(jī)體常見于TP53WT組，而腫瘤喜歡的多層或發(fā)育不良的有機(jī)體則廣泛見于TP53^KO和TP53^R249S Liver.Org 1和Liver.Org 2組（圖3F）。
       此外，為評(píng)估TP53缺失或R249S突變是否會(huì)帶來生長優(yōu)勢，注意到所有TP53^WT對(duì)照組器官組織都在20次傳代過程中停止生長（圖3G）。令人驚訝的是，TP53^KO和TP53^R249S類器官在繁殖過程中繼續(xù)增殖和擴(kuò)張，在超過50次的傳代過程中，每周的分裂率始終為1:4（圖3G）。據(jù)報(bào)道，干性是促進(jìn)細(xì)胞壽命的因素之一，因此評(píng)估了三個(gè)肝臟類器官中肝癌干性標(biāo)志物CD44和CD133的表達(dá)。與TP53^WT對(duì)照組相比，TP53^KO和TP53^R249S類器官中CD44和CD133的表達(dá)明顯增加（圖3H），表明癌癥相關(guān)干性能力明顯受到刺激。

圖3 TP53基因敲除（TP53^KO）和TP53^R249S的肝類器官表現(xiàn)出癌前特征

3、模型肝臟類器官中TP53^R249S引發(fā)的腫瘤
       接下來探討突變體R249S和癌癥相關(guān)應(yīng)激在啟動(dòng)肝癌發(fā)展中的作用。首先驗(yàn)證了TP53功能缺失靶基因和R249S顯性候選基因的表達(dá)，這些基因與編輯肝臟類器官中的應(yīng)激反應(yīng)和紡錘體組織有關(guān)。與在原發(fā)性HCC中發(fā)現(xiàn)的表達(dá)一致，在R249S高表達(dá)的肝臟組織細(xì)胞中檢測到R249S優(yōu)勢靶基因的明顯上調(diào)（圖4A）。在分別過表達(dá)TP53 WT和R249S的Hep3B（TP53^-/-）細(xì)胞中進(jìn)行雙熒光素酶檢測，進(jìn)一步確定了R249S突變體的直接轉(zhuǎn)錄效應(yīng)。與TP53 WT對(duì)照組相比，TP53 R249S表達(dá)細(xì)胞中兩個(gè)與應(yīng)激相關(guān)的R249S優(yōu)勢靶標(biāo)CLTC和PSMF1的啟動(dòng)子活性明顯升高（圖4B）。錨定非依賴性實(shí)驗(yàn)提示了一鍋可能的腫瘤發(fā)生其實(shí)作用，表現(xiàn)為TP53^R249S類器官中有大量致密的大球體，而TP53^KO類器官中有大量的球體簇，而對(duì)照類器官中只有微小的散發(fā)性球體（圖4C）。異種移植進(jìn)一步證實(shí)了TP53^R249S的致瘤潛力。2個(gè)月后，皮下類器官異種移植（ODXs）顯示，與TP53缺陷類器官（17%）和WT對(duì)照（0%）相比，R249S高表達(dá)肝臟類器官（37%）的病變形成率增加（圖4D）。組織學(xué)檢查顯示這些病變具有惡性特征，顯示出腺體形成的非典型細(xì)胞，這些細(xì)胞表現(xiàn)出核多形性高色差、偶見空泡狀胞質(zhì)和突出的核小體（圖4E）。這些發(fā)現(xiàn)表明，p53缺失和R249S基因突變同時(shí)存在是一種惡性轉(zhuǎn)化。
       接下來，研究R249S相關(guān)應(yīng)激反應(yīng)在腫瘤傾向中的促進(jìn)作用。有幾種類型的應(yīng)激，如ER應(yīng)激、氧化應(yīng)激和代謝應(yīng)激，會(huì)積極調(diào)控癌癥的發(fā)展。使用不同的應(yīng)激特異性刺激劑，包括ER應(yīng)激誘導(dǎo)劑曲卡霉素、氧化應(yīng)激誘導(dǎo)劑過氧化氫、依托泊苷產(chǎn)生的基因毒性應(yīng)激以及營養(yǎng)缺乏培養(yǎng)基產(chǎn)生的代謝應(yīng)激誘導(dǎo)劑。值得注意的是，TP53^R249S只對(duì)曲奈霉素有明顯的耐受性，而對(duì)其他誘導(dǎo)劑沒有耐受性（圖4F）。鑒于ER應(yīng)激與活性氧（ROS）誘導(dǎo)之間的相互串?dāng)_，作者評(píng)估了ER應(yīng)激刺激下的ROS水平。CellROX Red信號(hào)在TP53^R249S類器官組織中被模糊地檢測到，而在對(duì)照組中則被清晰地識(shí)別到（圖4G），這意味著R249S的功能獲得作用產(chǎn)生了ROS平衡水平。為確認(rèn)ER應(yīng)激耐受性與R249S顯性應(yīng)激靶標(biāo)PSMF1之間的聯(lián)系，通過敲除PSMF1對(duì)TP53^R249S肝臟類器官進(jìn)行拯救實(shí)驗(yàn)（圖4H）。PSMF1沉默的肝臟類器官恢復(fù)了對(duì)妥卡霉素的自發(fā)敏感性，IC50值比對(duì)照低4-8倍（圖4I）。
       由于錯(cuò)誤折疊蛋白的積累是ER應(yīng)激的標(biāo)志，作者檢測了PSMF1下調(diào)的類器官中未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）的關(guān)鍵傳感器和介質(zhì)的表達(dá)。與對(duì)照相比，PSMF1缺陷型TP53^R249S類器官中ATF6、GRP94、CHOP和GADD34 GADD的表達(dá)量在使用曲卡霉素處理時(shí)明顯增加（圖4J），這意味著PSMF1在通過防止UPR激活來緩解ER應(yīng)激方面具有重要能力。

