預(yù)測(cè)HCC放射敏感性的新生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)！還與鐵死亡相關(guān)！

       放射耐藥性是肝細(xì)胞癌（HCC）放療失敗的罪魁禍?zhǔn)?。?duì)HCC中放射耐藥的調(diào)控基因和潛在機(jī)制的見(jiàn)解有待深入研究。本研究通過(guò)RNA-seq和生物信息學(xué)分析篩選出細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制因子2（SOCS2）作為HCC放療的潛在預(yù)后預(yù)測(cè)因子，隨后確定其在體內(nèi)或體外促進(jìn)HCC的放射敏感性。同時(shí)，測(cè)定溶質(zhì)載體家族7成員11（SLC7A11）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4（GPX4）的鐵死亡負(fù)調(diào)節(jié)蛋白、細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化和Fe²⁺濃度表明，高水平的鐵死亡有助于HCC的放射增敏。此外，SOCS2和SLC7A11在具有不同放射敏感性的HCC臨床組織和腫瘤異種移植腫瘤中表達(dá)相反。在機(jī)制上，SLC7A11的N端結(jié)構(gòu)域被SOCS2的SH2結(jié)構(gòu)域特異性識(shí)別。而SOCS162-BOX區(qū)域的L162和C166可以結(jié)合伸長(zhǎng)蛋白B/C化合物以共同形成SOCS2/伸長(zhǎng)蛋白B/C復(fù)合物以募集泛素分子。本文中，SOCS2作為將附著的泛素轉(zhuǎn)移到SLC7A11的橋梁，促進(jìn)了K48連接的多泛素化降解SLC7A11，最終導(dǎo)致HCC的鐵死亡和放射增敏的發(fā)生。綜上所述，本研究首次證實(shí)高表達(dá)的SOCS2是通過(guò)促進(jìn)SLC7A11的泛素化降解和促進(jìn)鐵死亡來(lái)預(yù)測(cè)HCC放射敏感性的生物標(biāo)志物之一，這表明靶向SOCS2可以提高HCC放療的效率并改善患者的預(yù)后。本文于2023年1月發(fā)表在《Cell death and differentiation》IF:12.4期刊上。
技術(shù)路線

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1、SOCS2與肝細(xì)胞癌的放射敏感性呈負(fù)相關(guān)
       文章首先由親本HCC細(xì)胞系SK-Hep-1和HepG2構(gòu)建得到兩種放射抗性HCC細(xì)胞系SK-Hep-1R和HepG2R，敏感性增強(qiáng)比（SER）分別為1.18和1.25（圖1A）。為確定參與HCC放射抗性的潛在基因，通過(guò)RNA-seq分析探索SK-Hep-1和SK-Hep-1R細(xì)胞之間的差異mRNA譜，鑒定總共255個(gè)mRNA。其中，189個(gè)mRNA上調(diào)，66個(gè)mRNA下調(diào)（圖1B）。此外，通過(guò)GEPIA和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的分析發(fā)現(xiàn)，與正常肝組織相比，HCC組織中有5856個(gè)基因差異表達(dá)（圖1C），包括4282個(gè)上調(diào)基因和1572個(gè)下調(diào)基因。隨后作者根據(jù)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)將上述差異表達(dá)基因（DEGs）與與HCC預(yù)后相關(guān)的存活基因結(jié)合起來(lái)，尋找調(diào)節(jié)HCC放射抗性和預(yù)后的DEGs。Venny分析顯示只有兩個(gè)基因，SOCS2和SMOX，在這些數(shù)據(jù)集中同時(shí)下調(diào)或上調(diào)（圖1D）。經(jīng)檢測(cè)，與正常組織和SK-Hep-1細(xì)胞相比，HCC組織和放射抗性SK-Hep-1R細(xì)胞中的SOCS2基因顯著降低（圖1E），而根據(jù)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)的Kaplan-Meier總生存期（OS）分析顯示，SOCS2的低表達(dá)是指HCC患者預(yù)后不良（圖1F）。此外，與正常組織和SK-Hep-1細(xì)胞相比，HCC組織和SK-Hep-1R細(xì)胞中SMOX基因增加（圖1E），升高的SMOX表明HCC患者預(yù)后不良。

圖1 SOCS2的過(guò)表達(dá)與HCC的放射增敏有關(guān)

