P300/SP1復(fù)合體/METTL1/m7G/CDK14軸調(diào)控去勢抵抗性前列腺癌

       m7G修飾是除m6A修飾外更常見的一種表觀遺傳修飾。研究發(fā)現(xiàn)m7G修飾在mRNA轉(zhuǎn)錄、tRNA穩(wěn)定性、rRNA加工成熟和miRNA生物合成等方面發(fā)揮著重要作用。然而， METTL1在腫瘤，特別是前列腺癌(PCa)中的作用尚未被揭示。在這里，我們發(fā)現(xiàn)METTL1在去勢抵抗性前列腺癌（CRPC）中升高，并且METTL1升高的患者往往預(yù)后較差。功能上，在CRPC細胞中，METTL1的敲低顯著限制了細胞的增殖和侵襲能力。在機制上，我們發(fā)現(xiàn)P300可以與SP1形成復(fù)合物，并通過SP1結(jié)合到METTL1基因的啟動子區(qū)域，從而介導(dǎo)CRPC中METTL1的轉(zhuǎn)錄上調(diào)。隨后，我們的研究結(jié)果表明，METTL1通過在其mRNA中添加m7G修飾，從而增強CDK14 mRNA的穩(wěn)定性，最終促進CRPC的進展。本文于2023年8月發(fā)表于“Journal of Experimental & Clinical Cancer Research”（IF=11.3）上。
技術(shù)路線

結(jié)果
1）METTL1表達升高與CRPC患者預(yù)后不良相關(guān)
       我們對3例CRPC和3例HSPC患者的腫瘤組織樣本進行了全轉(zhuǎn)錄組測序。根據(jù)|Fold change| > 2和p值< 0.05的標準篩選差異表達基因，并以熱圖的形式顯示差異表達基因(圖1A)。根據(jù)差異基因的結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)與HSPC相比，CRPC中METTL1的表達異常升高(圖1B)。為了驗證測序結(jié)果的準確性，我們從HSPC和CRPC患者中獲得腫瘤組織，提取mRNA和蛋白，分別檢測METTL1在mRNA和蛋白水平上的差異表達。結(jié)果顯示，與HSPC患者相比，METTL1在CRPC患者中的表達水平更高(圖1C和1D)。免疫組化染色實驗發(fā)現(xiàn)METTL1在CRPC中的總體表達水平更高(圖1E和1F)。免疫組化染色“陽性”和“強陽性”的患者比例在CRPC中明顯高于HSPC患者(圖1G)。METTL1高表達的CRPC患者生存率較差(圖1H)。根據(jù)患者的生存過渡和生存時間，我們還發(fā)現(xiàn)METTL1高表達組患者生存和預(yù)后較差(圖1I)。綜上所述，我們得出結(jié)論，METTL1在CRPC中表達異常上調(diào)，且METTL1高表達的患者生存率較差。

2）敲低METTL1抑制CRPC細胞的增殖和侵襲
       為了闡明METTL1對CRPC惡性生物學行為的影響，我們在前列腺癌細胞系中進行了表型實驗。我們首先檢測了HSPC和CRPC細胞系之間METTL1水平的差異，發(fā)現(xiàn)與HSPC細胞系LNCaP相比，CRPC細胞系中METTL1水平的升高存在差異，其中以LNCaP- ai和C4-2最為突出(圖2A和2B)。隨后，我們以LNCaP- ai和C4-2細胞為研究載體構(gòu)建了METTL1穩(wěn)定沉默的細胞系(圖2C-2E)。為了研究METTL1對CRPC細胞增殖能力的影響，我們進行了MTT實驗和克隆形成實驗。結(jié)果表明，敲低METTL1降低了細胞的增殖能力，減少了克隆集落形成的數(shù)量，并顯著抑制了細胞的增殖能力(圖2F-2K)。最后，我們在LNCaP-AI細胞和C4-2細胞中進行transwell實驗，發(fā)現(xiàn)抑制METTL1的表達抑制了細胞的侵襲能力(圖2L-2O)。綜上所述，我們初步得出結(jié)論，METTL1的表達與CRPC細胞不良的生物學行為有關(guān)。限制METTL1的表達明顯限制了細胞的增殖和侵襲能力。

