高分腫瘤文章的剖析——計(jì)算模擬+單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)+機(jī)制
膠質(zhì)母細(xì)胞瘤在其早期階段的進(jìn)展仍然知之甚少。本研究中，作者在小鼠大腦中轉(zhuǎn)移PDGFB和genetic barcodes，以啟動(dòng)膠質(zhì)瘤發(fā)生，并能夠從最早的階段直接追蹤膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的進(jìn)化。出乎意料的是，作者觀察到克隆消亡事件的高發(fā)生率和克隆大小的漸進(jìn)性分化，甚至在惡性表型獲得后也是如此。計(jì)算模擬表明這些動(dòng)力學(xué)是基于克隆的細(xì)胞-細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果。通過批量和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析，結(jié)合譜系追蹤，作者揭示了Myc轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)與克隆大小不平衡的相關(guān)性最強(qiáng)。此外，作者還證明了下調(diào)Myc的表達(dá)足以驅(qū)動(dòng)顱內(nèi)移植膠質(zhì)瘤中的競(jìng)爭(zhēng)動(dòng)力學(xué)。作者的研究結(jié)果提供了使用傳統(tǒng)回顧性方法無法獲得的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤進(jìn)化的見解，突出了在該領(lǐng)域結(jié)合克隆追蹤和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析的潛力。本研究于2023年8月于《Cancer Cell》上發(fā)表，IF=50.3。
圖形摘要
技術(shù)路線
主要研究?jī)?nèi)容
1、膠質(zhì)瘤誘導(dǎo)barcode library的驗(yàn)證
為在體內(nèi)誘導(dǎo)腫瘤啟動(dòng)的基因組病變，同時(shí)對(duì)每個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞進(jìn)行特異標(biāo)記，作者生成了一個(gè)致癌逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的barcoded library。文庫中的每個(gè)載體包含：（i）一個(gè)獨(dú)特的genetic barcode，（ii）作為報(bào)告基因的GFP，（iii）PDGFB致癌基因（圖1）。作者將barcode設(shè)計(jì)為BH模式（一個(gè)non-A核苷酸后面接一個(gè)non-G核苷酸）的11次重復(fù)，最大理論復(fù)雜度為322（每個(gè)位置上可能的核苷酸數(shù)目上升到該位置上的數(shù)目），對(duì)應(yīng)約3×1010形式。通過在低感染復(fù)數(shù)（0.01 MOI）下轉(zhuǎn)導(dǎo)5個(gè)獨(dú)立的NIH3T3細(xì)胞培養(yǎng)來測(cè)試所獲得的逆轉(zhuǎn)錄病毒文庫的有效復(fù)雜性和barcode分布的均勻性。隨后通過靶向NGS獲得的barcode組成分析顯示，其分布沒有重大偏差（圖1B，C）。庫（即，庫中功能向量中不同barcode的數(shù)量）的有效復(fù)雜度為（3±0.15）×104。同時(shí)，作者通過處理包含已知比例的兩個(gè)不同barcode克隆的細(xì)胞的不同樣本，驗(yàn)證了作者的barcode檢索、測(cè)序和定量的方法。這項(xiàng)分析表明，即使在代表總樣本的10-4倍時(shí)，barcode也可以被一致檢索和量化。
研究將逆轉(zhuǎn)錄病毒文庫注射到E14小鼠胚胎的端腦囊泡中。正如已經(jīng)報(bào)道的那樣，29個(gè)PDGFB的過表達(dá)在成年期早期總是導(dǎo)致膠質(zhì)瘤的發(fā)展（圖1D）。隨著時(shí)間的推移，GFP表達(dá)標(biāo)記的膠質(zhì)瘤的總體質(zhì)量（即GFP陽性細(xì)胞總數(shù)）增加（圖1E）。在早期出現(xiàn)癥狀的小鼠中，膠質(zhì)瘤表現(xiàn)為小而彌漫的多灶性腫塊，類似于低級(jí)別腫瘤，而在后期出現(xiàn)癥狀的小鼠中，腫塊表現(xiàn)為更大和更密集的（圖1F-J）。這些數(shù)據(jù)與作者先前的觀察結(jié)果一致，即隨著時(shí)間的推移，膠質(zhì)瘤從低級(jí)別進(jìn)展到高級(jí)別，并伴隨著惡性程度的增加。
圖1 barcode矢量的構(gòu)建和驗(yàn)證