圖4 TP53^R249S肝類器官中的腫瘤發(fā)生

4、通過染色質(zhì)重塑靶向TP53^R249S的一個(gè)治療窗
       考慮到R249S顯性靶標(biāo)中"染色質(zhì)重塑"GO的富集（圖1Giii），作者首先確定了TP53^R249S肝臟類器官中R249S顯性靶標(biāo)（BPTF、BRPF1和SMARCD2）的顯著上調(diào)（圖5A）。由于硫鳥嘌呤是一種抑制DNA合成和甲基化的表觀遺傳藥物，所以作者在體外探討了硫鳥嘌呤在TP53^R249S類器官中的藥理作用。結(jié)果顯示，與WT對(duì)照組相比，TP53^R249S類器官更容易受到硫鳥嘌呤的影響，其敏感性在IC50值方面顯著增加4.5-7倍（圖5B）。
       為進(jìn)一步證實(shí)硫鳥嘌呤的體內(nèi)療效，利用Liver.Org 1和Liver.Org 2的 TP53^R249S 類器官建立ODX 模型。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到約50立方毫米時(shí)，隨機(jī)給小鼠腹腔注射硫鳥嘌呤（1.5 mg/kg）或藥物，連續(xù)注射14天。結(jié)果顯示，TP53^R249S ODX對(duì)硫鳥嘌呤更敏感，與藥物對(duì)照組相比，治療14天后腫瘤體積明顯縮?。▓D5C、D）。兩個(gè)治療組的體重沒有明顯差異（圖5E）。所有主要的器官組織學(xué)也都正常，這表明硫鳥嘌呤的副作用可以忽略不計(jì)（圖5F）?？傊?，研究證明表觀遺傳藥物硫鳥嘌呤在體外和體內(nèi)針對(duì)與TP53^R249S相關(guān)的功能獲得脆弱性的治療潛力。

圖5 靶向TP53^R249S的一個(gè)治療窗

       總之，本文發(fā)現(xiàn)TP53缺失和L3 loop突變會(huì)產(chǎn)生不同的致瘤效應(yīng)，它們共同賦予正常肝細(xì)胞早期克隆優(yōu)勢和促生存功能（圖6）。

圖6 圖形摘要

實(shí)驗(yàn)方法
HCC臨床樣本收集，肝臟類器官培養(yǎng)，慢病毒轉(zhuǎn)染類器官，類器官形態(tài)觀察，壓力敏感實(shí)驗(yàn)，肝臟類器官來源的異種移植瘤
參考文獻(xiàn)
Lam YK, Yu J, Huang H, Ding X, Wong AM, Leung HH, Chan AW, Ng KK, Xu M, Wang X, Wong N. TP53 R249S mutation in hepatic organoids captures the predisposing cancer risk. Hepatology. 2023 Sep 1;78(3):727-740. doi: 10.1002/hep.32802. Epub 2022 Oct 11. PMID: 36221953

??