看一看國(guó)自然寵兒YTHDF1如何拿到20+

       結(jié)直腸癌（CRC）是世界上最常見的癌癥之一。YTHDF1作為m⁶A閱讀器，可調(diào)控m⁶A修飾的mRNA。本研究中，作者闡明了YTHDF1在CRC腫瘤免疫微環(huán)境（TIME）中的功能和機(jī)制。他們發(fā)現(xiàn)YTHDF1通過m⁶A-p65-CXCL1/CXCR2軸促進(jìn)CRC發(fā)展，且靶向YTHDF1聯(lián)合抗PD1治療CRC具有良好的療效。該研究于2023年1月發(fā)表在《Gut》，IF：24.5。
技術(shù)路線

主要研究結(jié)果
1. YTHDF1調(diào)控CRC患者免疫抑制微環(huán)境
       IFN-γ反應(yīng)可誘導(dǎo)抗腫瘤免疫并且與免疫檢查點(diǎn)阻斷（ICB）治療有關(guān)。作者研究發(fā)現(xiàn)，在多個(gè)m⁶A調(diào)節(jié)因子中，YTHDF1與IFN-γ相關(guān)基因mRNA的表達(dá)呈現(xiàn)強(qiáng)烈的負(fù)相關(guān)（圖1A）。另一方面，CRC組織微陣列（TMA）免疫組化染色結(jié)果與TCGA數(shù)據(jù)分析結(jié)果一致，YTHDF1蛋白高表達(dá)與CD8⁺ T細(xì)胞低浸潤(rùn)有關(guān)（圖1B和1C）。這些數(shù)據(jù)均表明，YTHDF1與抗腫瘤免疫受損和ICB治療效果降低有關(guān)。
       為研究YTHDF1在調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫中的作用，作者利用CRISPR/Cas9敲除MC38（MSI-H-CRC）細(xì)胞中的Ythdf1（Ythdf1-KO），并將細(xì)胞注射到同系C57BL6小鼠中（圖1D）。他們發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組（NC）相比，Ythdf1敲除可減少腫瘤體積和重量（圖1E）。關(guān)于Ythdf1-KO是否影響TIME，作者從腫瘤中分離出CD45⁺免疫細(xì)胞，并進(jìn)行單細(xì)胞RNA-seq（scRNA-seq）（NC:1480個(gè)細(xì)胞；Ythdf1-KO:1816個(gè)細(xì)胞）。與NC組相比，Ythdf1-KO腫瘤中的粒細(xì)胞樣髓系來源抑制細(xì)胞（G-MDSCs）和中性粒細(xì)胞顯著減少，而T細(xì)胞和NK細(xì)胞大量增加（圖1F）。作者進(jìn)一步將T細(xì)胞和NK細(xì)胞分為CD4⁺T細(xì)胞、CD8⁺T細(xì)胞、NKT細(xì)胞和NK細(xì)胞亞群，與對(duì)照組相比，它們?cè)?em>Ythdf1-KO腫瘤中同時(shí)增加（圖1F）。通過檢測(cè)MDSCs功能標(biāo)志物Il1b、Arg2、Cxcr2和Ccr2，作者發(fā)現(xiàn)這些基因主要富集在Ythdf1未敲除腫瘤的MDSC細(xì)胞簇中（圖1G）。以上數(shù)據(jù)結(jié)果均支持YTHDF1在CRC中發(fā)揮免疫抑制功能。
       為驗(yàn)證scRNA-seq數(shù)據(jù)中的發(fā)現(xiàn)，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MC38同系腫瘤小鼠中腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞構(gòu)成。作者已經(jīng)證實(shí)了Ythdf1敲除顯著抑制腫瘤的體積和重量（圖1C），而流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，Ythdf1敲除降低MDSCs的同時(shí)，增加了腫瘤中CD8⁺T細(xì)胞和CD4⁺T細(xì)胞（圖1H和1I）。在MDSCs中，G-MDSCs為主要亞群，Ythdf1敲除導(dǎo)致G-MDSCs顯著減少（圖1I）。作者觀察到在Ythdf1-KO組中，功能性T細(xì)胞顯著增加，其中包括IFN-γ⁺ CD8⁺T細(xì)胞、顆粒酶B⁺ CD8⁺T細(xì)胞和IFN-γ⁺ CD4⁺T細(xì)胞，這與MDSCs發(fā)揮免疫抑制功能一致（圖1H和1J）。