2、PDGFB誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤的克隆動(dòng)力學(xué)
在注射（n=7）后第4天，從胚胎中提取DNA來估計(jì)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的數(shù)量。每個(gè)胚的barcode編號(hào)為（16±4）x 103。重要的是，在每個(gè)胚胎中，單個(gè)barcode的相對(duì)豐度是均一的，沒有過度代表的barcode，Gini不平等指數(shù)為0.51±0.02。該值與原始質(zhì)粒文庫（0.57 ± 0.01）非常接近。隨后，對(duì)38只小鼠（16窩）在不同時(shí)間表現(xiàn)出神經(jīng)癥狀的腫瘤塊提取DNA進(jìn)行相同的分析。該分析顯示，發(fā)育過程中，在出生后151至342天的3只小鼠的主要克隆的數(shù)量急劇減少，從33日齡小鼠中的最多495個(gè)克隆到單個(gè)克?。▓D2A，C）。克隆數(shù)目的減少一方面與腫瘤質(zhì)量和細(xì)胞數(shù)量的增加相呼應(yīng)（圖1E-J），另一方面與它們相對(duì)分布的不平衡相呼應(yīng)，如Shannon-Wiener熵指數(shù)（簡(jiǎn)稱Shannon熵）所示，該指數(shù)隨時(shí)間呈指數(shù)下降趨向于0（圖2B）。這幅圖表明，隨著時(shí)間的推移，以犧牲其他克隆為代價(jià)而逐步占優(yōu)勢(shì)的原始克隆的子集的選擇性擴(kuò)張。
對(duì)這一現(xiàn)象的一個(gè)可能的解釋是少數(shù)細(xì)胞成功地克服了biological gate的發(fā)生，表現(xiàn)為在向完全惡性腫瘤進(jìn)展過程中的克隆多樣性瓶頸。基于這一假設(shè)，晚期發(fā)病的膠質(zhì)瘤，很可能已經(jīng)通過了這一biological gate，如果移植到成年小鼠的大腦中，不應(yīng)該面臨強(qiáng)大的克隆瓶頸。作者通過將5個(gè)遲發(fā)性膠質(zhì)瘤（> 150天）的急性分離細(xì)胞移植到同系小鼠（每只膠質(zhì)瘤至少2只小鼠）中，并比較原發(fā)性和繼發(fā)性膠質(zhì)瘤的克隆組成，驗(yàn)證了這一假設(shè)。移植動(dòng)物在27 ~ 45天之間出現(xiàn)繼發(fā)性膠質(zhì)瘤。隨后的克隆分析顯示，其中2例移植的膠質(zhì)瘤是單克隆性的，因此，它們的繼發(fā)性腫瘤也是單克隆性的。另外3例移植瘤分別由2、3和5個(gè)克隆組成，但值得注意的是，每個(gè)克隆均產(chǎn)生單克隆繼發(fā)性腫瘤（圖2D）。盡管每個(gè)克隆的移植細(xì)胞數(shù)量（只有一個(gè)例外）遠(yuǎn)高于產(chǎn)生繼發(fā)性腫瘤所需的最小數(shù)量，但這種完全的純化還是發(fā)生了（圖2E）。這表明，盡管有前期的進(jìn)展，腫瘤細(xì)胞仍處于強(qiáng)烈的選擇性壓力之下。然而，這一結(jié)果可能受到親本無性系相對(duì)大小的強(qiáng)烈不平等的影響。為了解這種可能的限制，更好地理解在完全進(jìn)展的腫瘤中正在進(jìn)行的選擇，作者決定用只攜帶GFP和genetic barcodes的逆轉(zhuǎn)錄病毒庫標(biāo)記完全進(jìn)展的膠質(zhì)瘤細(xì)胞后進(jìn)行類似的移植實(shí)驗(yàn)。作者使用了PDGFB誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘤（CSC-204D39）的原代培養(yǎng)，已知當(dāng)原位移植到同系小鼠（穿透率> 97 %，n = 64）時(shí)，通常會(huì)產(chǎn)生繼發(fā)性腫瘤。將文庫轉(zhuǎn)染的細(xì)胞移植到成年小鼠（n = 4）的大腦中，當(dāng)小鼠出現(xiàn)神經(jīng)癥狀時(shí)收集二次腫瘤。對(duì)移植前的細(xì)胞和來自二次腫瘤塊的細(xì)胞進(jìn)行barcode測(cè)序。有趣的是，腫瘤的二次生長(zhǎng)伴隨著barcode數(shù)量的急劇減少，barcode數(shù)量從（1.19 ± 0.05）× 104減少到1（n = 4，圖2D），這表明即使在進(jìn)展的膠質(zhì)瘤中也發(fā)生了類似于在膠質(zhì)瘤進(jìn)展過程中觀察到的瓶頸。這一結(jié)果強(qiáng)烈表明，至少一些負(fù)責(zé)克隆減少的機(jī)制可能在獲得完全惡性腫瘤后仍在運(yùn)作，指出存在進(jìn)一步的腫瘤內(nèi)選擇來源。
圖2 原發(fā)性和繼發(fā)性膠質(zhì)瘤的克隆組成動(dòng)態(tài)
3、膠質(zhì)瘤如何失去克隆異質(zhì)性?