       為進(jìn)一步證明這兩個(gè)基因在肝癌發(fā)生和發(fā)展中的作用，作者應(yīng)用HCCDB數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行進(jìn)一步的分析。發(fā)現(xiàn)SOCS2在腫瘤組織中的mRNA表達(dá)顯著低于鄰近正常組織（圖1G），表明SOCS2的高表達(dá)抑制HCC的發(fā)生和進(jìn)展。SMOX的HCC調(diào)節(jié)的一致性比SOCS2差，因此后續(xù)研究選用SOCS2作為肝癌放射抗性的潛在基因。此外，與正常肝臟樣本相比，HCC IV期SOCS2表達(dá)水平低于I，II和III期（圖1H），這與低SOCS2表達(dá)患者預(yù)后不良的現(xiàn)象一致。為確定SOCS2是否直接介導(dǎo)放療后HCC的預(yù)后，該研究通過(guò)免疫熒光對(duì)放射敏感性肝癌患者（HCC-S）和放射抗性肝癌患者（HCC-R）的腫瘤組織中SOCS2的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)放射抗性組織的SOCS2表達(dá)較低（圖1I）?？傊?，這些結(jié)果表明SOCS2可能作為一種抑癌基因來(lái)抑制肝癌的進(jìn)展和放射抗性。
2、過(guò)表達(dá)SOCS2能提高HCC的體內(nèi)外放射敏感性
       接下來(lái)，作者檢測(cè)SOCS2與肝癌細(xì)胞放射敏感性的關(guān)系。WB分析表明SOCS2在SK-Hep-1，SK-Hep-1R，HepG2和HepG2R細(xì)胞中有序下降（圖2A），與它們的放射敏感性一致（圖1A）。為闡明SOCS2的功能，用lvSOCS2或siSOCS2轉(zhuǎn)染HCC細(xì)胞以有效地增強(qiáng)或減少SOCS2的表達(dá)（圖2B，C）。過(guò)表達(dá)SOCS2降低SK-Hep-1和HepG2細(xì)胞的抗輻射能力，SER分別為1.11和1.16（圖2D）。相反，敲除SOCS2增加了HCC細(xì)胞的抗輻射能力，SER分別為0.86和0.89（圖2E）。
       為研究是否可以在體內(nèi)觀察到同樣的現(xiàn)象，作者對(duì)小鼠進(jìn)行異種移植腫瘤實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)放射（irradiation，IR）會(huì)引起腫瘤體積的減少，且在SK-Hep-1中比在SK-Hep-1R細(xì)胞中更明顯（圖2F，H），而過(guò)表達(dá)SOCS2會(huì)導(dǎo)致IR后腫瘤體積進(jìn)一步減少（圖2G，I）。
       由于已有研究表明輻射會(huì)誘導(dǎo)鐵死亡，所以作者進(jìn)一步研究鐵死亡是否在腫瘤的放射敏感性中起作用。鐵死亡的特征是細(xì)胞毒性脂質(zhì)過(guò)氧化物的積累。鐵死亡及其調(diào)節(jié)蛋白，如谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4（GPX4）、溶質(zhì)載體家族7成員11（SLC7A11）和P53在肝癌中起關(guān)鍵作用。免疫組織化學(xué)（IHC）檢測(cè)未照射和IR后12h異種移植腫瘤中SOCS2和鐵死亡蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)IR增加SOCS2和鐵死亡標(biāo)記物（4-HNE）的表達(dá)，但抑制GPX4和SLC7A11的表達(dá)（圖2J）。此外，過(guò)表達(dá)SOCS2的異種移植腫瘤中GPX4和SLC7A11表達(dá)量降低，而4-HNE表達(dá)量升高（圖2J）。這些結(jié)果表明輻射誘導(dǎo)與過(guò)表達(dá)SOCS2都能出現(xiàn)鐵死亡。證明SOCS2可能通過(guò)誘導(dǎo)鐵死亡而促進(jìn)HCC的放射增敏作用。

圖2 過(guò)表達(dá)SOCS2提高HCC的體內(nèi)外放射敏感性

3、鐵死亡促進(jìn)HCC組織和細(xì)胞的放射增敏作用
       為進(jìn)一步驗(yàn)證上述推測(cè)，作者通過(guò)免疫熒光分析GPX4和SLC7A11在HCC臨床組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)放射敏感組織GPX4和SLC7A11表達(dá)水平更低，表明具有更高水平的鐵死亡（圖3A）。接著WB檢測(cè)HCC細(xì)胞中GPX4和SLC7A11的表達(dá)水平，同樣發(fā)現(xiàn)GPX4和SLC7A11表達(dá)隨著細(xì)胞對(duì)IR的抗性而增強(qiáng)（圖3B）。接下來(lái)，liperfluo（脂質(zhì)過(guò)氧化物熒光探針）免疫熒光結(jié)果顯示，氫過(guò)氧化物脂質(zhì)水平隨著HCC放射敏感性增加，且IR后升高（圖3C，D）。這些結(jié)果提示放射抗性HCC細(xì)胞具有較低的鐵死亡水平。