圖1：YTHDF1與CRC免疫抑制微環(huán)境有關(guān)

2. Ythdf1敲除通過減少M(fèi)DSC和增加功能性T細(xì)胞誘導(dǎo)抗腫瘤免疫
       作者接下來在CT26（MSS-CRC）細(xì)胞中敲除Ythdf1，驗(yàn)證Ythdf1在抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)中的作用。如預(yù)期，Ythdf1-KO導(dǎo)致CT26同系腫瘤小鼠的腫瘤體積和重量減?。▓D2A和2B），同時(shí)，功能性T細(xì)胞增加以及MDSCs浸潤(rùn)減少（圖2C和2D）。免疫熒光染色也證實(shí)Ythdf1敲除使MC38和CT26同系腫瘤中MDSCs（CD11b⁺Gr-1⁺）浸潤(rùn)減少（圖2E）?？偠灾珻RC細(xì)胞中Ythdf1缺失減少M(fèi)DSCs并提高功能性T細(xì)胞浸潤(rùn)。這些發(fā)現(xiàn)證明YTHDF1與CD8⁺T細(xì)胞和IFN-γ相關(guān)特征有關(guān)（圖1A-C）。
       關(guān)于Ythdf1-KO中腫瘤形成減弱是否依賴于CD8⁺T細(xì)胞抗腫瘤免疫，在MC38同系腫瘤模型中，作者利用CD8抗體耗竭CD8⁺T細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CD8⁺T細(xì)胞耗竭恢復(fù)了Ythdf1-KO腫瘤生長(zhǎng)（圖2F和2G），這表明Ythdf1-KO對(duì)腫瘤的抑制部分依賴于CD8⁺T細(xì)胞。這在CT26同系腫瘤模型小鼠中得到證實(shí)， CD8抗體處理挽救了Ythdf1-KO組中腫瘤停滯生長(zhǎng)（圖2H和2I）。作者得出結(jié)論，Ythdf1敲除通過誘導(dǎo)CD8⁺T細(xì)胞依賴性抗腫瘤免疫抑制CRC生長(zhǎng)。

圖2：Ythdf1-KO減少M(fèi)DSCs的同時(shí)增加細(xì)胞毒性T細(xì)胞浸潤(rùn)

3. 腸道特異性Ythdf1敲入促進(jìn)小鼠結(jié)腸腫瘤發(fā)生并抑制抗腫瘤免疫
       為驗(yàn)證YTHDF1在自發(fā)性CRC發(fā)生中的作用，作者構(gòu)建了腸道特異性Ythdf1敲入小鼠（Ythdf1^loxp/loxpCDX2-cre），并通過AOM/DSS處理誘導(dǎo)小鼠CRC發(fā)生（圖3A）。他們發(fā)現(xiàn)，在AOM/DSS模型中，Ythdf1過表達(dá)引起結(jié)腸腫瘤的數(shù)量和尺寸增加（圖3C）。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與野生型小鼠相比，Ythdf1敲入小鼠結(jié)腸腫瘤MDSC浸潤(rùn)增加的同時(shí)，NK、CD4⁺T和CD8⁺T細(xì)胞減少（圖3D）。此外，作者還發(fā)現(xiàn)Ythdf1敲入降低了通過顆粒酶B、INF-γ和TNF-α表達(dá)鑒定的功能性T細(xì)胞占比（圖3E）。
       接下來，作者通過建立Apc^Min/+Ythdf1^loxp/loxpCDX2-cre小鼠，在Apc^Min/+造成的自發(fā)性CRC中驗(yàn)證這些結(jié)果（圖3B）。與上述結(jié)果一致，相比于野生型，腸道特異性Ythdf1敲入的Apc^Min/+小鼠生長(zhǎng)出更大的結(jié)腸腫瘤（圖3C）。腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞分析結(jié)果表明，在Ythdf1敲入與Apc^Min/+的影響下，腫瘤中NK細(xì)胞、CD4⁺T細(xì)胞和CD8⁺T細(xì)胞浸潤(rùn)顯著減少的同時(shí)MDSCs增加（圖3F）。此外，Ythdf1敲入降低了Apc^Min/+小鼠中顆粒酶B⁺、INF-γ⁺或TNF-α⁺T細(xì)胞（圖3G）?？偠灾?，這些結(jié)果均支持YTHDF1促進(jìn)免疫抑制微環(huán)境從而促進(jìn)自發(fā)性CRC。