在作者的膠質(zhì)瘤發(fā)生模型中觀察到的克隆減少，理論上可以歸因于幾種不同的非互斥機(jī)制：（i）高比率細(xì)胞死亡（或細(xì)胞周期撤退）導(dǎo)致的統(tǒng)計(jì)漂移。細(xì)胞死亡或靜息可以隨機(jī)驅(qū)動(dòng)克隆不平衡，從而降低克隆異質(zhì)性。（ii）細(xì)胞周期長(zhǎng)度的克隆差異。如果克隆顯示不同的細(xì)胞周期長(zhǎng)度，較快克隆的大小將以指數(shù)方式偏離較慢克隆的大小，它們最終將在腫瘤團(tuán)塊中占優(yōu)勢(shì)，使其他克隆過度生長(zhǎng)，并減少明顯的異質(zhì)性。（iii）基于克隆身份的細(xì)胞-細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)。在器官發(fā)育和腫瘤發(fā)生過程中，特定基因產(chǎn)物表達(dá)或活性的遺傳性（即，克隆性）差異會(huì)引發(fā)相鄰細(xì)胞之間的競(jìng)爭(zhēng)，為克隆選擇提供基礎(chǔ)。為研究這些機(jī)制對(duì)克隆多樣性減少的可能影響，作者進(jìn)行了Monte Carlo simulations，其中相關(guān)參數(shù)可以單獨(dú)操縱，以探索它們?cè)谒茉炜寺?dòng)態(tài)中的作用。在作者的模擬中，一個(gè)“virtual tumor cells”的起始集在一個(gè)簡(jiǎn)化的膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)模型上，該模型是由在體外或體內(nèi)進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)措施所產(chǎn)生的現(xiàn)實(shí)值。作者開始使用這個(gè)框架來檢驗(yàn)細(xì)胞死亡對(duì)克隆多樣性降低的影響。首先，作者考慮了一個(gè)極限場(chǎng)景，其中所有細(xì)胞的周期設(shè)置為體外測(cè)得的平均長(zhǎng)度（22 h），并且在整個(gè)模擬過程中細(xì)胞死亡概率（pCD）是恒定的。這里作者注意到，當(dāng)pCD達(dá)到一定值時(shí)，細(xì)胞死亡克服增殖，模擬種群數(shù)量減少，最終消失。超過180天，pCD的最高值仍然與腫瘤生長(zhǎng)（即每小時(shí)約有3 %的死亡細(xì)胞）相容，導(dǎo)致克隆多樣性從10000個(gè)下降到580個(gè)克隆（圖3A）。與體內(nèi)（大約4個(gè)數(shù)量級(jí)）相比，這種降低小于1.5個(gè)數(shù)量級(jí)，幾乎可以忽略不計(jì)。此外，這種細(xì)胞死亡率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于TUNEL分析所觀察到的結(jié)果，在體內(nèi)中，死亡細(xì)胞的比例不到0.01 %（圖3B）。作者隨后引入了一個(gè)不同的細(xì)胞死亡模型來考慮腫瘤負(fù)荷的影響。因此，細(xì)胞死亡的概率被建模為腫瘤細(xì)胞總數(shù)的邏輯函數(shù)。作者通過探索nCell50參數(shù)來研究不同腫瘤負(fù)荷強(qiáng)度的影響。該參數(shù)對(duì)應(yīng)于負(fù)責(zé)一半腫瘤負(fù)荷效應(yīng)的細(xì)胞數(shù)（即Logistic曲線的拐點(diǎn)）。即使在這種情況下，細(xì)胞死亡要么太明顯，不允許腫瘤生長(zhǎng)，要么太輕微，不能重復(fù)實(shí)驗(yàn)觀察到的克隆多樣性減少的程度（圖3C）。同樣，在這種情況下，可檢測(cè)到的克隆減少（每小時(shí)約有3.2%的死亡細(xì)胞）所對(duì)應(yīng)的細(xì)胞死亡凈百分比與作者的TUNEL分析結(jié)果不一致。上述結(jié)果排除了在膠質(zhì)瘤發(fā)生過程中高細(xì)胞死亡率可以自行解釋觀察到的克隆動(dòng)態(tài)的可能性。