圖3增強(qiáng)的鐵濃度導(dǎo)致HCC的放射增敏作用

       
       為進(jìn)一步檢測(cè)鐵死亡是否進(jìn)行HCC放射增敏，該研究使用RSL3（GPX4的抑制劑）促進(jìn)鐵死亡的產(chǎn)生，WB檢測(cè)發(fā)現(xiàn)RSL3處理后SK-Hep-1和HepG2細(xì)胞的放射敏感性增加（圖3E），而用RSL3處理siSOCS2轉(zhuǎn)染的HCC細(xì)胞后，放射增敏作用隨GPX4表達(dá)下降而降低（圖3F，G，H，I）?？傊?strong>鐵死亡有助于HCC細(xì)胞的放射增敏作用，而RSL3誘導(dǎo)的鐵死亡可以逆轉(zhuǎn)SOCS2抑制后獲得的放射抗性。
4、SOCS2與鐵死亡正相關(guān)
       由于鐵死亡和SOCS2都有助于HCC的放射增敏，而圖2J暗示SOCS2促進(jìn)鐵死亡，因此作者試圖深入探討SOCS2與鐵死亡之間的關(guān)系。通過(guò)檢測(cè)IR 0~24h內(nèi)HCC細(xì)胞中SOCS2和GPX4的蛋白表達(dá)水平變化，發(fā)現(xiàn)與未照射的細(xì)胞相比，在IR后24小時(shí)內(nèi)SOCS2增加，而GPX4減少，在4小時(shí)內(nèi)變化最明顯（圖4A）。接下來(lái)測(cè)量未照射或IR后4小時(shí)細(xì)胞中的蛋白質(zhì)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與GPX4和SLC7A11表達(dá)相反，SOCS2表達(dá)量隨著放射抗性的增加而下降（圖4B）。此外，無(wú)論在未照射和IR的細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)SOCS2都會(huì)抑制GPX4和SLC7A11的表達(dá)（圖4C，D）。
       上述結(jié)果表明SOCS2在蛋白質(zhì)水平上促進(jìn)鐵死亡的發(fā)生，因此該研究進(jìn)一步探討SOCS2與鐵死亡的特征表型：細(xì)胞內(nèi)Fe²⁺含量和脂質(zhì)過(guò)氧化物之間的關(guān)系。通過(guò)檢測(cè)過(guò)表達(dá)SOCS2的HCC細(xì)胞中脂氟的相對(duì)熒光強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)SOCS2的增加促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)脂質(zhì)過(guò)氧化物在HCC細(xì)胞中的積累，在IR后更為明顯（圖4E，F(xiàn)）。廣泛而言，SOCS2抑制GPX4和SLC7A11的表達(dá)，并誘導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化物和Fe²⁺的積累，促進(jìn)鐵死亡。

圖4 SOCS2促進(jìn)肝癌細(xì)胞鐵死亡

5、SOCS2通過(guò)泛素化降解SLC7A11
       為研究SOCS2如何介導(dǎo)鐵濃縮從而調(diào)節(jié)HCC放射敏感性，通過(guò)免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)SOCS2的熒光密度與SLC7A11相反，表明SOCS2與SLC7A11呈負(fù)相關(guān)（圖5A）。接著通過(guò)Co-IP證明SLC7A11與SOCS2相互作用（圖5B，C）。為了解這種相互作用的功能后果，作者想知道SOCS2是否可以負(fù)調(diào)節(jié)SLC7A11的表達(dá)或誘導(dǎo)其降解。WB檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在SOCS2過(guò)表達(dá)后，SLC7A11的穩(wěn)態(tài)水平顯著降低，并且SLC7A11的半衰期大大縮短（圖5D，E）。說(shuō)明SOCS2通過(guò)蛋白質(zhì)方面而不是轉(zhuǎn)錄方面促進(jìn)SLC7A11的降解。

圖5 SOCS2與 SLC7A11相互作用，并通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑降低其水平