圖3：Ythdf1-KO促進(jìn)小鼠結(jié)腸腫瘤發(fā)生并抑制抗腫瘤免疫

4. VNP-siYTHDF1靶向YTHDF1增強(qiáng)CD34⁺人源化小鼠的抗腫瘤免疫
       為證實(shí)YTHDF1在調(diào)節(jié)人類抗腫瘤免疫反應(yīng)中的作用，作者建立了CD34⁺人源化小鼠模型，這種小鼠外周血單核細(xì)胞（PBMC）>20% 人類CD45⁺細(xì)胞（圖4A）。作者使用了一種攜帶siRNA的VNPs，可以在體內(nèi)靶向YTHDF1。待腫瘤達(dá)到50-100mm³，用VNP-siNC或-siYTHDF1處理攜帶有人CRC HCT116異種移植體的人源化NSG小鼠（圖4B）。與VNP-siNC相比，VNP-siYTHDF1顯著抑制腫瘤的體積和重量（圖4B和4C）。同時(shí)，作者通過流式細(xì)胞術(shù)來分析TIME（圖4D）。發(fā)現(xiàn)VNP-siYTHDF1降低MDSC浸潤(rùn)，增加CD4⁺T細(xì)胞、CD8⁺T細(xì)胞和NK細(xì)胞的累積（圖4E）。此外，在VNP-siYTHDF1腫瘤中識(shí)別到更多的IFN-γ⁺、TNF-α⁺和顆粒酶B⁺ CD8⁺T細(xì)胞。
       作者還通過測(cè)量肝臟（丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶）和腎功能（肌酐和血尿素氮）的血清標(biāo)志物來確定VNP-siYTHDF1的安全性，而用VNP-siNC或VNPsiYTHDF1處理的小鼠沒有表現(xiàn)出異常的肝臟或腎功能指標(biāo)，這表明VNP治療具有良好的耐受性。因此，使用VNP-siYTHDF1靶向YTHDF1是增強(qiáng)人源化小鼠抗腫瘤免疫的安全有效手段。