圖3 膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的計(jì)算分析
4、局部細(xì)胞密度和細(xì)胞周期長(zhǎng)度波動(dòng)
接下來，作者增加了模型的復(fù)雜性，包括細(xì)胞周期長(zhǎng)度的克隆差異。作者從理論上的極端假設(shè)出發(fā)，即每個(gè)子細(xì)胞從其母細(xì)胞繼承一個(gè)固定的、未被修飾的細(xì)胞周期長(zhǎng)度。在此假設(shè)下，通過初始化由視頻延時(shí)顯微鏡測(cè)量的細(xì)胞周期長(zhǎng)度分布的原始群體，模擬結(jié)果產(chǎn)生了與作者在體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不兼容的圖片。更快的循環(huán)細(xì)胞的選擇性擴(kuò)張導(dǎo)致了中位細(xì)胞周期長(zhǎng)度隨時(shí)間的下降，下降到約14 h，這比實(shí)驗(yàn)觀察到的明顯縮短（圖3D）。盡管這種不切實(shí)際的行為，但在160個(gè)模擬日中，克隆的數(shù)量從10,000個(gè)變化到約200，比作者所觀察到的減少得更少。更真實(shí)的模擬包括細(xì)胞分裂后細(xì)胞周期長(zhǎng)度的變化。在這種范例中，細(xì)胞繼承其父代的細(xì)胞周期長(zhǎng)度，加上一個(gè)正態(tài)分布的隨機(jī)值。這種模擬結(jié)果使細(xì)胞周期長(zhǎng)度的分布更接近實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)（圖3D）。在此條件下，同樣地，雖然幾個(gè)生物學(xué)參數(shù)正確地再現(xiàn)了（如總體腫瘤生長(zhǎng)率，細(xì)胞周期長(zhǎng)度和腫瘤體積的分布），但在160個(gè)模擬日中，克隆數(shù)量從10000個(gè)下降到約665個(gè)（圖3E）。再次，該結(jié)果與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不符。因此，克隆多樣性降低似乎不太可能僅僅是由于細(xì)胞周期長(zhǎng)度差異造成的。
5、細(xì)胞與細(xì)胞之間的競(jìng)爭(zhēng)
最后，作者在上述模型中加入了基于克隆身份的細(xì)胞-細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)的貢獻(xiàn)。通過區(qū)分同胞（同一克?。┖蜔o關(guān)（不同的克?。┘?xì)胞，每個(gè)細(xì)胞的適合度受到其鄰近細(xì)胞的影響，這取決于它們各自的克隆身份。特別地，作者建模了一個(gè)場(chǎng)景，對(duì)于任意給定的細(xì)胞，不相關(guān)的鄰居比兄弟姐妹對(duì)細(xì)胞死亡概率的影響更大。在這個(gè)模擬中，作者獲得了從10000到108的減少，值得注意的是，其中只有17 ± 1占總?cè)丝诘?5 %，Shannon熵為2.5 ± 0.1。此外，由于超級(jí)競(jìng)爭(zhēng)者克隆的出現(xiàn)，克隆大小呈現(xiàn)多峰分布（圖3F）。值得注意的是，觸發(fā)局部克隆競(jìng)爭(zhēng)并不影響細(xì)胞周期長(zhǎng)度分布（圖3G），并導(dǎo)致模擬的腫瘤腫塊具有與實(shí)際體內(nèi)腫瘤大體相似的大小和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，顯示出密集的分葉被幾乎無瘤的區(qū)域（圖3H，I）隔開。沒有其他經(jīng)過檢驗(yàn)的假設(shè)導(dǎo)致如此明顯的克隆不平衡和多樣性減少。
6、進(jìn)展中的腫瘤細(xì)胞動(dòng)力學(xué)（如何競(jìng)爭(zhēng)）