       接下來(lái)，為深入研究SLC7A11降解的機(jī)制，作者在HCC細(xì)胞中加入蛋白酶體抑制劑（MG-132）和溶酶體抑制劑（亮肽蛋白）。盡管高表達(dá)的SOCS2可以降低SLC7A11的蛋白質(zhì)水平，但是這種下調(diào)通過(guò)MG-132的處理被逆轉(zhuǎn)，而亮肽蛋白不能逆轉(zhuǎn)（圖5F，G），表明SOCS2誘導(dǎo)的SLC7A11下降依賴于蛋白酶體途徑而非溶酶體途徑。
       由于SOCS2作為一種E3泛素連接酶，作者推測(cè)SLC7A11可能被SOCS2特異性識(shí)別并經(jīng)歷泛素化降解。WB分析顯示SK-hep-1細(xì)胞中的泛素化SLC7A11水平顯著高于HepG2細(xì)胞（圖5H）。此外，在過(guò)表達(dá)SOCS2的HCC細(xì)胞中，SLC7A11表達(dá)量顯著降低，并且SLC7A11泛素化水平更高（圖5I）。
6、SOCS2的SH2結(jié)構(gòu)域與SLC7A11的N-末端結(jié)構(gòu)域相互作用促進(jìn)放射增敏
       為闡明SOCS2和SLC7A11之間的相互作用區(qū)域，作者將SOCS2分為三個(gè)結(jié)構(gòu)域：NTD，SH2-結(jié)構(gòu)和CTD，構(gòu)建C-末端具有3×Flag標(biāo)簽的三個(gè)截短質(zhì)粒（質(zhì)粒A，B，C）和完整SOCS2序列的野生型（WT）質(zhì)粒，并將這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HCC細(xì)胞中（圖6A）。Co-IP分析顯示只有WT和B（SH2截短）的通道表現(xiàn)出SLC7A11條帶，表明SLC7A11與SOCS2的SH2結(jié)構(gòu)域相互作用（圖6B）。隨后，為研究SOCS2-SH2結(jié)構(gòu)域?qū)Ψ核鼗降挠绊?，作者通過(guò)從SOCS2全序列中刪除SH2結(jié)構(gòu)域來(lái)產(chǎn)生SOCS2-ΔSH2質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)SOCS2-ΔSH2突變體不能增加SLC7A11的泛素化水平，而SOCS2-WT質(zhì)粒顯著增加SLC7A11的泛素化水平（圖6C）。因此，SOCS2通過(guò)SOCS2的SH2結(jié)構(gòu)域誘導(dǎo)SLC7A11泛素化。
       此外，為鑒定與SOCS2相互作用的SLC7A11的結(jié)構(gòu)域，作者還基于SLC7A11的結(jié)構(gòu)域建立三個(gè)截?cái)噘|(zhì)粒A，B，C（圖6D），發(fā)現(xiàn)SOCS2與SLC7A11的NTD相互作用（圖6E）。與SOCS2-ΔSH2質(zhì)粒的構(gòu)建一致，作者還構(gòu)建無(wú)N-末端的SLC7A11-ΔNTD突變質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)Flag-ΔNTD的泛素化水平檢測(cè)不到，而WT組中仍存在高水平的泛素化Flag-SLC7A11（圖6F）。表明SLC7A11-NTD與SOCS2相互作用并因此介導(dǎo)其自身的泛素化。此外，將SOCS2-ΔSH2或SOCS2-WT質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HCC細(xì)胞后觀察IR后存活數(shù)，發(fā)現(xiàn)SOCS2-ΔSH2組的存活數(shù)與其陰性對(duì)照相比沒(méi)有顯著差異，但顯著高于SOCS2-WT組（圖6G，H），這意味著SOCS2由于其SH2結(jié)構(gòu)域在HCC細(xì)胞中發(fā)揮放射增敏作用。

圖6 SOCS2-SH2結(jié)構(gòu)域與SLC7A11的N-末端結(jié)構(gòu)域相互作用以降低輻射抗性

7、SOCS2促進(jìn)SLC7A11的K48相關(guān)多聚泛素化并結(jié)合伸長(zhǎng)蛋白B/C
       確定SOCS2-SH2能通過(guò)識(shí)別SLC7A11-NTD介導(dǎo)SLC7A11泛素化后，作者想知道SLC7A11中發(fā)生的多聚泛素化的類型。到目前為止，K48和K63連接的鏈已被報(bào)道為最豐富和功能表征良好的多泛素鏈。為確定其中哪些存在于多泛素化的SLC7A11中，構(gòu)建SLC7A11的K48R和K63R泛素突變體，泛素化測(cè)定K48R突變體泛素化積累減少，而K63R突變體泛素化積累不變（圖7A），這意味著SLC7A11多泛素化主要以K48連接的泛素鏈而不是K63連接的形式產(chǎn)生。值得注意的是，K48R突變降低SLC7A11多聚泛素化的水平，但沒(méi)有完全降低，暗示其他連鎖類型也可能有助于這種多聚泛素化。

