基于小鼠結(jié)直腸癌模型和類器官的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析揭示晚期結(jié)直腸癌治療新靶點(diǎn)

       結(jié)直腸癌（CRC）是癌癥相關(guān)死亡的第三大原因，大多數(shù)（>80%）CRC是由腫瘤抑制因子APC的功能喪失（LOF）突變驅(qū)動(dòng)的，導(dǎo)致典型WNT途徑效應(yīng)因子β-連環(huán)蛋白的組成性激活。本文通過在對APC失活的結(jié)腸類器官進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，并將基因表達(dá)變化與幾種結(jié)腸癌小鼠模型（包括炎癥誘導(dǎo)的CRC模型）的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了交叉參考，發(fā)現(xiàn)了棕櫚油酰-β蛋白羧酸酯酶（Notum）在APC損失時(shí)被急性誘導(dǎo)并且在這些模型中保持升高，采用體外測定、體內(nèi)內(nèi)窺鏡引導(dǎo)的原位類器官植入測定和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析來表征Notum活性的作用。發(fā)現(xiàn)了靶向細(xì)胞外酶Notum的單一藥劑在治療臨床前小鼠模型和人類類器官中的高度侵襲性轉(zhuǎn)移性腺癌中的重要作用。本文于2023年8月17日發(fā)表于《gut》上，IF=24.5。

技術(shù)路線

主要研究內(nèi)容

1.進(jìn)展期結(jié)直腸腺癌中NOTUM的致癌活性

       在APC失活后的結(jié)腸類器官進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，并對幾種結(jié)腸癌小鼠模型的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了交叉參考基因表達(dá)變化（圖1A）。在這些模型中表達(dá)在APC損失時(shí)被急性誘導(dǎo)并且保持升高的大約150個(gè)基因中，棕櫚油?；?α蛋白羧酸酯酶Notum脫穎而出，因?yàn)樗惹吧婕跋倭鲂纬傻钠鹗?。在小鼠腫瘤中證實(shí)了Notum的高表達(dá)，其中其表達(dá)限于上皮/腫瘤細(xì)胞（圖1B）。還證實(shí)了Notum對體內(nèi)結(jié)腸上皮中急性遺傳消融Apc或β-連環(huán)蛋白激活的強(qiáng)烈激活。此外，相對于正常組織，在人癌癥基因組Atlas 3中的結(jié)腸癌和直腸癌（分別為TCGA結(jié)腸腺癌（COAD）和直腸腺癌（READ））中NOTUM表達(dá)顯著升高（圖1C）。同時(shí)，也檢查了原代人COAD 的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組譜，并證實(shí)NOTUM表達(dá)主要限于癌細(xì)胞，并且?guī)缀跬耆淮嬖谟谀[瘤微環(huán)境中（圖1D）。最初評估了NOTUM在具有侵襲性和轉(zhuǎn)移能力的COAD小鼠模型中的功能：在引入靶向Notum的gRNA時(shí)，類腫瘤培養(yǎng)物生長較慢，并且具有顯著降低的克隆類腫瘤接種效率（單細(xì)胞接種新類腫瘤的能力，代表腫瘤啟動(dòng)能力）（圖1E-H）。為了測試NOTUM在體內(nèi)是否具有相似的致癌活性，用APKS類腫瘤和NOTUM LOF進(jìn)行了皮下和原位腫瘤形成測定。這些測定揭示了NOTUM LOF導(dǎo)致原發(fā)性腫瘤生長的顯著降低，并且在原位模型中，肝臟中的大轉(zhuǎn)移的完全阻斷（圖1 I、J）。這些結(jié)果揭示了NOTUM在CRC中的致癌活性。