圖4：VNP-siYTHDF1增強(qiáng)CD34⁺人源化小鼠抗腫瘤免疫

5. YTHDF1促進(jìn)p65翻譯激活TNF-κB信號(hào)傳導(dǎo)
       為鑒定YTHDF1引發(fā)免疫抑制的分子機(jī)制，作者對(duì)YTHDF1敲除或非敲除CRC細(xì)胞進(jìn)行RNA-seq和Ribo-seq。其結(jié)果表明，YTHDF1敲除或非敲除之間的差異表達(dá)基因主要富集于TNF和NF-κB信號(hào)通路中。此外，Ribo-seq數(shù)據(jù)顯示YTHDF1缺失與TNF信號(hào)失活顯著相關(guān)；相應(yīng)地，YTHDF1敲除降低了參與TNF信號(hào)傳導(dǎo)的核糖體保護(hù)片段基因的豐度（圖5A）。因此得出結(jié)論，YTHDF1可以通過促進(jìn)蛋白質(zhì)翻譯來調(diào)節(jié)TNF-κB信號(hào)傳導(dǎo)。YTHDF1作為m⁶A閱讀器發(fā)揮功能，作者接下來對(duì)m⁶A進(jìn)行MeRIP-seq確定m⁶A修飾的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。通過篩選參與TNF信號(hào)傳導(dǎo)的mRNA中的m⁶A峰，鑒定出兩個(gè)靠近p65 mRNA終止密碼子的m⁶A位點(diǎn)（圖5B），MeRIP-qPCR得到了同樣的驗(yàn)證結(jié)果（圖5C）。重要的是，作者通過RIP測(cè)序和抗YTHDF1抗體的RIP-qPCR鑒定到Y(jié)THDF1和p65 mRNA之間的直接相互作用（圖5D）。這說明p65 mRNA是YTHDF1的直接靶點(diǎn)。作者還發(fā)現(xiàn)，Ythdf1敲除在蛋白翻譯水平上減弱了CT26和MC38細(xì)胞中p65蛋白的表達(dá)，尤其是核p65，但不影響NF-κB途徑的其他調(diào)節(jié)因子的表達(dá)，比如IKKα和IκBα（圖5E）。人CRC細(xì)胞野生型YTHDF1過表達(dá)提高p65蛋白表達(dá)，相反地，YTHDF1基因敲低降低人CRC細(xì)胞中p65蛋白表達(dá)（圖5F）?？筜THDF1的RIP-qPCR也證實(shí)人CRC細(xì)胞中YTHDF1和p65 mRNA之間的直接相互作用（圖5G）。接下來，作者回歸體內(nèi)驗(yàn)證YTHDF1和p65的相關(guān)性。在Ythdf1敲入小鼠中，p65和磷酸化p65蛋白在結(jié)腸腫瘤中均有增加（圖5H）。綜上所述之，YTHDF1在體外和體內(nèi)均促進(jìn)p65蛋白表達(dá)以激活TNF和NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)。

圖5：YTHDF1通過促進(jìn)p65 mRNA翻譯促進(jìn)CRC中TNF-NF-kB信號(hào)傳導(dǎo)

6. YTHDF1通過p65-CXCL1軸促進(jìn)MDSC遷移
       為了解YTHDF1誘導(dǎo)的p65與其免疫抑制之間的聯(lián)系，作者進(jìn)行了細(xì)胞因子多重免疫測(cè)定，在CRC細(xì)胞、腫瘤裂解物的條件培養(yǎng)基和患有同系腫瘤的小鼠血清中檢測(cè)到23種不同的小鼠細(xì)胞因子。在這些細(xì)胞因子中，經(jīng)ELISA測(cè)定證實(shí)Ythdf1-KO持續(xù)降低CXCL1（圖6A和6B）。CXCL1是NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)，它與受體CXCR2結(jié)合促進(jìn)MDSC趨化。Ythdf1-KO在CRC TIME中減少M(fèi)DSC浸潤(rùn)，為驗(yàn)證Ythdf1是否調(diào)節(jié)MDSC遷移，作者進(jìn)行了體外MDSC遷移測(cè)定。他們發(fā)現(xiàn)野生型CRC細(xì)胞的條件培養(yǎng)基增強(qiáng)了MDSC的遷移，Ythdf1敲除后這種遷移效果減弱（圖6C）。CXCR2抑制劑SB265610阻斷CXCL1-CXCR2結(jié)合從而消除對(duì)照組和Ythdf1-KO培養(yǎng)上清在介導(dǎo)MDSC遷移方面的差異（圖6C）。YTHDF1是通過CXCL1/CXCR2軸促進(jìn)MDSC遷移。那么，YTHDF1是否可以調(diào)節(jié)Cxcl1 mRNA的表達(dá)呢？與預(yù)期一致，Ythdf1敲除顯著抑制小鼠和人CRC細(xì)胞系中Cxcl1 mRNA表達(dá)水平（圖6D）。
       作者接下來研究YTHDF1是否影響MDSC功能。從MC38同系腫瘤中分離出CD11b⁺Gr-1⁺ MDSCs與T細(xì)胞體外共培養(yǎng)（圖6E）。從對(duì)照腫瘤中分離的MDSCs抑制T細(xì)胞增殖；然而，與對(duì)照組MDSCs相比，Ythdf1-KO腫瘤MDSCs對(duì)CD8⁺T細(xì)胞和CD4⁺T細(xì)胞增殖表現(xiàn)出較低的抑制作用（圖6F和6G）。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了之前所報(bào)道的MDSCs對(duì)關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞（包括CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞）的免疫抑制功能，并支持CRC通過表達(dá)YTHDF1募集功能性MDSCs。