為深入了解細(xì)胞-細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)的可能機(jī)制，作者對(duì)PDGFB誘導(dǎo)的不同時(shí)間收獲的膠質(zhì)瘤進(jìn)行了RNA測(cè)序（RNA sequencing, RNA-seq）分析，（n = 4只小鼠，出生后39天）之前或神經(jīng)癥狀發(fā)作時(shí)（n = 7只小鼠,出生后40 ~ 176天）。由于該barcode序列在結(jié)構(gòu)上與高表達(dá)的PDGFB-IRES-GFP轉(zhuǎn)錄本相連，因此可以通過RNA-seq分析高效檢索。這使得作者可以直接估計(jì)每個(gè)腫瘤的Shannon熵，并將其與性狀相關(guān)基因（trait-associated gene，TAG）分析中的基因表達(dá)相關(guān)聯(lián)。然后使用TAG衍生的排序來驅(qū)動(dòng)基因集富集分析（GSEA），在Hallmark基因集上進(jìn)行，克隆復(fù)雜性的降低與Myc信號(hào)直接相關(guān)（Myc Targets V1和E2F靶點(diǎn)緊隨Myc靶點(diǎn)V2，p < 10-5，圖4B，C）。這個(gè)結(jié)果是非常有意義的，因?yàn)镸yc信號(hào)傳導(dǎo)是涉及細(xì)胞-細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)的少數(shù)已描述的機(jī)制之一。Myc表達(dá)本身是超級(jí)競(jìng)爭(zhēng)者克隆的特征，與Shannon熵顯著負(fù)相關(guān)，這表明Myc作為克隆丟失（Pearson相關(guān)性: 0.85，p < 0.001，圖4D）的驅(qū)動(dòng)因子的潛在作用。作者推測(cè)，Myc水平的升高可能是由于對(duì)表達(dá)較高水平Myc的細(xì)胞進(jìn)行選擇，從而逐漸富集的結(jié)果。然而，考慮到在完全進(jìn)展的腫瘤中也有在單個(gè)克隆中持續(xù)選擇的跡象（圖2D），作者想知道即使完全純化，單克隆腫瘤是否會(huì)在細(xì)胞水平上保持異質(zhì)性的Myc表達(dá)。為解決這個(gè)問題，作者分離了兩個(gè)單克隆腫瘤，并通過基線稀釋克隆分離亞克隆培養(yǎng)物。然后，作者量化了每個(gè)腫瘤10個(gè)亞克隆的Myc表達(dá)，并將差異與親代培養(yǎng)中觀察到的波動(dòng)進(jìn)行了比較。在這兩種腫瘤中，作者觀察到亞克隆培養(yǎng)物中Myc表達(dá)的異質(zhì)性高于親代腫瘤（圖4E）。作者利用RNA-seq數(shù)據(jù)佐證了這一證據(jù)，以提示在膠質(zhì)瘤進(jìn)展過程中克隆內(nèi)異質(zhì)性的維持。在膠質(zhì)瘤進(jìn)展的早期階段（PDGFB轉(zhuǎn)導(dǎo)后小于45天）中，大多數(shù)可檢測(cè)到的突變并不是在所有的膠質(zhì)瘤細(xì)胞（等位基因頻率中位數(shù)= 0.20）中共享的。在后期，出現(xiàn)了一組廣泛的突變（等位基因頻率中位數(shù)= 0.93），可能是某些克隆擴(kuò)張的跡象，與作者之前的數(shù)據(jù)一致。盡管如此，低頻突變?nèi)匀皇墙^大多數(shù)，這表明基因組變異在擴(kuò)大的克隆中不斷涌現(xiàn)（圖4F）。
圖4 與進(jìn)展性膠質(zhì)瘤bulk RNA-seq相關(guān)的克隆分析
7、膠質(zhì)瘤的早期克隆分化
為對(duì)克隆間競(jìng)爭(zhēng)的潛在驅(qū)動(dòng)因素進(jìn)行更高分辨率的搜索，作者對(duì)膠質(zhì)瘤進(jìn)行了單細(xì)胞RNA-seq（sc RNA-seq）分析，重點(diǎn)關(guān)注可能存在許多不同克隆且其大小開始發(fā)散的階段。根據(jù)作者之前的分析，這對(duì)應(yīng)于出生后大約40天（圖2A）。分離3個(gè)獨(dú)立的PDGFB誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞，通過熒光激活細(xì)胞分選分離出GFP陽性的細(xì)胞組分，并用Chromium 10X進(jìn)行單細(xì)胞分選。