3）P300的增加通過H3K27乙?；揎椊閷?dǎo)METTL1的高表達
       為了探索CRPC中METTL1高表達的潛在分子機制，我們首先通過UCSC在線網(wǎng)站可視化了METTL1基因啟動子的修飾形式。我們在METTL1基因的啟動子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了大量的組蛋白乙?；揎椃?H3K27ac)，這表明METTL1可能通過染色質(zhì)乙?；M行調(diào)節(jié)(圖3A)。接下來，我們用H3K27ac抗體進行染色質(zhì)免疫沉淀實驗，發(fā)現(xiàn)在LNCaP- AI和C4-2細胞中，METTL1啟動子區(qū)H3K27ac修飾的豐富度高于LNCaP細胞(圖3B)。這表明CRPC中METTL1水平的異常上調(diào)可能與METTL1基因啟動子區(qū)H3K27ac的高修飾有關(guān)?？紤]到P300是介導(dǎo)H3K27乙?；揎椀年P(guān)鍵酶，我們用P300抑制劑C646處理LNCaP-AI和C4-2細胞，發(fā)現(xiàn)用20 μM濃度的C646處理細胞48 h后，METTL1 mRNA表達顯著下降(圖3C和3D)。隨后，我們用不同濃度梯度的C646處理細胞，在48 h時間點，我們發(fā)現(xiàn)，當C646濃度為20 μM時，METTL1 mRNA水平的下降最為明顯(圖3E和3F)。隨后，我們還證實，在P300抑制劑C646 (20 μM,48 h)處理后，組蛋白H3K27ac和METTL1在蛋白質(zhì)水平上都有所下降(圖3G)。接下來，我們使用組織微陣列進行染色分析，發(fā)現(xiàn)P300和METTL1之間呈正相關(guān)(圖3H和3I)。此外，我們設(shè)計了siRNA來抑制P300的表達(圖3J)，并證實P300的敲低可以抑制METTL1的表達(圖3K和3L)。為了進一步證明P300的敲低導(dǎo)致METTL1 mRNA水平的降低是由于METTL1啟動子區(qū)域H3K27ac水平的降低引起的，我們進行了染色質(zhì)免疫沉淀實驗。結(jié)果表明，P300的抑制也顯著降低了METTL1基因啟動子區(qū)域的H3K27ac水平(圖3M和3N)。上述實驗結(jié)果初步證明P300介導(dǎo)的METTL1啟動子區(qū)H3K27ac的修飾是導(dǎo)致CRPC中METTL1 mRNA的上調(diào)的一個重要的機制。