圖1：進(jìn)展期結(jié)直腸腺癌中NOTUM的致癌活性

2.NOTUM維持對APC失活的腫瘤抑制活性

       通過CRISPR/Cas9在大量野生型結(jié)腸類器官培養(yǎng)中的NOTUM LOF導(dǎo)致克隆類器官接種效率、類器官生長和β-連環(huán)蛋白靶基因表達(dá)的顯著增加（圖2A-C），并且NOTUM過表達(dá)具有相反的作用（圖2D、E），表明NOTUM負(fù)調(diào)節(jié)正常腸干細(xì)胞區(qū)室中的經(jīng)典WNT途徑。在具有由CRISPR/ Cas9（ApcΔ）引入的失活A(yù)pc突變的腺瘤類腫瘤中進(jìn)行了類似的實(shí)驗(yàn)。值得注意的是，ApcΔ 類腫瘤中的NOTUM GOF導(dǎo)致克隆接種效率和增殖降低，并且NOTUM LOF具有相反的作用（圖2F-K）。因此，想要探討NOTUM丟失如何影響ApcΔ類腫瘤在體內(nèi)的發(fā)生。內(nèi)窺鏡引導(dǎo)的ApcΔ腫瘤樣細(xì)胞原位植入證實(shí)，NOTUM在不存在APC功能的情況下保留了有效的腫瘤抑制活性，ApcΔ腫瘤樣細(xì)胞僅在結(jié)腸上皮中形成小腺瘤。相比之下，NOTUM的丟失顯著增加原發(fā)性腫瘤大小并促進(jìn)轉(zhuǎn)移（圖2L-N）。因此，NOTUM在APC失活驅(qū)動(dòng)的腺瘤性病變中保留了有效的腫瘤抑制活性。

圖2：NOTUM在正常和APC突變小鼠結(jié)腸類腫瘤中具有強(qiáng)效的腫瘤抑制活性

3.NOTUM的新的腫瘤抑制和致癌功能需要細(xì)胞外酶活性

       由于在ApcΔ類腫瘤和更具侵襲性的AP/APK/APKS類腫瘤中的發(fā)現(xiàn)基于哺乳動(dòng)物中NOTUM功能模型是出乎意料的，因此接下來測試了NOTUM在Apc Δ類腫瘤中的腫瘤抑制活性和AP/APK/APKS類腫瘤中的致癌活性是否需要酶活性。我們在小鼠Apc Δ類腫瘤中過表達(dá)野生型或催化死亡（S239 A）NOTUM，并且發(fā)現(xiàn)NOTUM S239A不能抑制增殖和克隆接種效率（圖3A-C ）。相反的，在亞純型APKS亞克隆中過表達(dá)野生型和S239A NOTUM，并且發(fā)現(xiàn)，雖然野生型NOTUM增加類腫瘤接種效率和增殖，但催化死亡的NOTUM沒有增加（圖3D-F）。因此，催化活性對于NOTUM在ApcΔ類腫瘤中的腫瘤抑制活性和APKS類腫瘤中的致癌活性都是必需的。在Notum亞型APKS類腫瘤中用mCherry標(biāo)記一半的培養(yǎng)物，另一半用表達(dá)GFP和NOTUM或僅表達(dá)GFP的載體標(biāo)記。與ApcΔ類腫瘤一樣，我們發(fā)現(xiàn)GFP+，NOTUM過表達(dá)細(xì)胞能夠驅(qū)動(dòng)mCherry+細(xì)胞非-細(xì)胞自主增殖，以及GFP+APKS細(xì)胞的細(xì)胞-細(xì)胞自主增殖（圖3G，H）。因此得出結(jié)論，NOTUM的新致癌活性需要催化活性，并發(fā)生在細(xì)胞外。

圖3：NOTUM的腫瘤抑制和致癌功能需要催化活性

4.Apc和Trp53失活協(xié)同賦予NOTUM致癌活性

       已經(jīng)確定NOTUM酶活性在野生型和Apc?類腫瘤中具有腫瘤抑制性，并且在AP/APK/APKS類腫瘤中具有致癌性，因此推斷基因開關(guān)必須是NOTUM功能逆轉(zhuǎn)的基礎(chǔ)，并且P53失活可能是原因。Notum表達(dá)在Apc失活時(shí)強(qiáng)烈上調(diào)，并且在致癌Trp53、Kras和Smad 4突變積累時(shí)保持升高（圖4A）。相比之下，單獨(dú)失活Trp53對Notum表達(dá)幾乎沒有影響。通過測定Notum LOF和GOF在Apc?、Trp53?和AP類腫瘤中的作用，并且顯著地發(fā)現(xiàn)，在Apc?和Trp53?類腫瘤中，NOTUM活性保持腫瘤抑制性，但是這些突變一起協(xié)同作用以賦予NOTUM致癌活性（圖4B-F）。通過收集來自COAD和來自TCGA的READ的患者數(shù)據(jù)，并基于具有APC突變但野生型TP53的患者或攜帶APC和TP53突變的患者中的NOTUM表達(dá)對患者無疾病生存期進(jìn)行分層。與實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)一致，高NOTUM表達(dá)預(yù)測僅在TP53突變型腫瘤中無疾病存活的顯著降低，而在TP53野生型腫瘤中無疾病存活的顯著降低（圖4G）。為了描繪NOTUM的腫瘤抑制性到致癌轉(zhuǎn)換的分子機(jī)制，進(jìn)行了具有或不具有NOTUM LOF的ApcΔ和AP培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)錄組譜分析（圖4 H）。在ApcΔ和AP突變體培養(yǎng)物之間受NOTUM LOF影響的通路包括mTORC1和E2F信號傳導(dǎo)（在ApcΔ中由NOTUM LOF誘導(dǎo)，而不是AP）、干擾素α/γ信號傳導(dǎo)（在AP中由NOTUM LOF誘導(dǎo)，在AP中抑制）和TGF β（在AP中由NOTUM LOF誘導(dǎo)，而不是在Apc Δ中由NOTUM LOF誘導(dǎo)）（圖4 I）?？傊?，這些結(jié)果表明了Apc和Trp53失活協(xié)同賦予NOTUM致癌活性。