同時(shí)，通過對(duì)barcode區(qū)域的靶向DNA測(cè)序，分析了分離細(xì)胞的代表性部分（5 %）。后一種分析使作者能夠確定每個(gè)barcode克隆的大小。然后，在scRNA-seq數(shù)據(jù)中搜索本分析中發(fā)現(xiàn)的barcode，將細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組圖譜與克隆信息聯(lián)系起來，并將其與屬于的克隆的大小和身份聯(lián)系起來（圖5A-5C）。數(shù)據(jù)顯示，克隆通常由屬于不同轉(zhuǎn)錄簇的細(xì)胞組成（圖5D）。值得注意的是，在GSEA分析中，當(dāng)比較屬于小克?。▎蝹€(gè)細(xì)胞占腫瘤質(zhì)量的30%以下，累計(jì)約占測(cè)序細(xì)胞總數(shù)的二分之一）的細(xì)胞和屬于大克隆（分別代表至少30 %的腫瘤塊，并累積組成另一半測(cè)序細(xì)胞）的細(xì)胞時(shí)，最富集的基因簽名是Myc信號(hào)和相關(guān)的E2F-靶標(biāo)，再次是（p < 10-4，見圖5E、F）。這增加了Myc-E2F軸在控制克隆大小方面的作用的證據(jù)，并指出其在膠質(zhì)瘤發(fā)生過程中塑造細(xì)胞-細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)動(dòng)力學(xué)的重要性。進(jìn)一步分析顯示，不同大小克隆的細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)的PDGFB轉(zhuǎn)基因表達(dá)沒有差異，而大克隆的細(xì)胞中Myc表達(dá)有較高的趨勢(shì)（圖5G）。
圖5 早期膠質(zhì)瘤的單細(xì)胞RNA-seq分析
8、膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Myc介導(dǎo)的競(jìng)爭(zhēng)
然后，作者從功能上評(píng)估了Myc表達(dá)水平在基于克隆的競(jìng)爭(zhēng)中的作用。作者使用CSC-204D細(xì)胞，即PDGFB驅(qū)動(dòng)的膠質(zhì)瘤原代培養(yǎng)細(xì)胞，用于圖2D所示的實(shí)驗(yàn)。作者通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)兩種不同的攜帶GFP的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和一種旨在抑制Myc表達(dá)的人工miRNA（amiRNA）來構(gòu)建CSC-204D細(xì)胞。作者通過qPCR驗(yàn)證了兩種不同的anti-Myc amiRNAs（miRMyc16和miRMyc19）介導(dǎo)的敲低，分別降低到原來的52 ± 4%和61 ± 6%（圖6A）。這種調(diào)節(jié)水平與作者在原代膠質(zhì)瘤細(xì)胞中觀察到的情況非常相似（圖4D）。隨后，作者通過MTT實(shí)驗(yàn)比較了Myc敲低（Myc-knockdown，Myc-KD）細(xì)胞和轉(zhuǎn)染scramble miRNA的細(xì)胞的體外生長(zhǎng)速率，培養(yǎng)物的復(fù)制時(shí)間無明顯變化（圖6B，C）。作者進(jìn)行了移植實(shí)驗(yàn)以測(cè)試Myc-KD膠質(zhì)瘤細(xì)胞單獨(dú)移植或與Myc野生型（Myc-wt）細(xì)胞混合移植時(shí)的行為。特別地，作者設(shè)計(jì)了兩個(gè)互補(bǔ)的實(shí)驗(yàn)來推斷Myc在膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)和克隆動(dòng)力學(xué)中的作用：在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中（實(shí)驗(yàn)1），作者將Myc-KD細(xì)胞（用RFP和GFP標(biāo)記）單獨(dú)原位移植到小鼠大腦中，并檢查它們是否可以作為它們的親本群體產(chǎn)生繼發(fā)性膠質(zhì)瘤。