4）P300/SP1復(fù)合體調(diào)節(jié)METTL1的轉(zhuǎn)錄活性
       為了進一步研究導(dǎo)致METTL1轉(zhuǎn)錄上調(diào)的分子機制，我們首先通過GENECARD、PROMO和JASPAR網(wǎng)站預(yù)測了METTL1的潛在轉(zhuǎn)錄因子。三個數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)SP1和YY1是共享的(圖4A)。鑒于SP1在前列腺癌關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的重要作用，我們構(gòu)建了LNCaP-AI和C4-2中SP1穩(wěn)定敲低的細胞系，發(fā)現(xiàn)SP1的沉默降低了METTL1的表達水平(圖4B-4D)。P300作為一種重要的轉(zhuǎn)錄共激活因子，除了具有乙酰轉(zhuǎn)移酶活性外，還經(jīng)常通過不同的作用方式參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。在這里，我們通過生物信息學手段預(yù)測SP1和P300可能相互作用(圖4E)。隨后，我們通過免疫沉淀實驗證實了相互結(jié)合的存在(圖4F)。接下來，我們在COS7細胞中通過熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C，當SP1和P300同時存在時，METTL1的轉(zhuǎn)錄活性比它們單獨存在時更強(圖4G)。為了闡明SP1和P300復(fù)合物與METTL1啟動子區(qū)域結(jié)合的方式，進行了一系列CHIP-qPCR實驗。我們一方面發(fā)現(xiàn)SP1和P300可以直接或間接結(jié)合到METTL1啟動子區(qū)域(圖4H-4K)，另一方面，我們發(fā)現(xiàn)在沉默SP1后，P300幾乎不再結(jié)合到METTL1啟動子區(qū)域(圖4L和4M)。然而，在抑制P300后，SP1與METTL1啟動子區(qū)域的結(jié)合減少，但結(jié)合仍然存在(圖4N和4O)。這些結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄因子SP1能夠與P300形成復(fù)合物介導(dǎo)METTL1的轉(zhuǎn)錄激活，并且SP1而不是P300可以直接結(jié)合到METTL1啟動子區(qū)域啟動轉(zhuǎn)錄。

5）METTL1通過介導(dǎo)內(nèi)部m7G修飾來穩(wěn)定CDK14 mRNA
       為了進一步探討METTL1影響CRPC細胞系增殖和侵襲能力的分子機制，我們首先驗證了其在CRPC中的生物學功能。考慮到METTL1是一種甲基轉(zhuǎn)移酶，負責催化m7G修飾。我們檢測了HSPC和CRPC細胞mRNA中m7G水平的差異。在用decapping酶處理細胞后，我們發(fā)現(xiàn)LNCaP-AI和C4-2細胞的mRNA中m7G修飾水平比LNCaP細胞更豐富(圖5A和5B)。接下來，我們構(gòu)建了METTL1野生型和酶活性突變型過表達質(zhì)粒。我們發(fā)現(xiàn)，METTL1沉默后，CRPC細胞mRNA中的m7G水平顯著降低，轉(zhuǎn)染METTL1野生型過表達質(zhì)粒后，mRNA中的m7G水平恢復(fù)，但轉(zhuǎn)染METTL1酶活性突變質(zhì)粒后，細胞中的m7G水平未見增加(圖5C和5D)。這些結(jié)果表明，mRNA中的m7G修飾是由METTL1催化的。為了進一步闡明METTL1催化的mRNA內(nèi)m7G修飾的生物學作用，我們進行了RNA-seq和mRNA內(nèi)m7G AlkAniline-Seq聯(lián)合分析(圖5E和5F)。然后，我們對敲低METTL1導(dǎo)致mRNA和m7G水平下調(diào)的基因進行了功能富集分析，發(fā)現(xiàn)這些基因主要富集在癌癥等通路的轉(zhuǎn)錄失調(diào)中(圖5G)。然后我們驗證了該通路中CDK14受METTL1調(diào)控最為顯著(圖5H和圖5I)。為了弄清楚并證實METTL1對CDK14的調(diào)控依賴于甲基轉(zhuǎn)移酶活性，我們一方面通過MeRIP-qPCR闡述了沉默METTL1后CDK14 mRNA內(nèi)m7G水平下降，轉(zhuǎn)染METTL1野生型質(zhì)粒后m7G水平升高；而轉(zhuǎn)染突變METTL1質(zhì)粒后，m7G水平?jīng)]有明顯改變(圖5J和5K)。另一方面，CDK14 mRNA水平與其m7G水平的變化一致(圖5L和5M)。為了更深入地探討mRNA內(nèi)CDK14 mRNA和m7G水平變化一致的原因，我們進行了RNA降解試驗。實驗結(jié)果表明，METTL1的沉默導(dǎo)致CDK14 mRNA半衰期縮短。METTL1野生型質(zhì)粒的過表達延長了CDK14 mRNA的半衰期，而突變型METTL1質(zhì)粒的過表達對CDK14 mRNA的半衰期沒有顯著變化(圖5N和圖5O)。這些結(jié)果表明，甲基轉(zhuǎn)移酶METTL1通過在CDK14 mRNA內(nèi)引起m7G修飾來保護CDK14 mRNA免受降解。