圖4：APC和P53丟失協(xié)同作用將NOTUM從腫瘤抑制因子轉(zhuǎn)化為癌蛋白

5.NOTUM的腫瘤抑制功能與致癌功能可以通過GPC活性差異來解釋

       為了探究磷脂酰肌醇蛋白聚糖Gpc 1/4基因失活是否會(huì)影響表型NOTUM活性。GPC4僅在AP類腫瘤中顯示腫瘤抑制活性，在Apc Δ類腫瘤中沒有作用（圖5A-B）。表達(dá)低但可檢測的Gpc 6在任一基因型中幾乎沒有影響或沒有影響（圖5A-B）。為了將NOTUM功能、GPC蛋白和信號傳導(dǎo)通路活性聯(lián)系起來，敲低了小鼠ApcΔ和AP類腫瘤中的Notum，并檢查通路活性和細(xì)胞相關(guān)的GPC蛋白水平。Apc Δ 類腫瘤中的Notum敲低導(dǎo)致mTORC1信號傳導(dǎo)增加，與GPC1蛋白的積累偶聯(lián)，對TGF β途徑活性沒有明顯變化（圖5C）。相比之下，AP類腫瘤中Notum敲低導(dǎo)致TGF β途徑活性增加和GPC4蛋白積累，而對mTORC1活性沒有明顯影響（圖5D）。這些實(shí)驗(yàn)測定了全細(xì)胞裂解物中的GPC蛋白水平，并支持一種模型，其中Notum LOF阻止GPC從細(xì)胞表面切割導(dǎo)致其積累。為了進(jìn)一步探索這種可能性，檢測了Notum抑制后Apc Δ和AP類腫瘤的培養(yǎng)基上清液中游離N-β末端GPC1和GPC4的水平。相對于上清液中的GPC1，ApcΔ類腫瘤中的NOTUM LOF增加了細(xì)胞相關(guān)GPC1（圖5E）。相反，AP類腫瘤中的Notum LOF導(dǎo)致細(xì)胞相關(guān)GPC4增加，同時(shí)上清液中GPC4減少（圖5E）。有趣的是，NOTUM蛋白本身與細(xì)胞裂解物而不是上清液相關(guān)聯(lián)，這一發(fā)現(xiàn)與NOTUM建立的胞外酶促作用相結(jié)合，表明NOTUM與胞外細(xì)胞表面物理相關(guān)聯(lián)（圖5E）。為了進(jìn)一步測試GPC操作的效果是否與NOTUM分別從Apc Δ和AP類腫瘤表面切割GPC1和4一致，分析了GPC失活對受NOTUM活性差異影響的途徑的影響。事實(shí)上，小鼠Apc?類腫瘤中的GPC 1失活抑制mTORC1活性，小鼠AP類腫瘤中的GPC 4失活抑制TGF β活性，與NOTUM操作的效果一致（圖5F-G）。最后，為了確認(rèn)GPC1或GPC4和受影響的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑上游的受體之間的直接相互作用。GPC1在Apc Δ類腫瘤中的免疫沉淀共免疫沉淀IGF1Rβ，一種與結(jié)腸癌和化療耐藥性有關(guān)的mTORC 1活化上游的IGF受體（圖5 H）。在AP類腫瘤中，GPC4的免疫共沉淀TGF β通路上游的TGFβR1（圖5I）。添加小分子NOTUM抑制劑ABC 99似乎增強(qiáng)了這些相互作用（圖5 H-I）。因此，研究了NOTUM對通過TAK1-p38 a信號轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)的非典型TGFβ途徑活性的影響。與在AP類腫瘤中的發(fā)現(xiàn)一致，NOTUM抑制導(dǎo)致APKS細(xì)胞裂解物中GPC4增加（圖5 J）。進(jìn)一步與NOTUM作為TGFβ信號傳導(dǎo)負(fù)調(diào)節(jié)劑的作用一致，APKS類腫瘤中的Notum抑制導(dǎo)致TGFβ活化激酶（TAK 1）的磷酸化和下游p38a磷酸化增加（圖5 J）。觀察到AP和APKS類腫瘤中的p38a抑制增加增殖并抑制細(xì)胞死亡（圖5 K）。這些發(fā)現(xiàn)支持了NOTUM可能在腺癌中發(fā)揮致癌作用的觀點(diǎn)，至少部分是通過抑制非α經(jīng)典TGFβ途徑的腫瘤抑制活性。