在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)（實(shí)驗(yàn)2）中，作者原位移植相同數(shù)量的Myc-KD細(xì)胞與等數(shù)量的Myc-wt細(xì)胞（僅用RFP標(biāo)記）混合，檢測(cè)這兩個(gè)亞群是否可以共同生長(zhǎng)，或者M(jìn)yc-KD細(xì)胞在繼發(fā)性膠質(zhì)瘤中是否會(huì)被淘汰。作者推斷，實(shí)驗(yàn)1中膠質(zhì)瘤的發(fā)展，以及實(shí)驗(yàn)2中Myc-wt細(xì)胞的純化趨勢(shì)，表明Myc在膠質(zhì)瘤進(jìn)展過程中發(fā)揮了驅(qū)動(dòng)競(jìng)爭(zhēng)的作用（圖6D）。事實(shí)上，實(shí)驗(yàn)1中所有移植的小鼠都發(fā)生了繼發(fā)性膠質(zhì)瘤（7/7）。值得注意的是，膠質(zhì)瘤的發(fā)生時(shí)間與實(shí)驗(yàn)2相同，Myc-KD和Myc-wt膠質(zhì)瘤細(xì)胞在體內(nèi)的成瘤能力和生長(zhǎng)速度沒有差異（圖6E-6G和6J）。在實(shí)驗(yàn)2中，所有的移植小鼠（7/7）都發(fā)生了繼發(fā)性膠質(zhì)瘤，并且Myc-wt細(xì)胞被高度純化。幾乎沒有Myc-KD細(xì)胞（RFP和GFP雙標(biāo)記）被發(fā)現(xiàn)（圖6H-K）。在作者使用相同細(xì)胞進(jìn)行的體外實(shí)驗(yàn)中也得到了類似的結(jié)果。作者將Myc-KD（或scrambled miRNA control）細(xì)胞和Myc-wt細(xì)胞以1：1的比例混合在U型多孔板中形成球體。然后作者在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)監(jiān)測(cè)他們的生長(zhǎng)情況。
Myc-KD細(xì)胞被Myc-wt細(xì)胞取代的比率顯著高于對(duì)照膠質(zhì)瘤細(xì)胞（圖6L-N）。總之，這些結(jié)果證實(shí)了作者提出的Myc在膠質(zhì)瘤發(fā)生過程中驅(qū)動(dòng)基于克隆的競(jìng)爭(zhēng)的作用。
圖6 Myc modulation驅(qū)動(dòng)膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的競(jìng)爭(zhēng)動(dòng)態(tài)
實(shí)驗(yàn)方法
C57BL/6J小鼠，膠質(zhì)瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)，膠質(zhì)瘤細(xì)胞的極限稀釋克隆，膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Myc下調(diào)，免疫染色和TUNEL試驗(yàn)，定量PCR，逆轉(zhuǎn)錄病毒barcoding libraries production，Barcode sequencing，Bulk RNA sequencing，scRNA-seq，基因表達(dá)分析，基因組變異分析
參考文獻(xiàn)
Ceresa D, Alessandrini F, Lucchini S, Marubbi D, Piaggio F, Mena Vera JM, Ceccherini I, Reverberi D, Appolloni I, Malatesta P. Early clonal extinction in glioblastoma progression revealed by genetic barcoding. Cancer Cell. 2023 Aug 14;41（8）:1466-1479.e9. doi: 10.1016/j.ccell.2023.07.001. Epub 2023 Aug 3. PMID: 37541243.