圖6：Ythdf1缺失通過降低CXCL1分泌促進(jìn)MDSCs減少

7. YTHDF1是CRC免疫療法的潛在治療靶點(diǎn)
       MDSC浸潤(rùn)減少與各種類型癌癥的免疫治療效果增強(qiáng)有關(guān)，作者嘗試靶向YTHDF1是否增強(qiáng)CRC中抗PD1治療。作者發(fā)現(xiàn)敲除Ythdf1顯著提高抗PD1在MC38（MSI-H）同系腫瘤中的療效，并延長(zhǎng)荷瘤小鼠生存率（圖7A）。作者進(jìn)一步利用VNPs將特異性Ythdf1-siRNA遞送到腫瘤中。當(dāng)MC38同系腫瘤達(dá)到50～100mm³時(shí)，用VNP-siYthdf1（或VNP-siNC）和抗PD1（或IgG）處理小鼠。與VNP-siNC相比，VNP-siYthdf1顯著抑制MC38腫瘤生長(zhǎng)，而VNP-siYthdf1與抗PD1聯(lián)合處理對(duì)腫瘤生長(zhǎng)產(chǎn)生最強(qiáng)抑制作用（圖7B，C）。
       基于同系CT26（MSS CRC）腫瘤模型，作者同樣探討了靶向YTHDF1能否解決MSS CRC中抗PD1的耐藥性。將Ythdf1敲除CT26細(xì)胞注射同系腫瘤小鼠，并用抗PD1處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ythdf1敲除顯著增強(qiáng)抗PD1在CT26同系腫瘤中的治療效果（圖7D和7E）。
       流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，在CT26和MC38同系模型中，Ythdf1沉默與抗PD1聯(lián)合處理顯著增加了腫瘤功能性CD8⁺T細(xì)胞浸潤(rùn)，包括IFN-γ⁺ CD8⁺T細(xì)胞和顆粒酶B⁺ CD8⁺T細(xì)胞。此外，二者聯(lián)合處理顯著降低MDSCs積累，并誘導(dǎo)CD4⁺T細(xì)胞和CD8⁺T細(xì)胞。因此，靶向YTHDF1不僅增強(qiáng)ICB在MSI-H CRC中的治療效果，而且通過抑制MDSCs募集和改善CD8+T細(xì)胞的功能，克服MSS CRC中ICB抵抗。

圖7：YTHDF1增強(qiáng)MSI-H和MSS CRC的抗PD1阻斷治療

結(jié)論
       綜上所述，CRC中YTHDF1表達(dá)通過激活m⁶A-p65-CXCL1軸招募免疫抑制性MDSCs抑制T細(xì)胞，從而促進(jìn)CRC。靶向YTHDF1聯(lián)合抗PD1治療CRC具有治療前景，這證實(shí)YTHDF1是CRC潛在的治療靶點(diǎn)。

實(shí)驗(yàn)方法
細(xì)胞培養(yǎng)，免疫組化，流式細(xì)胞術(shù)，免疫熒光，CRISPR/Cas9，scRNA-seq，VPN-siRNA, Western blot, RIP-seq, Ribo-seq，RIP-q PCR, MeRIP,
參考文獻(xiàn)
Bao Y, Zhai J, Chen H, Wong CC, Liang C, Ding Y, Huang D, Gou H, Chen D, Pan Y, Kang W, To KF, Yu J. Targeting m6A reader YTHDF1 augments antitumour immunity and boosts anti-PD-1 efficacy in colorectal cancer. Gut. 2023 Aug;72(8):1497-1509. doi: 10.1136/gutjnl-2022-328845. Epub 2023 Jan 30. PMID: 36717220.