圖5：磷脂酰肌醇蛋白聚糖介導(dǎo)Apc突變體與Apc/Trp 53突變體小鼠類腫瘤中NOTUM活性的差異效應(yīng)

6.藥理學(xué)NOTUM抑制在轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌的臨床前動(dòng)物模型中有效

       最初證實(shí)ABC99處理表型模仿了Apc?和APKS類腫瘤中NOTUM的遺傳抑制（圖6A和B）。接下來，將APKS類瘤通過內(nèi)窺鏡引導(dǎo)的注射將原位植入到同系小鼠的結(jié)腸粘膜中，并允許腫瘤移植并生長1個(gè)月，之后將小鼠隨機(jī)分配至媒介物對照或ABC 99組。然后用ABC 99或媒介物對照再處理小鼠4周。ABC 99治療在很大程度上阻止了原發(fā)性腫瘤生長，BLI和腫瘤重量相對于對照動(dòng)物顯著降低（圖6C-E）。值得注意的是，NOTUM抑制幾乎完全抑制了該高度侵襲性CRC模型中的肝臟和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（圖6 F和G），并且ABC 99-γ處理的原發(fā)性和罕見轉(zhuǎn)移性病變在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)表現(xiàn)出顯著的細(xì)胞增殖抑制（圖6 H）。構(gòu)建了另一組具有原位APKS腫瘤的小鼠，如前所述允許它們移植1個(gè)月，然后開始ABC99或媒介物對照治療并監(jiān)測存活長達(dá)4個(gè)月。值得注意的是，雖然媒介物對照組-β處理的小鼠在該時(shí)間過程中變得垂死，但ABC99-β處理的組在該實(shí)驗(yàn)的持續(xù)時(shí)間內(nèi)均未死于疾?。▓D6 I）。

圖6：NOTUM的小分子抑制劑抑制結(jié)直腸癌小鼠模型中的腫瘤生長和轉(zhuǎn)移

結(jié)論
       本研究發(fā)現(xiàn)了NOTUM在APC缺失腺瘤中保留腫瘤抑制活性，另外，在進(jìn)展為腺癌伴P53丟失時(shí)，NOTUM成為專性癌基因。這些表型是不依賴于Wnt-β的，分別由NOTUM在早期階段與晚期階段疾病中對Gpc1和4的不同活性引起。最終，臨床前小鼠模型和人類器官培養(yǎng)物證明，NOTUM的藥理學(xué)抑制在阻止原發(fā)性腺癌生長和抑制遠(yuǎn)端器官的轉(zhuǎn)移性定殖方面是高度有效的。因此，靶向細(xì)胞外酶NOTUM的單一藥物在治療臨床前小鼠模型和人類類器官中的高度侵襲性轉(zhuǎn)移性腺癌中是有效的，這使得NOTUM及其磷脂酰肌醇聚糖靶向晚期CRC中的治療弱點(diǎn)。

實(shí)驗(yàn)方法
構(gòu)建正常和腫瘤類器官，AOM/DSS結(jié)直腸癌模型，ApcMin/+小鼠模型，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，原位移植瘤模型，原發(fā)腫瘤模型，Westernblot，MTT增殖實(shí)驗(yàn)，慢病毒感染，免疫熒光實(shí)驗(yàn)，流式細(xì)胞術(shù)，免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，生物發(fā)光成像實(shí)驗(yàn)，生存分析。
參考文獻(xiàn)
Tian, Y., Wang, X., Cramer, Z., Rhoades, J., Estep, K. N., Ma, X., Adams-Tzivelekidis, S., Katona, B. W., Johnson, F. B., Yu, Z., Blanco, M. A., Lengner, C. J., & Li, N. (2023). APC and P53 mutations synergise to create a therapeutic vulnerability to NOTUM inhibition in advanced colorectal cancer. Gut, gutjnl-2022-329140. Advance online publication. https://doi.org/10.1136/gutjnl-2022-329140