圖7 SOCS2通過(guò)延伸蛋白B/C泛素復(fù)合物介導(dǎo)K48連接的多聚泛素化鏈到SLC7A11上

       如前所述，SOCS1和SOCS6通常通過(guò)SOCS-BOX區(qū)域與伸長(zhǎng)蛋白B/C結(jié)合以組裝成E3泛素連接酶復(fù)合物介導(dǎo)泛素化，所以作者探究HCC細(xì)胞中SOCS2介導(dǎo)的SLC7A11泛素化是否也需要伸長(zhǎng)蛋白B/C的參與。WB檢測(cè)顯示在HCC細(xì)胞中敲低伸長(zhǎng)蛋白B/C不影響SOCS2表達(dá)，但是SLC7A11表達(dá)量升高（圖7B），表明延伸蛋白B/C復(fù)合物是SOCS2介導(dǎo)的SLC7A11的泛素化降解所必需的。
       接下來(lái)研究SOCS2與伸長(zhǎng)蛋白B/C復(fù)合物相互作用的氨基酸位點(diǎn)。通過(guò)比較不同物種SOCS1、SOCS2、SOCS6和SAB15蛋白SOCS2-BOX區(qū)的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)只有Leu和Cys在不同的序列中保守（圖7C）。因此，作者假設(shè)Leu和Cys可能是SOCS2與伸長(zhǎng)蛋白B/C相互作用的靶位點(diǎn)。為驗(yàn)證這一猜想，該研究構(gòu)建SOCS2突變質(zhì)粒（SOCS2^LC→PP），其中SOCS2的Leu 162（L162）和Cys 166（C166）突變?yōu)镻ro，SOCS2^WT質(zhì)粒作為對(duì)照（圖7D）。Co-IP顯示SOCS2^WT可以與SLC7A11，伸長(zhǎng)蛋白B和伸長(zhǎng)蛋白C分別互作，而SOCS2^LC→PP僅與SLC7A11互作，不與伸長(zhǎng)蛋白B和伸長(zhǎng)蛋白C互作（圖7E）。此外，SOCS2^LC→PP也導(dǎo)致SLC7A11泛素化降低（圖7F），意味著伸長(zhǎng)蛋白B/C在L162和C166位點(diǎn)與SOCS2互作以形成SOCS2/伸長(zhǎng)蛋白B/C復(fù)合物，從而共同促進(jìn)SLC7A11的泛素化降解。
       總而言之，本研究詳細(xì)研究SOCS2介導(dǎo)的HCC放射增敏促進(jìn)鐵死亡的過(guò)程。IR增加SOCS2表達(dá)，導(dǎo)致SLC7A11的減少，隨后SOCS2-SH2與SLC7A11-NTD特異性識(shí)別，通過(guò)SOCS2的L162和C166位點(diǎn)與伸長(zhǎng)蛋白B/C結(jié)合，并與E2泛素結(jié)合酶連接，誘導(dǎo)多聚泛素化（圖8A，B）。最終，具有泛素鏈的SLC7A11被26S蛋白酶體識(shí)別并分解成蛋白質(zhì)片段（圖8C）用于降解，這最終有助于HCC鐵死亡和放射增敏的發(fā)生。

圖8 增量SOCS2促進(jìn)SLC7A11的泛素化降解，誘導(dǎo)HCC的鐵死亡和放射增敏作用

實(shí)驗(yàn)方法
RNA-seq和測(cè)序分析，小鼠異種植腫瘤模型，免疫熒光（IF）檢測(cè)，免疫組織化學(xué)（IHC）檢測(cè)，WB，細(xì)胞內(nèi)Fe²⁺的含量測(cè)定，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的測(cè)量，qRT-PCR，小干擾RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，Co-IP，泛素化測(cè)定
參考文獻(xiàn)
Chen Q, Zheng W, Guan J, Liu H, Dan Y, Zhu L, Song Y, Zhou Y, Zhao X, Zhang Y, Bai Y, Pan Y, Zhang J, Shao C. SOCS2-enhanced ubiquitination of SLC7A11 promotes ferroptosis and radiosensitization in hepatocellular carcinoma. Cell Death Differ. 2023 Jan;30（1）:137-151. doi: 10.1038/s41418-022-01051-7.

??