6）METTL1通過調(diào)節(jié)CDK14的表達調(diào)控CRPC的增殖和侵襲
       為了進一步證實METTL1通過調(diào)節(jié)CDK14的表達對CRPC惡性生物學的影響，我們首先檢測了CDK14在HSPC和CRPC組織中的表達，免疫組化染色結(jié)果顯示，與HSPC患者相比，CRPC中CDK14的表達水平更高(圖6A和6B)。此外，我們還發(fā)現(xiàn)CDK14在LNCaP-AI、C4-2和22RV1中顯著上調(diào)(圖6C)。然后，我們在穩(wěn)定敲除METTL1 (shMETTL1)的細胞中過表達METTL1 (reMETTL1)，同時使用siRNA (reMETTL1 + siCDK14)抑制CDK14的表達，并比較不同組之間增殖和侵襲能力的差異(圖6D-6F)。MTT和克隆形成實驗表明，與敲低METTL1組相比，過表達METTL1后細胞增殖增強，然而，在此基礎(chǔ)上抑制CDK14表達降低了細胞增殖(圖6G – 6I)。同樣，transwell實驗顯示，過表達METTL1后，CRPC細胞的侵襲能力增強，而抑制CDK14表達則使CRPC細胞的侵襲能力受損(圖6J)。以上結(jié)果表明，METTL1可以通過CDK14間接調(diào)節(jié)CRPC細胞的增殖和侵襲能力。

7）METTL1在體內(nèi)促進CRPC的進展
       為了確定METTL1在體內(nèi)促進CRPC進展中的作用，我們使用免疫缺陷裸鼠進行皮下移植腫瘤實驗。結(jié)果表明，與對照組相比，敲除METTL1組皮下移植腫瘤生長更慢，最終體積和質(zhì)量更小。對照組裸鼠皮下移植瘤生長速度最快，體積和重量最大。同時，CTPB + shMETTL1組比DMSO+shMETTL1組生長更快，腫瘤體積和質(zhì)量更大(圖7A-7C)。通過免疫組化染色，我們發(fā)現(xiàn)METTL1抑制后CDK14和細胞增殖標志物PCNA均減少。與sh-scramble和shMETTL1組相比，CTPB飼養(yǎng)的裸鼠中CDK14和PCNA表達升高(圖7D和7E)。體內(nèi)實驗更嚴格地證實了METTL1在促進CRPC進展中的重要作用。

結(jié)論     
        METTL1在CRPC的進展中起致瘤作用。從機制上講，P300/SP1復(fù)合體促進了METTL1的轉(zhuǎn)錄激活，導(dǎo)致METTL1在CRPC中異常高表達。最后，作為m7G甲基轉(zhuǎn)移酶，METTL1通過在其內(nèi)部添加m7G修飾來保護CDK14 mRNA免受降解并最終導(dǎo)致CRPC進展。

實驗方法
TMA，IHC，WB，RT-qPCR，MTT，克隆形成實驗，transwell，m7G點印跡，Co-IP，CHIP，熒光素酶報告試驗，MeRIP，mRNA穩(wěn)定性實驗，體內(nèi)實驗。
參考文獻
Zhang M, Kan D, Zhang B, Chen X, Wang C, Chen S, Gao W, Yang Z, Li Y, Chen Y, Zhu S, Wen S, Niu Y, Shang Z. P300/SP1 complex mediating elevated METTL1 regulates CDK14 mRNA stability via internal m7G modification in CRPC. J Exp Clin Cancer Res. 2023 Aug 21;42(1):215. doi: 10.1186/s13046-023-02777-z.